西藏拉薩引種的4種竹子的耐寒性評價*

包昌艷，趙俊，楊漢奇

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所，云南 昆明 650233；2.西藏自治區(qū)林木科學(xué)研究院，西藏 拉薩 850000)

近年來，隨著西藏城市和國土綠化工作的深入開展，園林綠化建設(shè)事業(yè)得到了飛速發(fā)展，對于樹種多樣化的要求也越來越高。由于西藏地區(qū)特殊的高寒氣候條件的影響，根據(jù)適地適樹原則，選擇耐寒耐旱的樹種如高山松(Pinusdensata)、榆樹(Ulmuspumila)、側(cè)柏(Platycladusorientalis)和女貞(Ligustrumlucidum)等[1-3]是該地區(qū)綠化成功推進的關(guān)鍵。竹子是我國大眾最喜愛的綠化觀賞樹種之一，也逐漸進入西藏城市綠化美化樹種的選擇范圍。西藏自治區(qū)原生竹類有11屬26種，其中特有種有19種[4-6]，一些竹種(如西藏箭竹Fargesiamacclureana)早已作為觀賞樹種在拉薩羅布林卡等園林中引種栽培[4]。為了提高西藏城市引種綠化觀賞竹種的成功率和質(zhì)量，開展不同竹種對西藏地區(qū)低溫氣候的耐寒適應(yīng)性研究顯得尤為重要和迫切。

植物應(yīng)對低溫脅迫的主要生理反應(yīng)表現(xiàn)為膜脂氧化導(dǎo)致相對電導(dǎo)率及丙二醛含量(MDA)升高，游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等保護酶活性被激活以抵御超氧自由基的毒害[7-10]。因而，這些生理指標(biāo)已被用來評價蘋果(Maluspumila)砧木[7]，椰子(Cocosnucifera)[8]，古巴牛乳樹(Manilkararoxburghiana)、人心果(M.zapota)、神秘果(Synsepalumdulcificum)、蛋黃果(Lucumanervosa)和星蘋果(Chrysophyllumcainito)5種山欖科(Sapotaceae Juss.)果樹[9]，娜塔櫟(Q.nuttallii)、沼生櫟(Q.palustris)、舒瑪櫟(Q.shumardii)、雙色櫟(Q.bicolor)4個櫟屬(QuercusLinn)樹種[10]等的抗寒性，以表征其耐寒性能。竹類抗寒生理研究結(jié)果顯示，葉片相對電導(dǎo)率，POD、SOD等抗氧化酶活性，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和MDA含量的變化等都適合作為竹子耐寒性鑒定的關(guān)鍵生理指標(biāo)[11-14]。楊振亞等[11]、胡尚連等[12]發(fā)現(xiàn)在相同低溫脅迫下，耐寒性高的竹種在達到半致死溫度前的葉片相對電導(dǎo)率、抗氧化酶活性和可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量較高。4個竹種在北方耐寒適應(yīng)性試驗中[13]，耐寒性差的早園竹(Phyllostachyspropinqua)的抗氧化酶SOD活性持續(xù)降低，POD峰值出現(xiàn)得更早；而且MDA含量大幅下降，可溶性糖含量在初期升高后出現(xiàn)下降趨勢。在不同海拔高度分布的慈竹(Neosinocalamusaffinis)和毛竹(P.heterocycla)的耐寒能力比較中[14]，兩個竹種葉片的凈光合速率、POD活性和可溶性蛋白含量隨海拔的升高而提高；而且隨海拔的升高，耐寒性較差的慈竹中脯氨酸含量和可溶性糖含量隨海拔的升高而增加，但對毛竹的影響不大。本研究以2018年3月從西藏引種的高山竹類西藏箭竹、錯那箭竹(F.grossa)和從浙江引種的溫帶竹類紫竹(Phyllostachysnigra)、金鑲玉(P.aureosulcataf.spectabilis)4個竹種為對象[15]，研究其在自然低溫下耐寒相關(guān)生理指標(biāo)的變化，探求這4個竹種的耐寒機理，并利用隸屬函數(shù)法綜合評價其抗寒性，以期為西藏耐寒竹類種質(zhì)的挖掘和4竹種在拉薩市的引種及作為綠化竹種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗地位于西藏自治區(qū)拉薩市林木科學(xué)研究院苗圃，海拔3 660 m，土壤為河灘砂壤。當(dāng)?shù)貙俑咴瓬貛О敫珊导撅L(fēng)氣候，具有長冬無夏、春秋相連的特點。全年日照時間3 000 h以上；年平均氣溫7.5 ℃，歷史最冷月平均氣溫-2.2 ℃，最熱月平均氣溫16.5 ℃，極端最高溫29.6 ℃，極端最低溫-16.5 ℃；日溫差大，年溫差小，日均溫≥10 ℃的日數(shù)為153.9 d，無霜期133 d；年降水量 443.6 mm，集中在6—9月份。空氣稀薄，太陽輻射強，氣溫偏低，晝夜溫差較大，冬春季干旱少雨，干濕季節(jié)分明且多大風(fēng)[2,15]。

試驗材料采集自引種定植2 a的西藏箭竹、錯那箭竹(引自西藏)、紫竹和金鑲玉(引自浙江)，4竹種分別作為當(dāng)?shù)卦呱街耦愐约皟?nèi)地中小型溫帶竹類的代表竹種。采樣期間氣溫變化情況如圖1所示，8—11月，月平均氣溫逐漸下降，至次年1月達到最低平均氣溫0.45 ℃，之后氣溫慢慢回升；極端低溫出現(xiàn)在11月份至次年3月份(氣象資料來源于中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)http://data.cma.cn)。本試驗分別于2019年8月、11月和2020年4月從各竹種中隨機選取6個植株的上、中、下部枝條的成熟葉片混合后進行理化指標(biāo)的測定，3次采樣重復(fù)。3次采樣時間段分別代表拉薩高寒地區(qū)竹類引種馴化過程中的3個階段——提高植物耐寒性的準(zhǔn)備階段(8月)、低溫馴化起始階段(11月)和經(jīng)歷自然低溫后的恢復(fù)生長階段(第二年4月)。

圖1 試驗期間拉薩月平均氣溫與極端低溫

1.2 葉片生理指標(biāo)測定方法

5種低溫脅迫下植物生理反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)被選擇用來分析4種竹子耐寒性能。參照李合生[16]的指標(biāo)測定方法，分別為：丙二醛(MDA)含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法；過氧化物酶(POD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法；可溶性糖，采用蒽酮比色法；可溶性蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；游離脯氨酸，采用酸性茚三酮比色法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010分析處理后，采用SPSS 20.0軟件進行了方差分析(ANOVA，a=0.05)、相關(guān)性分析和聚類分析，分析各生理指標(biāo)間的相關(guān)性，并將具有不同抗寒性的竹種進行分類。采用Canoco 5.0進行冗余分析(RDA)，以直觀反映各生理指標(biāo)變化與溫度間的相關(guān)性。并運用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)法對4種竹子各生理指標(biāo)進行耐寒性綜合評價。隸屬函數(shù)值計算公式如下。

Rijk=(Xijk-Xkmin)/(Xk max-Xk min)(正相關(guān))，

Rijk=1-(Xijk-Xkmin)/(Xk max-Xk min)(負(fù)相關(guān))。

式中：i表示竹種，j表示月份，k表示指標(biāo)；Xijk為i竹種在第j個月k指標(biāo)的測定值，Xk min為所有竹種所有月份k指標(biāo)的最小值，Xk max為k指標(biāo)的最大值；Rijk為i竹種在第j個月k指標(biāo)的隸屬函數(shù)值[11,17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙二醛含量變化

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生會加劇膜損傷。4個竹種葉片中MDA含量隨氣溫變化均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(圖2A)，各個竹種的MDA含量都在第二階段(11月)達到最大值。其中：錯那箭竹的MDA含量在3個時期間變化不明顯(P>0.05)；金鑲玉3個時期間的MDA含量差異均達顯著水平(P<0.05)；西藏箭竹與紫竹第一階段(8月)的MDA含量與第三階段(次年4月)的無顯著差異(P>0.05)；西藏箭竹、紫竹和金鑲玉第二階段(11月)的MDA含量均顯著(P<0.05)高于其余2個階段(8月、翌年4月)的，3個竹種第二階段(11月)的MDA含量比第一階段(8月)的分別增加10.68%、11.70%和18.78%。另外，紫竹的MDA含量顯著高于同期其它3個竹種的(P<0.05)，增加幅度為38.37%～68.33%。

2.2 保護酶活性變化

過氧化物酶(POD)是植物組織中重要的保護酶，低溫條件下植物體內(nèi)的保護酶活性常常能夠被誘導(dǎo)而大量表達。8月后隨著氣溫的降低，4種竹子葉片中POD酶活性變化差異明顯(圖2B)。錯那箭竹的POD酶活性在3個時期間均無明顯差異， 西藏箭竹、紫竹和金鑲玉第二階段(11月)的POD酶活性與第一階段(8月)的相比，均顯著增加，分別增加了6.28%、12.97%、10.54%；紫竹和金鑲玉POD酶活性整體水平明顯高于西藏箭竹和錯那箭竹，整體高出62.02%～66.51%。

圖2 自然低溫環(huán)境對4種竹子葉片生理指標(biāo)的影響

2.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化

脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖為細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。4種竹子葉片組織中細(xì)胞滲透物質(zhì)含量變化如圖2C～圖2E所示。西藏箭竹和錯那箭竹3個時期間的可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的變化趨勢，都在第二階段(11月)時達最大值；而紫竹和金鑲玉的的可溶性蛋白含量在3個時期間則呈先降低后升高的變化趨勢，都在第二階段(11月)時達最低水平(圖2C)，這可能是由于持續(xù)低溫抑制了這兩種竹子蛋白質(zhì)的合成。其中：紫竹可溶性蛋白含量在3個時期間變化不明顯(P<0.05)；西藏箭和金鑲玉第一階段(8月)的可溶性蛋白含量含量與第三階段(翌年4月)的無顯著差異(P>0.05)；錯那箭竹可溶性蛋白含量在第二階段(8月)與第三階段(翌年4月)變化不明顯(P<0.05)；西藏箭竹和錯那箭竹第二階段(11月)的可溶性蛋白含量比第一階段(8月)顯著增加23.57%和20.00%，紫竹和金鑲玉第二階段(11月)的可溶性蛋白含量則比第一階段(8月)降低12.71%和24.00%。另外，紫竹的可溶性蛋白含量明顯低于同期其他3個竹種的(P<0.05)，與西藏箭竹和錯那箭竹相比，紫竹的可溶性蛋白含量平均低出7.19%～81.31%。

4種竹子葉片的可溶性糖含量(圖2D)和脯氨酸含量(圖2E)隨氣溫變化都呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，且都在第二階段(11月)達較高水平。其中，西藏箭竹和錯那箭竹的可溶性糖含量在第一階段(8月)和第三階段(翌年4月)差異不顯著(P<0.05)，而紫竹和金鑲玉的可溶性糖含量在3個時期間變化明顯(P<0.05)；脯氨酸含量僅錯那箭竹在3個時期間變化顯著(P<0.05)，其余3種竹的脯氨酸含量在第一階段(8月)和第二階段(11月)變化顯著(P<0.05)。與第一階段(8月)相比，西藏箭竹、錯那箭竹、紫竹和金鑲玉第二階段(11月)葉片中的可溶性糖含量分別顯著提高10.89%、10.25%、11.66%、20.14%，脯氨酸含量則分別顯著增加7.73%、3.47%、5.69%、11.98%。此外，3個時期西藏箭竹和錯那箭竹的脯氨酸含量遠(yuǎn)高于紫竹和金鑲玉，平均高出57.01%～133.14%，這可能暗示西藏箭竹和錯那箭竹有更強的抗寒性。

2.4 自然低溫對4種竹子生理指標(biāo)影響的相關(guān)分析和冗余分析

2.4.1 相關(guān)性分析

自然低溫下4個竹種生理指標(biāo)的Pearson相關(guān)分析如表1所示?？扇苄缘鞍缀颗cMDA含量、POD活性極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.838、-0.684，可溶性糖含量則相反，與MDA含量、POD活性顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.723、0.675；二者之間及二者與脯氨酸含量間均無顯著相關(guān)關(guān)系。POD活性與MDA含量呈極顯著正相關(guān)(0.769)，與脯氨酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(-0.914)，其他指標(biāo)相關(guān)性不顯著。由于各變量之間存在一定的相關(guān)性，使得觀測數(shù)據(jù)所反映的信息存在重疊現(xiàn)象[18]。因此在竹子耐寒性評價中，不能單獨依據(jù)上述某個或某兩個指標(biāo)對耐寒性進行評價。

表1 4個竹種耐寒性指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣

2.4.2 冗余分析

冗余分析(RDA)結(jié)果(圖3)顯示：可溶性糖(SS)與MDA、POD活性呈正相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白(SP)、脯氨酸(Pro)間表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系，Pro與SP間呈正相關(guān)，MDA、POD也呈正相關(guān)關(guān)系，與上述Pearson相關(guān)分析結(jié)果基本一致。溫度的改變對SS(可溶性糖)的影響最大，對MDA、POD活性影響次之，而對Pro(脯氨酸)、SP(可溶性蛋白)的影響相對較小。

圖3 竹子葉片耐寒性指標(biāo)對月平均溫度響應(yīng)的冗余分析(RDA)

2.5 竹子耐寒性分類及綜合評價

2.5.1 聚類分析

聚類分析是種質(zhì)資源評價和性狀評價中一種高效、通用的分析方法[19]。對4個竹種葉片耐寒生理指標(biāo)的聚類分析結(jié)果顯示，基于組間聯(lián)接法(歐氏距離)可形成兩大聚類，紫竹和金鑲玉聚為一類，西藏箭竹和錯那箭竹構(gòu)成另一類，表明紫竹和金鑲玉、西藏箭竹和錯那箭竹在耐寒表現(xiàn)上分別具有相似性(圖4)。

圖4 基于5個耐寒生理指標(biāo)的4個竹種的聚類分析

2.5.2 隸屬函數(shù)綜合評價

植物耐寒性是由多種數(shù)量性狀和質(zhì)量遺傳基因等綜合作用的累加結(jié)果，因此運用隸屬函數(shù)法將4種竹子葉片的耐寒性相關(guān)生理指標(biāo)進行綜合分析，評價其耐寒性的結(jié)果更為可靠。根據(jù)隸屬函數(shù)值可知，4種竹子的平均隸屬度為0.437 3～0.633 0，錯那箭竹的平均隸屬度最高(0.633 0)，西藏箭竹的平均隸屬度次之，紫竹最低(0.437 3)(表2)。因此，4種竹子耐寒性綜合排名為：錯那箭竹>西藏箭竹>金鑲玉>紫竹。

表2 4種竹子的隸屬函數(shù)值及耐寒性綜合排名

3 討論與結(jié)論

溫度是影響植物生長發(fā)育和地理分布的主要自然環(huán)境因素之一，植物在引種馴化過程中，常通過自身生理和形態(tài)的可塑性提高對環(huán)境的適應(yīng)性。而植物葉片對氣候變化非常敏感，以植物葉片為研究對象，更能反映植物對氣候變化的響應(yīng)與適應(yīng)機制[20]。本研究中，在自然低溫下，引種的4種竹子葉片中的MDA含量、POD活性、可溶性蛋白和可溶性糖含量等生理指標(biāo)發(fā)生了明顯變化，且不同竹種間各指標(biāo)也有一定差異，反映了竹子對低溫的生理響應(yīng)；其中，耐寒性強的竹種MDA含量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量與耐寒性差的竹種相比差異明顯，提示它們在4種竹子耐寒過程中可能發(fā)揮著重要作用。

植物膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害的原發(fā)部位，低溫脅迫下，MDA大量積累會造成膜透性上升，膜內(nèi)物質(zhì)外滲，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)嚴(yán)重受損[7,21]。低溫條件下，耐寒性較差的樹種細(xì)胞膜氧化現(xiàn)象往往發(fā)生得更早更嚴(yán)重，這導(dǎo)致其MDA含量的顯著增加[12]。本研究中4種竹子MDA含量在自然低溫馴化后均有不同程度的增高，與橡膠樹無性系在自然越冬過程MDA含量變化一致[22]；其中耐寒性差的紫竹和金鑲玉MDA含量增幅較大(11.70%和18.78%)，耐寒性強的錯那箭竹在溫度降低后則無顯著變化，這與張海燕[23]在歐美楊(P.×euramericana)中的研究結(jié)果相似，顯示錯那箭竹膜系統(tǒng)耐寒性強于其他種。此外，紫竹MDA含量明顯高于同期的其他3種竹，提示紫竹在西藏耐寒適應(yīng)性較差。

POD活性上升有利于保持植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除之間的平衡，從而保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加其抗寒能力。已有竹類相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)POD、SOD等抗氧化酶活性在一定低溫條件脅迫下隨溫度的降低而升高，表明抗氧化酶系統(tǒng)在竹子耐受低溫的過程中發(fā)揮積極的作用[11-12]。本研究中自然低溫馴化后各竹種POD活性不同程度的升高反映了它們對低溫的生理響應(yīng)，與前人研究結(jié)果一致[11-13]。其中，錯那箭竹和西藏箭竹POD活性在拉薩定植并經(jīng)自然低溫后增幅較小，而從內(nèi)地引種的紫竹和金鑲玉的POD活性則保持了較高水平，這可能是由于錯那箭竹和西藏箭竹是西藏地區(qū)原生的高山竹種，本身具有較強耐寒性的生物學(xué)特性，低溫脅迫對它們的影響較小，因而在POD活性變化上也較小。

滲透調(diào)節(jié)作用是植物抵御低溫脅迫的重要生理機制，可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和游離脯氨酸的積累能增加細(xì)胞內(nèi)束縛水與自由水的比值、原生質(zhì)的保水能力和細(xì)胞液濃度等，從而平衡在低溫條件下的細(xì)胞代謝，對生物膜系統(tǒng)起到很好的保護作用[11,24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，4個竹種可溶性糖含量和脯氨酸含量隨氣溫變化都表現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，并在第二階段(11月)達較高水平，耐寒性強的西藏箭竹和錯那箭竹經(jīng)低溫馴化后可溶性蛋白含量顯著增加(23.57%和20.00%)，西藏箭竹和錯那箭竹的脯氨酸含量遠(yuǎn)高于紫竹和金鑲玉，平均高出57.01%～133.14%，說明不同程度的可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加是竹子在低溫條件下的適應(yīng)性策略，這與前人的研究一致[11-14,27]。但耐寒性弱的紫竹和金鑲玉經(jīng)低溫馴化后，可溶性蛋白不增反而顯著降低，這可能與持續(xù)低溫對耐寒性差的竹子產(chǎn)生嚴(yán)重的冷害，超出其耐受范圍，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透失衡，蛋白質(zhì)含量下降有關(guān)[8]。

相關(guān)分析和冗余分析(RDA)分析結(jié)果顯示，在自然低溫過程中，溫度的改變對4種竹子中葉片耐寒性生理指標(biāo)的影響存在不同程度的差異，且各生理指標(biāo)間也存在相關(guān)性，用其中某單一指標(biāo)來評價竹子的抗寒性存在偏差。植物耐寒性是多重因素綜合作用的結(jié)果，故本研究運用隸屬函數(shù)法對引種竹種的耐寒性進行綜合評價，4種竹子在拉薩的耐寒性強弱順序為：錯那箭竹>西藏箭竹>金鑲玉>紫竹，這與近年來在拉薩市引種栽培試驗結(jié)果一致[15]。

綜上所述，自然低溫對4種竹子的葉片耐寒性生理指標(biāo)均有不同程度的影響，且各指標(biāo)間存在相關(guān)關(guān)系，耐寒性為多重因素綜合作用的結(jié)果，運用隸屬函數(shù)法評價4種竹子的耐寒性具有更高的可信度。4種竹子在拉薩的耐寒性以錯那箭竹最強，西藏箭竹次之，金鑲玉較弱，紫竹最弱。西藏拉薩地區(qū)氣候寒冷干燥，冬季長達5個月，因此，在拉薩進行綠化竹子引種時應(yīng)優(yōu)先考慮當(dāng)?shù)氐腻e那箭竹、西藏箭竹等耐寒性較強的高山竹種。