綿柔型白酒對(duì)小鼠酒精性肝損傷的影響作用研究

戴 源，陳杉彬，姜 欣，李紅嬌，姚逸萍，張曉蒙，宋 濤，李一澍，趙文梅，王妍凌，王德良

（1.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇 宿遷 223800；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；3.酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京 100015）

酒精飲用后直接作用于人體內(nèi)的肝臟，少部分會(huì)通過(guò)血液進(jìn)入腦部，因此在人體內(nèi)的代謝主要依賴于肝臟[1]。目前普遍認(rèn)為長(zhǎng)期飲酒容易導(dǎo)致肝臟脂肪變性、纖維化乃至肝硬化等酒精性肝損傷病變，引起相關(guān)疾病的發(fā)生。但短時(shí)間內(nèi)大量飲酒，比經(jīng)常性大量酒精攝入更為常見[2-4]。目前酒精性肝病患者人數(shù)逐年上升，而有研究表明，較多的初期酒精性脂肪肝和酒精性肝硬化患者并沒有酗酒的病史[5]?？梢?，酒精性肝損傷與是否長(zhǎng)期攝入酒精并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而更應(yīng)該與飲用方式、飲用對(duì)象、飲用個(gè)體等進(jìn)行相關(guān)的綜合考量。目前普遍認(rèn)為攝入酒精不僅會(huì)對(duì)肝臟造成損傷，而且會(huì)對(duì)大腦認(rèn)知功能產(chǎn)生一定的影響[6]。急性過(guò)量的酒精攝入易引起酒精中毒，引起胃出血，誘發(fā)心腦血管等疾病。但是目前研究表明，急性酒精攝入對(duì)青年人的記憶功能相關(guān)腦區(qū)與未飲酒人群相比并沒有較大的影響[7-8]。同時(shí)通過(guò)急性酒精攝入早期腦部灌注改變的動(dòng)脈自旋標(biāo)記進(jìn)行相關(guān)分析，也未發(fā)現(xiàn)顯著性差異[9]。表明短期攝入酒精并不會(huì)對(duì)腦部造成損傷。但是急性過(guò)量攝入酒精可能會(huì)對(duì)肝腎等組織造成損害。

過(guò)量酒精攝入導(dǎo)致的疾病損傷發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，致病機(jī)理及原因不是十分清晰，可能受到多方面的影響。氧化應(yīng)激可能是其中較為重要的影響因素，當(dāng)體內(nèi)抗氧化機(jī)制無(wú)法應(yīng)對(duì)產(chǎn)生的大量自由基時(shí)，無(wú)法維持相應(yīng)的平衡，過(guò)度氧化應(yīng)激就會(huì)破壞細(xì)胞的完整性，對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。酒精會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，在增加氧化應(yīng)激產(chǎn)物的同時(shí)減少機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的抗氧化因子，同時(shí)釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子，導(dǎo)致線粒體功能障礙，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和其他損傷。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Kelch like epichlorohydrin associated protein，Keap1）-核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）復(fù)合物是細(xì)胞抗氧化信號(hào)調(diào)控通路的關(guān)鍵因子，細(xì)胞氧化的防御機(jī)制主要是激活Nrf2抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路，來(lái)達(dá)到增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，控制其蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與解毒和消除反應(yīng)性氧化劑和親電劑的基因表達(dá)[10-12]。Nrf2活性部分由胞漿蛋白Keap1控制，在正常生理?xiàng)l件下，Nrf2蛋白與Keap1同源二聚體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成復(fù)合物，然后招募E3泛素連接酶，后者介導(dǎo)Nrf2蛋白的泛素化降解，不促進(jìn)下游抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，當(dāng)受到外源氧化刺激后，會(huì)導(dǎo)致Nrf2和Keap1解偶聯(lián)，Nrf2蛋白從Keap1二聚體上分離，泛素化降解減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)富集的Nrf2蛋白進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游靶基因的表達(dá)并發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[13-17]。目前通發(fā)現(xiàn)較多能夠通過(guò)改善抗氧化通路的相關(guān)物質(zhì)均是通過(guò)作用于Keap1-Nrf2相關(guān)通路發(fā)揮作用。

過(guò)量的ROS存在于細(xì)胞內(nèi)，能夠誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化損傷，進(jìn)而產(chǎn)生更多損傷[18]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是緊密結(jié)合，密切相關(guān)的。炎癥是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，在各種因素的刺激下，多種轉(zhuǎn)錄因子被激活，這些轉(zhuǎn)錄因子的激活促進(jìn)促炎蛋白基因的表達(dá)，產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)或細(xì)胞因子，影響多種通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，INOS）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等，引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，造成細(xì)胞及組織的損傷[19-22]。

已有研究表明中國(guó)白酒與食用酒精有本質(zhì)的區(qū)別，微量酒體成分的存在豐富了白酒的風(fēng)味，改善了飲用感受[23-26]。研究證實(shí)，部分微量酒體成分或具有減少因過(guò)量酒精攝入對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損傷的作用[27]，即微量酒體成分在其有效濃度范圍內(nèi)能夠減少酒精性疾病的發(fā)生。研究表明，綿柔型白酒中含有核苷類似物等多種活性成分[28]?；诖?，本研究通過(guò)灌胃食用酒精構(gòu)建急性肝損傷動(dòng)物模型，研究綿柔型酒樣中微量酒體成分在肝損傷動(dòng)物模型中的作用，為白酒不等于食用酒精提供實(shí)驗(yàn)論據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

49～56日齡雄性C57BL/6J小鼠（體質(zhì)量18～22 g）：由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供；飼養(yǎng)溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為（50±5）%，光照時(shí)間12 h/d，自由飲食，5只/籠，合籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)處理均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理與保護(hù)相關(guān)規(guī)定，并隨時(shí)接受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督與檢查。

52%vol綿柔型酒樣1#、52%vol綿柔型酒樣2#（非市售，通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用等檢測(cè)其黃酮類、核苷類、愈創(chuàng)木酚類、吡嗪類等生物活性成分含量不同）：由江蘇洋河酒廠股份有限公司提供；一抗（Nrf2、keap1、COX-2、iNOS與NF-κB）：英國(guó)Proteintech公司；二抗（Anti-rabbit）：美國(guó)CST公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

EclipseCi-L光學(xué)顯微鏡：日本Nikon公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司；ChemiScope 6000 Exp化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：中國(guó)勤翔公司；7500 Fast/7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-fqPCR）系統(tǒng)：美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將30只小鼠隨機(jī)分成3組（包括食用酒精組、綿柔型酒樣1#處理組、綿柔型酒樣2#處理組）。其中食用酒精組灌胃52%vol食用酒精，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組分別灌胃等劑量的52%vol綿柔型白酒1#和52%vol綿柔型白酒2#，灌胃量為12.5mL/kg體質(zhì)量，灌胃結(jié)束后，禁食不禁水，8 h后，眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟組織和血液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其中將右半部肝臟組織通過(guò)10%中性多聚甲醛固定制備石蠟切片，肝臟組織病理學(xué)變化采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin，HE）染色后觀察；其余肝臟于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆肹29]。

1.3.2 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查

肝臟組織用10%中性多聚甲醛固定24 h后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)70%的酒精溶液中脫水處理24 h，常規(guī)石蠟包埋后制作厚度約4 μm的切片，使用C8H10進(jìn)行脫蠟處理，不同體積分?jǐn)?shù)酒精梯度（95%、90%、80%、75%）脫水，蘇木精染色，鹽酸醇分化；0.5%伊紅染色后常規(guī)梯度不同體積分?jǐn)?shù)酒精（75%、80%、90%、95%），體積分?jǐn)?shù)100%酒精I(xiàn)（10 min），體積分?jǐn)?shù)100%酒精I(xiàn)I（10 min）再次脫水；最后經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片，在Nikon光學(xué)顯微鏡Eclipse Ci-L下選取不同的視野拍照并分析肝臟組織病理學(xué)變化。

1.3.3 小鼠肝功能的檢測(cè)

灌胃8 h后，小鼠眼球取血，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min得到血清，并將其轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱進(jìn)行低溫保存。通過(guò)賴氏法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.4 小鼠血脂水平的檢測(cè)

小鼠體內(nèi)血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平均通過(guò)相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 RT-fqPCR擴(kuò)增

按Invitrogen試劑盒提取肝組織總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），并根據(jù)過(guò)氧化氫酶（fungal catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（microtubule-associated protein 1a/1b-light chain 3，LC3）、P62、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因信使核糖核酸（messenger ri bonucleic acid，mRNA）序列設(shè)計(jì)PCR引物，CAT引物：上游5'-GGAGGCGGGAACCCAATAG-3'、下游5'-GTGTGCCATCTCGTCAGTGAA-3'；GSH引物：上游5'-GGTTCGAGCCCAATTTTACA-3'、下游5'-GGTTCGAGCCCAATTTTACA-3'；SOD引物：上游5'-CGGTGAACCAGTTGTGTTGT-3'、下游5'-AGTCACATTGCCCAGGTCTC-3'；陽(yáng)性內(nèi)參采用GAPDH，引物為：上游5'-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3'、下游5'-TCACACACCAGCAGGTTATCATC-3'。引物合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。RTfqPCR體系嚴(yán)格按照Vazyme試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多組間方差分析和T檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；圖表由Origin 2018繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿柔型白酒對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

由圖1（A）可知，食用酒精組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列未見明顯紊亂，主要觀察到中央靜脈、匯管區(qū)周圍及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)均可見多量的肝細(xì)胞輕度變性，胞質(zhì)疏松淡染，未發(fā)生明顯的炎性改變。由圖1（B）可知，綿柔型酒樣1#處理組小鼠的中央靜脈、匯管區(qū)周圍及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)均可見中等量的肝細(xì)胞輕度變性，胞質(zhì)疏松淡染，未見明顯的炎性改變。由圖1（C）可知，肝臟組織被膜由厚薄均勻的富含彈性纖維致密結(jié)締組織構(gòu)成，肝小葉分界明顯，排列規(guī)則，肝小葉中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細(xì)胞和肝血竇，肝細(xì)胞圓潤(rùn)、飽滿；肝板排列規(guī)則、整齊，肝竇無(wú)明顯擴(kuò)張或擠壓；相鄰肝小葉之間的門管區(qū)無(wú)明顯異常；未見明顯的炎性改變。本實(shí)驗(yàn)中食用酒精組小鼠的肝組織發(fā)現(xiàn)存在較多肝細(xì)胞輕度變性情況，而無(wú)明顯的炎癥改變，而在綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組小鼠的肝細(xì)胞輕度變性情況基本一致，但數(shù)量更趨向于減少，比實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果更為明顯。表明在急性飲酒情況下，酒樣中的乙醇已經(jīng)開始對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，但不會(huì)對(duì)肝組織形態(tài)學(xué)造成明顯改變，與其他長(zhǎng)期飲酒實(shí)驗(yàn)對(duì)肝組織形態(tài)學(xué)造成影響的結(jié)果有一定差異，且綿柔型酒樣1#和2#情況均優(yōu)于食用酒精組，可能是其中的活性物質(zhì)對(duì)食用酒精造成的肝損傷起到了一定的保護(hù)作用，能夠減少酒精帶來(lái)的肝損傷危害。

圖1 食用酒精及綿柔型酒樣對(duì)小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on the pathological morphology of liver tissue in mice

2.2 綿柔型白酒對(duì)小鼠肝臟功能的影響

由圖2可知，與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組小鼠血清中的AST、ALT水平均有一定程度降低。在AST水平上，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#分別是食用酒精組的81.9%、84.4%，但三者之間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。而在ALT水平上，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#分別是食用酒精組的78%和80%，差異顯著（P＜0.05）。且綿柔型酒樣1#組在AST和ALT水平上均不同程度低于綿柔型酒樣2#組，但兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。表明綿柔型酒樣在一定程度上確實(shí)能夠緩解食用酒精造成的肝損傷。

圖2 食用酒精及綿柔型酒樣對(duì)小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（A）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（B）活性的影響Fig.2 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on the activities of aspartate aminotransferase (A) and alanine aminotransferase (B) in serum of mice

2.3 綿柔型白酒對(duì)小鼠血脂水平的影響

由圖3可知，與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平相較食用酒精組出現(xiàn)下降，而HDL-C水平上升；與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#組血清中TC水平分別降低了17%和13%；TG水平分別降低了10.4%和6.5%；LDL-C水平分別降低了7.3%和5.9%；HDL-C水平分別升高了4%和3%。除在TC水平外，其他肝臟相關(guān)指標(biāo)表明，綿柔型酒樣1#對(duì)肝損傷嚴(yán)重程度要輕于綿柔型酒樣2#，食用酒精造成的肝損傷情況最為嚴(yán)重。

圖3 食用酒精及綿柔型酒樣對(duì)小鼠血清中總膽固醇（A）、甘油三酯（B）、低密度脂蛋白膽固醇（C）及高密度脂蛋白膽固醇（D）的影響Fig.3 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on total cholesterol (A),triglyceride (B),low density lipoprotein cholesterol (C)and high density lipoprotein cholesterol (D) in serum of mice

2.4 綿柔型白酒對(duì)小鼠氧化通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平及抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

Nrf2是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，活性主要受到Keap1負(fù)性調(diào)節(jié)，在正常情況下，與Keap1相偶聯(lián)，被錨定在胞漿中；當(dāng)受到外界氧化刺激時(shí)，導(dǎo)致Nrf2發(fā)生磷酸化，與Keap1解偶聯(lián)，轉(zhuǎn)移入核，和其專性伴侶結(jié)合成異二聚體，識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）產(chǎn)生功能，Nrf2蛋白為細(xì)胞質(zhì)胞漿蛋白。由圖4及圖5可知，綿柔型酒樣1#組小鼠肝臟中細(xì)胞Nrf2細(xì)胞質(zhì)胞漿蛋白表達(dá)量最低，綿柔型酒樣2#組次之，食用酒精中最高；細(xì)胞質(zhì)胞漿Nrf2蛋白明顯和Keap1解偶聯(lián)進(jìn)入細(xì)胞核中進(jìn)行相關(guān)表達(dá)發(fā)揮功能。同時(shí)Keap1基本不變，在綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#中均持平于在食用酒精組中的Keap1蛋白表達(dá)量。其對(duì)相關(guān)蛋白灰度值進(jìn)行半定量分析，其結(jié)果一致。

圖4 食用酒精及綿柔型酒樣處理對(duì)小鼠肝組織氧化通路的影響Fig.4 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on oxidative pathway of liver tissue in mice

圖5 細(xì)胞質(zhì)胞漿Nrf2、Keap1免疫印跡結(jié)果半定量分析Fig.5 Semi-quantitative analysis of immunoblotting results of cytoplasmic Nrf2 and Keap1

由圖6及圖7可知，與食用酒精組相比較，綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#組在氧化相關(guān)指標(biāo)CAT、GSH、SOD水平相較食用酒精組出現(xiàn)不同程度的升高，其中在CAT和GSH水平升高差異顯著（P＜0.05），而在SOD水平升高差異不顯著（P＞0.05）；綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#的CAT、GSH和SOD含量無(wú)明顯差異（P＞0.05）。綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#均在MDA水平上低于食用酒精組，同時(shí)綿柔型酒樣1#略低于綿柔型酒樣2#，且均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在氧化相關(guān)通路CAT、GSH、SOD的mRNA表達(dá)水平上，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#不同程度的高于食用酒精組，均出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；同時(shí)綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#兩組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在SOD的mRNA水平上，綿柔型酒樣1#組要略高于綿柔型酒樣2#；綜合來(lái)看，酒精能夠造成肝損傷的部分原因可能是通過(guò)影響氧化應(yīng)激信號(hào)通路的響應(yīng)機(jī)制，使肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激調(diào)控失衡，造成損傷的結(jié)果。

圖6 食用酒精及綿柔型酒樣對(duì)小鼠過(guò)氧化氫酶（A）、超氧化物歧化酶（B）及還原型谷胱甘肽（C）和丙二醛（D）含量的影響Fig.6 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on contents of catalase (A),superoxide dismutase (B),reduced glutathione (C)and malondialdehyde (D) in mice

圖7 食用酒精及綿柔型酒樣處理組小鼠過(guò)氧化氫酶mRNA（A）、還原型谷胱甘肽mRNA（B）及超氧化物歧化酶mRNA（C）相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on relative expression of catalase mRNA (A),reduced glutathione mRNA (B)and superoxide dismutase mRNA (C) in mice

其中Keap1-Nrf2是一條重要的氧化通路，能夠控制下游相關(guān)抗氧化元件、蛋白和相關(guān)酶活力來(lái)維持氧化平衡，進(jìn)而應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，提高抗氧化能力。在正常條件下，Nrf2與Keap1相偶連形成復(fù)合物，被錨定在細(xì)胞質(zhì)胞漿中，不發(fā)揮相關(guān)的功能；當(dāng)受到外界氧化刺激時(shí)，Nrf2減少了泛素化降解，更多的被磷酸化修飾，與Keap1解偶連，轉(zhuǎn)移入核，發(fā)生相關(guān)作用，促進(jìn)下游相關(guān)抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生[30-31]。在食用酒精組中，明顯可以觀察到有較多的Nrf2進(jìn)行相關(guān)的表達(dá)，而在綿柔型酒樣1#組小鼠肝臟中細(xì)胞Nrf2胞漿蛋白表達(dá)量最低，綿柔型酒樣2#組次之；同時(shí)在食用酒精組中，Keap1含量也略低于綿柔型酒樣組中。表明細(xì)胞胞漿中Nrf2蛋白更多的參與磷酸化修飾，與Keap1解偶聯(lián)，進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮功能。食用酒精組中的氧化相關(guān)指標(biāo)CAT、GSH、SOD水平均比綿柔型酒樣中不同程度的降低，MDA水平升高。同時(shí)食用酒精組在氧化相關(guān)通路CAT、GSH、SOD的mRNA表達(dá)水平上也相應(yīng)的低于綿柔型酒樣組。綜合來(lái)看，酒精能夠通過(guò)調(diào)控Nrf2是否磷酸化和Keap1相解離進(jìn)而入核發(fā)揮功能，提高相應(yīng)的抗氧化相關(guān)指標(biāo)的含量及活力，來(lái)達(dá)到提高抗氧化的目的，緩解酒精造成的氧化應(yīng)激的壓力。同時(shí)，綿柔型酒樣相較于食用酒精來(lái)說(shuō)，更能夠刺激Nrf2蛋白進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行相關(guān)表達(dá)。

2.5 不同酒樣對(duì)小鼠肝損傷炎癥通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平的影響

除了因?yàn)檠趸瘧?yīng)激對(duì)肝臟造成損傷，炎癥也是危害之一。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（INOS）在炎癥誘導(dǎo)下生成NO，是體內(nèi)重要的生物活性分子和信號(hào)分子[32]；環(huán)氧化酶-2（COX-2）是一種在正常組織中較少表達(dá)的誘導(dǎo)酶，可以快速應(yīng)答一系列促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子[33-35]。由圖8及圖9可知，與食用酒精組相比，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組的炎癥通路相關(guān)蛋白INOS、COX-2、NF-κB的蛋白表達(dá)量均不同程度的降低，其中INOS下降趨勢(shì)更為明顯，而COX-2和NF-κB的蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化；通過(guò)對(duì)相關(guān)蛋白印跡進(jìn)行半定量發(fā)現(xiàn)，綿柔型酒樣1#處理組和綿柔型酒樣2#處理組炎癥相關(guān)蛋白均不同程度降低，均在食用酒精組中表達(dá)最高。相對(duì)于食用酒精組，在INOS蛋白表達(dá)方面，綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#分別下降了13%和7%；在COX-2和NF-κB蛋白表達(dá)方面，分別降低了3.6%、3.7%，3%、4%，但均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。表明通過(guò)急性飲酒后，對(duì)于體內(nèi)炎癥相關(guān)通路而言，食用酒精、綿柔型酒樣1#和綿柔型酒樣2#均能造成負(fù)面影響，但造成的程度不同，其中食用酒精程度較高、綿柔型酒樣2#次之。

圖8 食用酒精及綿柔型酒樣處理對(duì)小鼠肝組織炎癥通路的影響Fig.8 Effects of edible alcohol and Mianrou-flavor Baijiu samples on inflammatory pathway of liver tissue in mice

圖9 炎癥相關(guān)通路INOS、COX-2和NF-κB免疫印跡結(jié)果半定量分析Fig.9 Semi-quantitative analysis of western blot results of inflammation related pathways INOS,COX-2 and NF-κB

3 結(jié)論

為評(píng)價(jià)急性期內(nèi)綿柔型酒中微量酒體成分的存在是否與食用酒精存在異同及相關(guān)微量成分的生理作用，采用兩種綿柔型白酒和食用酒精灌胃小鼠，觀察對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的影響作用。食用酒精組小鼠與綿柔型酒樣1#組和綿柔型酒樣2#小鼠相比較，健康程度及存活率基本無(wú)變化，通過(guò)病理切片顯示，不論是食用酒精組小鼠還是綿柔型酒樣組小鼠，均未對(duì)肝組織造成明顯損害影響，均未發(fā)生炎性改變；但綿柔型酒樣小鼠肝細(xì)胞輕度變性數(shù)量及情況均要優(yōu)于食用酒精組小鼠。同時(shí)對(duì)不同組小鼠肝臟健康相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在食用酒精組中，血清AST、ALT、TC、TG、LDL-C水平均要高于綿柔型酒樣組，同時(shí)HDL-C水平明顯低于綿柔型酒樣組。所有肝臟相關(guān)指標(biāo)均能夠表明，綿柔型酒樣1#對(duì)肝損傷嚴(yán)重程度要輕于綿柔型酒樣2#，食用酒精造成的肝損傷情況最為嚴(yán)重。同時(shí)綿柔型酒樣相較于食用酒精確實(shí)能夠在一定程度上減少酒精性肝損傷的產(chǎn)生。

目前研究結(jié)果表明，綿柔型酒樣相較于食用酒精，雖然急性酒精攝入后時(shí)間較短，但仍能初步通過(guò)影響氧化通路的相關(guān)分子表達(dá)和炎癥通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，減緩酒精帶來(lái)的損害，達(dá)到減少氧化應(yīng)激對(duì)肝臟造成損害的目的。表明在有效濃度范圍內(nèi)，酒體中天然存在的微量功能成分具有減少酒精性損傷的作用。該結(jié)果提示在飲料酒生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)控微生態(tài)、改進(jìn)生產(chǎn)工藝等途徑，不斷提高酒體中微量成分的含量，或是開發(fā)健康飲料酒的有效策略。