響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥醋醋酸發(fā)酵工藝的研究

祁宏山，王治業(yè)，彭軼楠，梁 燕，季 彬*

（1.甘肅省科學(xué)院 生物研究所，甘肅 蘭州 730099；2.甘肅省微生物資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730099）

蕎麥（Fagopyrum esculentumMoench）的碳水化合物主要是淀粉[1-4]，因?yàn)槠漕w粒較細(xì)小，所以和其他谷類相比，具有容易煮熟、容易消化、容易加工的特點(diǎn)[5-6]。蕎麥含有豐富的膳食纖維，可以促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，對(duì)于預(yù)防便秘有很好的作用[7-8]。蕎麥不僅營(yíng)養(yǎng)全面，而且富含生物類黃酮[9]、糖醇、多肽和D-手性肌醇等高活性藥用成分[10-11]，具有降脂、降糖、抗衰老、抗氧化[12-13]的功能。

我國(guó)具有悠久的釀醋歷史，食醋已經(jīng)成為人們生活中不可缺少的一種調(diào)味品，并且需求量非常大。以蕎麥為原料的蕎麥醋[14-16]新產(chǎn)品，在保持原有食醋品質(zhì)的基礎(chǔ)上增加了蕎麥特有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，正日益受到越來(lái)越多人的喜好。

醋酸發(fā)酵是蕎麥醋釀造過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前醋酸發(fā)酵多處于手工或半機(jī)械化狀態(tài)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程的控制比較依賴人為經(jīng)驗(yàn)。楊芙蓮等[17]利用正交分析法對(duì)蕎麥醋醋酸發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，探討了不同接種量、發(fā)酵液酒精度、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和瓶裝量對(duì)發(fā)酵的影響；劉旭[18]采用酶法和曲法進(jìn)行糖化，經(jīng)酒精和醋酸發(fā)酵釀造出了具有特殊風(fēng)味的保健型蕎麥醋，探討并提出了提高黃酮類化合物利用率的措施；張素云[19]以苦蕎加工副產(chǎn)物（碎米及皮粉）為主料釀造優(yōu)質(zhì)苦蕎醋，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化液態(tài)苦蕎醋釀造工藝。響應(yīng)面法是指通過(guò)一系列確定性試驗(yàn)，用多項(xiàng)式函數(shù)來(lái)近似隱式極限狀態(tài)函數(shù)。通過(guò)合理地選取試驗(yàn)點(diǎn)和迭代策略，來(lái)保證多項(xiàng)式函數(shù)能夠在失效概率上收斂于真實(shí)的隱式極限狀態(tài)函數(shù)的失效概率?？党萚20]以百香果為原料，總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵百香果果醋的發(fā)酵工藝條件。

本研究以蕎麥為原料制備蕎麥醋，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化蕎麥醋醋酸發(fā)酵階段工藝條件，旨在為企業(yè)的生產(chǎn)提供理論支持和技術(shù)支撐，促進(jìn)企業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥、麩皮、稻殼、谷糠：甘肅萬(wàn)佳現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)發(fā)展服務(wù)有限公司；氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：天津市化工三廠有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AS型干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；JA203P型分析天平：常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京依諾泰儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥醋加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

蕎麥粉碎40目后加入300%～350%水（以主糧質(zhì)量計(jì)算），潤(rùn)料8～12 h，加熱液化，在90～92 ℃保溫1 h，降溫到65 ℃時(shí)，加入糖化酶進(jìn)行糖化，在60～65 ℃范圍內(nèi)保溫2 h，冷卻到30 ℃后加入20%大曲（以主糧質(zhì)量計(jì)）和30%固定化酵母液（以主糧質(zhì)量計(jì)），降溫至25 ℃時(shí)泵入發(fā)酵罐中進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間5～7 d。酒精發(fā)酵結(jié)束以后，在發(fā)酵酒醪中拌入150%麩皮、70%稻殼、30%谷糠（以主糧質(zhì)量計(jì)算），并調(diào)節(jié)拌醅酒精度和醋醅水分含量，翻拌均勻后在表面接入10%左右火醅（已發(fā)酵2 d的醋醅），入池進(jìn)行醋酸固態(tài)發(fā)酵。醋醅起溫后每天翻醅1～2 次，以提供充足的氧氣便于醋酸菌生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)注意控制醋醅溫度不超過(guò)42 ℃（防止燒醅）。當(dāng)醋醅酒精度低于0.3%vol時(shí)可壓醅，此時(shí)發(fā)酵溫度為34～36 ℃，發(fā)酵時(shí)間為9～11 d。淋醋采用三組套淋法，循環(huán)萃取。在第③組醋醅中加入自來(lái)水浸淋，淋出液加入第②組醋醅中淋出二級(jí)醋，再以二級(jí)醋加入第一組醋醅中浸泡20～24 h后淋出的，即為一級(jí)醋。經(jīng)過(guò)滅菌包裝獲得蕎麥醋成品。

1.3.2 蕎麥醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

分別考察拌醅酒精度、火醅接種量、醋醅水分含量及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響，拌醅酒精度分別設(shè)置為4.00%vol、4.25%vol、4.50%vol、4.75%vol、5.00%vol；火醅接種量設(shè)置為8%、10%、12%、14%、16%；醋醅水分含量設(shè)置為50%、55%、60%、65%、70%；發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為7 d、8 d、9 d、10 d、11 d。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素醋酸發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定發(fā)酵時(shí)間為9 d，以拌醅酒精度（A）、火醅接種量（B）、醋醅水分含量（C）這3個(gè)因素為自變量，以蕎麥醋總酸含量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for acetic acid fermentation process optimization

1.3.3 分析檢測(cè)

采用酸堿中和法[21]測(cè)定蕎麥醋中總酸含量，每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

單因素制圖采用Origin 9.0軟件，響應(yīng)面模型擬合采用Design-Expert10.0.7軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 拌醅酒精度對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響

由圖1可知，隨著拌醅酒精度在4.00%vol～4.50%vol范圍內(nèi)的升高，總酸含量開(kāi)始逐漸增加；當(dāng)拌醅酒精度為4.50%vol時(shí)，總酸含量達(dá)到最高值，拌醅酒精度＞4.50%vol之后，總酸含量又逐漸降低。當(dāng)拌醅酒精度較低時(shí)，醋酸菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的醋酸含量低，當(dāng)拌醅酒精度偏高時(shí)，一方面醋酸菌對(duì)酒精的耐受能力降低，從而抑制醋酸菌的生長(zhǎng)，另一方面酒精度越高揮發(fā)越快，從而導(dǎo)致總酸含量降低[22-25]。因此，選擇最佳拌醅酒精度為4.50%vol。

圖1 拌醅酒精度對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of Banpei alcohol content on total acid contents of buckwheat vinegar

2.1.2 火醅接種量對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響

由圖2可知，當(dāng)火醅接種量在8%～12%的范圍內(nèi)增加時(shí)，蕎麥醋總酸含量呈逐漸升高的趨勢(shì)；當(dāng)火醅接種量在12%時(shí)，總酸含量達(dá)到最高值；當(dāng)火醅接種量＞12%之后，總酸含量逐漸降低?；瘐臃N量過(guò)大，需要更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于醋酸菌自身的繁殖，導(dǎo)致生成的醋酸較少，同時(shí)隨著醋酸菌增多，菌體出現(xiàn)老化和自溶現(xiàn)象，從而導(dǎo)致總酸含量降低。因此，選擇最佳火醅接種量為12%。

圖2 火醅接種量對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響Fig.2 Effect of Huopei inoculum on total acid contents of buckwheat vinegar

2.1.3 醋醅水分含量對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響

由圖3可知，當(dāng)醋醅水分含量為50%～65%時(shí)，總酸含量隨之增高；當(dāng)醋醅水分含量為65%時(shí)，蕎麥醋的總酸含量最高；當(dāng)醋醅水分含量＞65%之后，總酸含量逐漸下降。水是醋酸菌進(jìn)行代謝活動(dòng)的介質(zhì)，同時(shí)參與部分生化反應(yīng)。醋醅含水量過(guò)低時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不易擴(kuò)散，阻礙醋酸菌的生長(zhǎng)代謝[26-29]，醋醅含水量過(guò)高時(shí)，醋醅的透氣性能降低，導(dǎo)致醋醅疏松度不夠，供氧不足，不利于醋酸菌的生長(zhǎng)繁殖，從而導(dǎo)致總酸含量降低。因此，選擇最佳醋醅水分含量為65%。

圖3 醋醅水分含量對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響Fig.3 Effect of Cupei moisture on total acid contents of buckwheat vinegar

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響

由圖4可知，隨著醋酸發(fā)酵時(shí)間在7～9 d范圍內(nèi)的增加，蕎麥醋總酸含量隨之逐步增加；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為9 d時(shí)，總酸含量達(dá)到最大值；隨著醋酸發(fā)酵時(shí)間在9～11 d范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，總酸含量又稍微有所下降。發(fā)酵前期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，醋酸菌生長(zhǎng)繁殖快，醋酸生成速度逐步加快，當(dāng)發(fā)酵接近尾聲時(shí)，醋酸揮發(fā)增加，造成總酸含量的降低。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為9 d。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total acid contents of buckwheat vinegar

2.2 蕎麥醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，以總酸含量（Y）為響應(yīng)值，固定發(fā)酵時(shí)間為9 d，考察拌醅酒精度（A）、火醅接種量（B）、醋醅水分含量（C）對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響。采用Design-Expert10.0.7軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for acetic acid fermentation process optimization

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

應(yīng)用Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到總酸含量與各因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=4.89-0.064A-0.12B-0.012C-0.085AB-0.098AC+0.027BC-0.54A2-0.40B2-0.39C2。為了驗(yàn)證方程的可靠性，對(duì)方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由表3可看出，該模型P值＜0.000 1，說(shuō)明試驗(yàn)采用的二次模型極顯著（P＜0.01）；失擬項(xiàng)P值=0.067 3＞0.05，說(shuō)明模型高度可靠。該模型的模型信噪比（signal to noise ratio，SNR）=21.225＞4，說(shuō)明模型可靠性較高，抗干擾能力較強(qiáng)；該模型的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.74%，數(shù)值較小，表明模型精密度和準(zhǔn)確度均較高；該模型決定系數(shù)R2=0.987 5，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.971 4，二者數(shù)值比較接近，說(shuō)明模型的擬合度良好，誤差較小。由P值可知，一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其余均為不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對(duì)總酸含量的影響順序依次為B（火醅接種量）＞A（拌醅酒精度）＞C（醋醅水分含量）。

2.2.3 各因素交互作用影響分析

通過(guò)Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)二次回歸擬合分析，得到各因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖5。各因素及其交互作用對(duì)蕎麥醋總酸含量的影響可以通過(guò)響應(yīng)面及等高線圖直觀的反映出來(lái)。曲面坡度越陡，等高線越近似于橢圓，說(shuō)明兩者的交互作用越顯著。由圖5可知，AB、AC、BC的響應(yīng)曲面坡度較陡，等高線圖接近橢圓形，所以拌醅酒精度（A）和醋醅水分含量（C）的交互作用對(duì)總酸含量影響顯著（P＜0.05），拌醅酒精度（A）和火醅接種量（B）的交互作用對(duì)總酸含量影響不顯著（P＞0.05），火醅接種量（B）和醋醅水分含量（C）的交互作用對(duì)總酸含量影響不顯著（P＞0.05）。

圖5 各因素交互作用對(duì)總酸含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between various factors on total acid contents

2.3 蕎麥醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)模型優(yōu)化求解，得到蕎麥醋醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為：拌醅酒精度4.488%vol、火醅接種量11.716%、醋醅水分含量64.920%，此條件下蕎麥醋總酸含量理論值為4.900 g/100 mL。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，考慮到實(shí)際的操作情況，將醋酸發(fā)酵工藝條件調(diào)整為拌醅酒精度4.50%vol、火醅接種量12%、醋醅水分含量65%，在此最佳醋酸發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到蕎麥醋總酸含量實(shí)際平均值為4.86 g/100 mL，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值偏差很小。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥醋醋酸發(fā)酵工藝條件得到的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有可行性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了蕎麥醋醋酸發(fā)酵工藝條件，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳工藝參數(shù)為：拌醅酒精度4.50%vol、火醅接種量12%、醋醅水分含量65%、發(fā)酵時(shí)間9 d。在此條件下，蕎麥醋總酸含量為4.86 g/100 mL。本研究為企業(yè)蕎麥醋產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了技術(shù)指導(dǎo)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。