電針對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠腸黏膜維生素D膜相關(guān)性快速反應(yīng)類固醇結(jié)合蛋白表達(dá)的影響

石娜,朱崇田,歐陽鋼

(1.臨沂市人民醫(yī)院,臨沂 276003;2.江蘇省老年病醫(yī)院,南京 210024)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是絕經(jīng)后女性的常見疾病,發(fā)病率為25%～50%,多發(fā)生在55～70歲或絕經(jīng)后5～10年內(nèi)[1]?；颊呖沙霈F(xiàn)全身乏力、骨痛等癥狀,且極易發(fā)生骨折[2]。骨質(zhì)疏松性骨折是老年患者致殘和致死的主要原因,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,并增加了家庭和社會的負(fù)擔(dān)[3]。目前西醫(yī)主要以激素替代療法為主,但不良反應(yīng)多,且有致癌的風(fēng)險(xiǎn)[4]。針灸可有效提高患者骨密度及雌激素值,是一種安全有效的治療方法[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),伴有消化系統(tǒng)疾病的患者其骨質(zhì)疏松發(fā)生率明顯增高[7-8],這與鈣的吸收下降密切相關(guān)。1,25維生素D3膜相關(guān)性快速反應(yīng)類固醇結(jié)合(membraneassociated rapid response steroid-binding,1,25D3-MARRS)蛋白和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)為胃腸道內(nèi)存在的特異性蛋白,二者結(jié)合后可促進(jìn)小腸黏膜Ca2+的吸收,對PMOP的防治具有重要作用[9-10]。本研究擬通過觀察去卵巢大鼠腸黏膜1,25D3-MARRS表達(dá)與血清PTHrP、1,25(OH)2D3水平的變化,探討電針對鈣吸收的調(diào)節(jié)作用以及電針治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雌性 SPF級 3月齡 SD大鼠 32只,體質(zhì)量 180～200 g,未曾交配,購于浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號 SCXK(浙)2014-0001]。在南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(屏障環(huán)境)喂養(yǎng),環(huán)境溫度21～25 ℃,濕度40%～60%,光照時(shí)間每日12 h,飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食飲水。動物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案通過南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查(倫理批號201812A023)。

1.2 主要試劑與儀器

MEDIX90雙能 X線骨密度檢測儀(法國奧斯托公司),雷勃爾離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司),Thermo ST16R低溫離心機(jī),RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷杜公司)。胎牛血清(FBS,美國 Gibco公司,貨號10099141),低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司,貨號11054001)、小鼠ERP57單克隆抗體(美國Santa公司,貨號sc-23886)、山羊抗小鼠IgG二抗(賽默飛公司,貨號A-11008)、戊巴比妥鈉購于德國默克公司(中國上海分裝,貨號 283256),ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物公司。

1.3 分組與造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組及電針組,每組8只。模型組和電針組采用切除大鼠雙側(cè)卵巢的方法制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型[11]。采用3%戊巴比妥鈉(按每100 g體質(zhì)量0.1 mL)腹腔注射麻醉大鼠,局部去毛,取背側(cè)改良切口,最下肋下緣一橫指處與腰椎旁開一個(gè)半橫指處的交點(diǎn)為切口中心,縱行切開 0.8～1 cm,于深部脂肪層中可發(fā)現(xiàn)粉紅色卵巢,在子宮角處結(jié)扎后切除卵巢。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。為防止抗菌藥物對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,術(shù)后不予注射或局部應(yīng)用任何抗菌藥物。空白組大鼠不做任何處理。所有大鼠術(shù)后均自由攝食和飲水。

1.4 干預(yù)方法

造模后,電針組行電針干預(yù)。將大鼠裝于自制錐形袋內(nèi)進(jìn)行針刺。取關(guān)元和雙側(cè)三陰交為一組穴位,腎俞和雙側(cè)后三里為另一組穴位。取穴方法均參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]中相關(guān)描述。每日取一組穴位,兩組穴位交替進(jìn)行。用0.25 mm×25 mm針灸針刺入穴位后,接韓氏電針儀對雙側(cè)三陰交或雙側(cè)腎俞進(jìn)行電刺激,強(qiáng)度2 mA,疏密波,頻率 2 Hz/15 Hz,電針 20 min。每日1次,每周連續(xù)治療5 d,間隔2 d,共治療12周。其余各組均不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5 樣本采集

采集標(biāo)本前一晚8點(diǎn)開始禁食,不禁水。第2天使用3%戊巴比妥鈉(按每100 g體質(zhì)量0.1 mL)將大鼠進(jìn)行腹部麻醉,將其置于無菌操作臺上,打開腹腔,腹主動脈取血,離心得血清后置于-20 ℃冰箱保存。取完血后,從十二指腸起始端剪下約10 cm小腸,無菌生理鹽水沖洗干凈后,剪刀縱行剪開腸腔,用烤過的載玻片刮下腸黏膜,用錫鉑紙包裹,迅速置于盛有液氮的容器中,-70 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。大鼠放血致死?剝離大鼠右側(cè)股骨及脛骨,徹底去除肌肉及肌腱等組織,用生理鹽水紗布包裹后放入EP管中,置于-20 ℃冰箱保存。

1.6 觀測指標(biāo)

1.6.1 骨密度

將大鼠離體股骨和脛骨自冰箱中取出,室溫下靜置30 min后,使用MEDIX90雙能X線骨密度檢測儀進(jìn)行骨密度檢測,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得出骨密度值。

1.6.2 血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和 RANKL水平

使用ELISA法進(jìn)行檢測。按照說明書設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。分別設(shè)定空白孔和待測樣品孔,在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μL,然后再加待測樣品 10 μL。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,不能觸及孔壁,輕輕晃勻,除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL,用封板膜封板后放至37 ℃溫育60 min;揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每個(gè)孔內(nèi)加滿洗滌液,靜置 30 s后棄去,重復(fù)5次,最后拍干;每個(gè)孔內(nèi)先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑 B 50 μL,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色 15 min;每個(gè)孔內(nèi)加終止液 50 μL,終止反應(yīng);在加終止液后15 min以內(nèi)測定,以空白孔調(diào)零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.6.3 腸黏膜1,25D3-MARRS蛋白的表達(dá)

使用Western blot法檢測。根據(jù)試劑盒說明書提取總蛋白,煮沸使蛋白變性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,ERP 57單克隆抗體(1:100)作為目的蛋白,β-actin(1:1 000)作為內(nèi)參,4 ℃過夜。山羊抗小鼠二抗(1:10 000)37 ℃孵育 2 h,洗膜后顯色,暗室內(nèi)膠片曝光。采圖后用Gel-pro軟件圖像數(shù)據(jù)分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析;方差齊性檢驗(yàn)采用Leven法,若方差齊則采用LSD法進(jìn)行兩兩比較,若方差不齊則采用Dunnett’T3法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨及脛骨骨密度比較

與空白組比較,模型組大鼠股骨、脛骨骨密度明顯降低(P＜0.01);與假手術(shù)組比較,模型組股骨及脛骨骨密度降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組大鼠股骨、脛骨骨密度升高(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 各組大鼠股骨及脛骨骨密度比較(每組8只大鼠)

2.2 各組大鼠血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比較

與空白組比較,模型組和電針組血清 1,25(OH)2D3及 PTHrP水平明顯降低(P＜0.01);與假手術(shù)組比較,模型組和電針組血清1,25(OH)2D3及PTHrP水平明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組血清 1,25(OH)2D3及PTHrP水平明顯升高(P＜0.01,P＜0.05)。與空白組比較,模型組和電針組血清 OPG水平明顯降低(P＜0.01,P＜0.05);與假手術(shù)組比較,模型組血清 OPG水平明顯降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組血清OPG水平明顯升高(P＜0.01)。與空白組比較,模型組和電針組血清RANKL水平明顯升高(P＜0.01);與假手術(shù)組比較,模型組和電針組血清 RANKL水平升高(P＜0.01);與模型組比較,電針組 RANKL水平明顯降低(P＜0.01)。與空白組比較,模型組血鈣水平明顯降低(P＜0.05);與假手術(shù)組比較,模型組血鈣水平明顯降低(P＜0.05);與模型組比較,電針組血鈣水平明顯升高(P＜0.05)。與空白組比較,模型組和電針組血清OPG/RANKL值明顯降低(P＜0.01);與假手術(shù)組比較,模型組和電針組血清OPG/RANKL值降低(P＜0.01);與模型組比較,電針組 OPG/RANKL比值明顯升高(P＜0.01)。詳見圖2。

圖2 各組大鼠血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比較(每組8只大鼠)

2.3 各組大鼠腸黏膜1,25D3-MARRS蛋白表達(dá)的比較

與空白組和假手術(shù)組比較,模型組 1,25D3-MARRS蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01);與空白組比較,電針組1,25D3-MARRS蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05);與模型組比較,電針組 1,25D3-MARRS蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。詳見圖3。

圖2 各組大鼠血清鈣、PTHrP、1,25(OH)2D3、OPG和RANKL水平比較(每組4個(gè)樣本)

3 討論

鈣是重要的骨礦物質(zhì)元素,鈣的減少和丟失是引起骨密度下降并最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要因素之一[13]。近端小腸(十二指腸和近端空腸)是鈣吸收的主要部位,小腸黏膜病變或切除小腸后可導(dǎo)致骨密度下降,最終造成骨質(zhì)疏松發(fā)病率增加[7-8],而這一過程受 1,25(OH)2D3、雌激素及甲狀旁腺激素(PTH)等多種激素的調(diào)控[14-15]。

1,25(OH)2D3是維生素 D在體內(nèi)的活性形式,它對人體鈣磷代謝及骨骼系統(tǒng)的生長發(fā)育都有重要的作用[16-17]。破骨細(xì)胞的分化與功能也受1,25(OH)2D3的調(diào)控,當(dāng)腸道鈣的攝取明顯下降時(shí),1,25(OH)2D3會明顯增多,通過增強(qiáng)骨吸收并抑制骨質(zhì)礦化以維持血清鈣正常水平[18]。1,25D3-MARRS是蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶家族中的一員,可在小腸、腎、腦、骨等多種組織中表達(dá)[19-20],是 1,25(OH)2D3發(fā)揮作用的非基因組機(jī)制[21]。研究顯示,1,25D3-MARRS可以促進(jìn)小腸對鈣的快速吸收。1,25(OH)2D3與小腸上皮細(xì)胞膜受體1,25D3-MARRS/ERp57結(jié)合后,先后激活磷脂酶 A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC),最終導(dǎo)致PLC釋放[22],從而達(dá)到促進(jìn)鈣磷代謝的目的。大鼠去卵巢后 1,25(OH)2D3及 1,25D3-MARRS水平下降,會嚴(yán)重影響腸道鈣的吸收,從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。電針治療后血清 1,25(OH)2D3水平升高,腸黏膜1,25D3-MARRS表達(dá)也明顯增加,這種變化有利于促進(jìn)腸道鈣的快速吸收,以促進(jìn)骨形成,最終達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松的目的。

PTHrP在人胃腸道黏膜中均有表達(dá)[23],可影響骨、腎、乳腺、胎盤等多種組織中的鈣吸收,是一種起效快、副作用少的骨形成促進(jìn)劑[24-25]。PTHrP通過與 PTH1R相互作用,刺激 IGF-1合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞合成代謝[26]。給小鼠注入PTHrP后可以刺激十二指腸鈣吸收的增加,而胃泌素對十二指腸鈣的吸收并沒有作用[24]。另外,PTHrP缺失的小鼠出生后可出現(xiàn)頭部軟骨、肋軟骨發(fā)育不良及牙齒萌出障礙,說明PTHrP在骨骼發(fā)育、成骨及破骨代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[27-28]。大鼠去卵巢后血清 PTHrP水平明顯下降,影響了成骨細(xì)胞合成及十二指腸對鈣的吸收,導(dǎo)致骨密度下降,電針可有效提高PTHrP水平,改善骨密度。

OPG和RANKL是破骨細(xì)胞形成、分化和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子,OPG和RANKL的表達(dá)是骨吸收與重建的重要因素[29-31]。OPG/RANKL系統(tǒng)在機(jī)體中處于動態(tài)平衡,當(dāng)比值下降時(shí),會引起一些骨代謝疾病,而當(dāng)比值升高時(shí),會減弱破骨細(xì)胞的分化成熟,有利于骨重建[32]。大鼠去卵巢后 OPG/RANKL比值明顯下降,說明破骨細(xì)胞分化活躍,發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)性高。而電針可有效提高OPG/RANKL的比值,發(fā)揮骨保護(hù)的作用[33-34]。

《素問·宣明五氣》提出“腎主骨”,認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥主要與腎關(guān)系密切;《素問·逆調(diào)論》中強(qiáng)調(diào)“腎者水也,而生于骨……不生則髓不能滿,故寒甚至骨也”。因此,本研究主要選擇具有補(bǔ)腎健脾作用的關(guān)元、三陰交、腎俞、后三里進(jìn)行電針治療。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針可有效提高血清1,25(OH)2D3及PTHrP水平,增加 1,25D3-MARRS蛋白表達(dá),從而促進(jìn)腸道鈣的重吸收,最終達(dá)到升高骨密度,治療骨質(zhì)疏松的目的。另外,電針還可通過提高 OPG/RANKL的比值,減弱破骨細(xì)胞的分化,從而發(fā)揮骨保護(hù)作用。

綜上,腸道鈣吸收不良是罹患骨質(zhì)疏松癥的重要原因,而電針可促進(jìn)腸道鈣的重吸收,提高血鈣水平,并可通過作用于 OPG/RANKL系統(tǒng),最終實(shí)現(xiàn)防治骨質(zhì)疏松癥的作用。