紫甘藍(lán)花青素/大豆分離蛋白復(fù)合膜的制備與性能研究*

陳成，李蕾，畢會敏，范方宇

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白，含有90%以上的蛋白質(zhì)[1]。大豆分離蛋白作為制備可食用食品包裝膜的成膜基質(zhì)，具有來源廣泛、價格低廉、環(huán)境友好以及成膜性好等優(yōu)點[1-3]。但純大豆分離蛋白膜存在阻隔性弱、穩(wěn)定性差、易溶于水等不足[4]。近年來，已有不少學(xué)者對大豆分離蛋白進(jìn)行改性或添加天然材料的方法改善大豆分離蛋白膜的缺陷[5]。

花青素是自然界中一類廣泛存在于植物體內(nèi)的類黃酮物質(zhì)，使植物呈現(xiàn)各種顏色[6-7]?；ㄇ嗨卦诓煌琾H環(huán)境下結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)pH小于3，花青素主要以紅色的黃烊鹽離子為主，pH大于7時花青素轉(zhuǎn)換為藍(lán)色的醌式堿[8]。目前，已有學(xué)者根據(jù)這一特點，將花青素添加到不同成膜基質(zhì)中以研究花青素對復(fù)合膜性能的影響，并探討其在食品保鮮色敏指示領(lǐng)域的應(yīng)用[9-13]。冉銳敏等[2]以葡萄皮紅、納米氧化鋅和大豆分離蛋白為原料制備復(fù)合膜，發(fā)現(xiàn)葡萄皮紅的添加可提高納米氧化鋅和大豆分離蛋白的相容性，同時葡萄皮紅能與納米氧化鋅發(fā)揮協(xié)同作用增強(qiáng)大豆分離蛋白膜機(jī)械性能、耐水性能和熱穩(wěn)定性。Liu等[14]研究紫甘藍(lán)花青素添加量對羧甲基纖維素鈉/聚乙烯復(fù)合膜pH敏感性和物理性能方面的影響，發(fā)現(xiàn)花青素能增強(qiáng)羧甲基纖維素鈉和聚乙烯的相容性，較低添加量的花青素復(fù)合膜對豬肉新鮮度檢測比較高花青素添加量復(fù)合膜更敏感。封晴霞等[15]以藍(lán)莓花青素為新鮮度指示劑，與玉米淀粉和羧甲基纖維素制成混合膜，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素與兩種成膜基質(zhì)相容性良好，且復(fù)合膜能很好地應(yīng)用于牛肉鮮度檢測中。

紫甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitataf.rubra)作為十字花科(Cruciferae)農(nóng)作物的一種，在我國大部分地區(qū)均有種植[16]。本文從紫甘藍(lán)中提取花青素，以大豆分離蛋白為基材，探究不同紫甘藍(lán)花青素添加量對大豆分離蛋白復(fù)合膜阻隔、機(jī)械、熱穩(wěn)定性能的影響，利用掃描電鏡(SEM)、傅里葉紅外光譜(FTIR)、X-射線衍射儀(XRD)、差示量熱掃描儀(DSC)對膜進(jìn)行分析表征，并研究復(fù)合膜對不同pH環(huán)境的色敏性，以期為紫甘藍(lán)花青素制備新型指示膜的研發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫甘藍(lán)購于云南省昆明市農(nóng)貿(mào)市場；大豆分離蛋白購于德州谷神蛋白科技有限公司，食品級；檸檬酸、氫氧化鉀等均為分析純。

JHY-5000電子萬能試驗機(jī)，廈門金河源；IRPrestige-21傅里葉紅外光譜儀，日本導(dǎo)津；UV-2600紫外分光光度計，蘇州島津；D8 Advance X-射線衍射儀，德國布魯克；MIRA4掃描電鏡，捷克泰思肯；DSC204F1差示量熱掃描儀，德國耐馳；FD5-3冷凍干燥機(jī)，美國金西蒙。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫甘藍(lán)花青素制備

紫甘藍(lán)預(yù)處理 紫甘藍(lán)去除最外層皮、梗，蒸餾水洗凈，50 ℃干燥36 h，粉碎過60目篩，收集篩下樣品，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

紫甘藍(lán)花青素提取 紫甘藍(lán)粉按料液比1∶3(g/mL)加入0.3%檸檬酸與95%乙醇的混合溶液(1:2，v/v)于50 ℃水浴浸提3 h，抽濾，45 ℃旋蒸濃縮后凍干，得紫甘藍(lán)花青素(PCA)。

1.2.2 PCA/SPI復(fù)合膜制備

稱取6.00 g大豆分離蛋白、2.40 g丙三醇倒入裝有100 mL蒸餾水的燒杯中，溶解后置于恒溫水浴磁力攪拌鍋內(nèi)以80 ℃、500 r/min水浴50 min，冷卻至室溫后加入一定量PCA，500 r/min水浴10 min取出，300 W超聲10 min進(jìn)行消泡，得成膜液。成膜液緩慢倒于光滑塑料培養(yǎng)皿上，流延成膜，50 ℃干燥24 h后置于溫度為25 ℃、濕度為50%的恒溫恒濕箱內(nèi)平衡48 h，揭膜。為研究PCA添加量對復(fù)合膜物理性能的影響，PCA添加比例為0%、5%、10%、15%、20%(w/w)。

1.3 性質(zhì)測定

1.3.1 透O2速率

復(fù)合膜透O2速率按照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行測定。

1.3.2 透CO2速率

40 mm × 25 mm稱量瓶內(nèi)放入5.00 g KOH，用復(fù)合膜密封瓶口，石蠟密封。稱重后放于溫度為25 ℃、濕度為50%的恒溫恒濕箱內(nèi)7 d(168 h)，稱重并計算質(zhì)量差。復(fù)合膜透CO2速率依下式計算。

式中：QCO2為復(fù)合膜透CO2速率〔g/(m2·d)〕；Pm為測試時間內(nèi)稱量瓶的質(zhì)量差(g)；J為密封稱量瓶口的復(fù)合膜面積(1.26×10-3m2)；T為測試時間(d)。

1.3.3 透水蒸氣速率

40 mm × 25 mm稱量瓶內(nèi)放入5.00 g CaCl2，用復(fù)合膜密封稱量瓶口，石蠟密封。稱重記錄，放于溫度為25 ℃、濕度為50%的恒溫恒濕箱內(nèi)7 d，稱重并計算質(zhì)量差。復(fù)合膜透水蒸汽速率依下式計算。

式中：WVP為復(fù)合膜透水蒸氣速率〔g·mm/(m2·d·kPa)〕；Pm為測試時間內(nèi)稱量瓶的質(zhì)量差(g)；h為復(fù)合膜厚度(mm)；J為密封稱量瓶口的復(fù)合膜面積(1.26×10-3m2)；T為測試時間(d)；Δp為復(fù)合膜兩側(cè)水蒸汽壓差(kPa)。

1.3.4 不透明度

復(fù)合膜不透明度按照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行測定。復(fù)合膜裁剪成10 mm × 20 mm，放于空比色皿內(nèi)，以空比色皿為空白對照試驗組，測定復(fù)合膜吸光度值。復(fù)合膜不透明度按下式計算。

式中：C為復(fù)合膜不透明度(%)；A600為復(fù)合膜在600 nm處的吸光度值；h為復(fù)合膜厚度(mm)。

1.3.5 機(jī)械性能的測定

復(fù)合膜機(jī)械性能按照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行測定。機(jī)械性能包括斷裂伸長率(TS)和拉伸強(qiáng)度(EB)。

1.3.6 掃描電鏡分析方法

采用掃描電鏡(SEM)觀察復(fù)合膜微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。觀察復(fù)合膜截面時使用液氮對復(fù)合膜進(jìn)行脆斷，樣品噴金，觀察倍數(shù)10 000倍。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析方法

采用傅里葉紅外光譜分析復(fù)合膜官能團(tuán)。KBr壓片法制樣，取一定量樣品與KBr混合研磨后壓片，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.8 X-射線衍射分析方法

采用X-射線衍射分析儀對復(fù)合膜晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。衍射角2θ范圍為5～80°，掃描速度為5°/min。

1.3.9 差示量熱掃描儀分析方法

采用差示量熱掃描儀分析復(fù)合膜熱穩(wěn)定性?？折釄鍨閷φ战M，氮氣流速20 mL/min，升溫速率10 ℃/min，掃描溫度60～200 ℃。

1.3.10 花青素pH敏感性測定

為驗證PCA對pH的敏感性，將PCA配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，配制好的花青素溶液以1︰2(v/v)的比例加入到不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)緩沖溶液中，充分搖勻混合溶液后放于暗處靜置15 min，觀察混合溶液顏色變化并拍照記錄。

1.3.11 PCA/SPI復(fù)合膜色敏響應(yīng)

為驗證PCA/SPI復(fù)合膜對pH變化的敏感性，將復(fù)合膜裁剪成40 mm × 40 mm，浸沒于不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10、11)緩沖溶液中，復(fù)合膜顏色發(fā)生變化后用鑷子取出放于干凈玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，50 ℃干燥12 h，觀察PCA/SPI復(fù)合膜顏色變化并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 阻隔性能分析

阻隔性能是判定膜對食品保鮮程度的指標(biāo)，阻隔性能越好說明膜對食品具有較高的保鮮性能，復(fù)合膜阻隔性能主要包括透O2、透CO2和透水蒸氣[18]。

圖1為不同PCA添加量對復(fù)合膜阻隔性能的影響。與空白對照組(PCA添加量為0%)相比，添加PCA對復(fù)合膜透O2、透CO2率影響顯著(P<0.05)，當(dāng)PCA添加量為10%時，復(fù)合膜透O2、透CO2率最低。這可能是因為PCA加入SPI成膜基質(zhì)后，PCA與SPI之間形成的作用力使復(fù)合膜變?yōu)橹旅艿慕Y(jié)構(gòu)，延長氣體在復(fù)合膜中的遷移路徑，使得復(fù)合膜阻隔性能降低。PCA添加量較少時，所形成作用力無法阻隔大量氣體透過；但當(dāng)PCA添加量超過10%后，由于添加PCA量過多，導(dǎo)致SPI成膜基質(zhì)與PCA之間的氫鍵被破壞，使氣體阻率降低[17,19]。

水蒸氣透過率(WVP)是衡量復(fù)合膜隔絕空氣中水分的指標(biāo)，WVP越低說明復(fù)合膜隔絕空氣中水分的能力越強(qiáng)，對食品的保鮮效果越好[20]。圖1b可知，復(fù)合膜WVP隨PCA添加量呈現(xiàn)先降后增的趨勢，PCA添加量為15%的復(fù)合膜WVP值最低。這主要是因為SPI具有較高的親水性，因此PCA添加量為0%(純SPI膜)的WVP值最高，添加PCA后，純SPI膜透水性能得到改善使復(fù)合膜形成較為致密的結(jié)構(gòu)從而阻隔更多水分。

2.2 不透明度分析

不透明度是衡量復(fù)合膜作為食品包裝膜的另一重要指標(biāo)，不透明值越高，復(fù)合膜阻隔光的能力就越強(qiáng)，對食品的保鮮能力也越強(qiáng)[21]。

圖2為PCA添加量對復(fù)合膜不透明度的影響。PCA添加量從0%增至20%，PCA/SPI復(fù)合膜不透明度從74.12%增至124.02%，這是由于PCA添加量的增加填補了SPI基質(zhì)中的孔隙，PCA與SPI形成結(jié)構(gòu)更為致密的復(fù)合膜，阻礙光通過，同時PCA自身對于紫外光具有較好阻隔性能，使PCA/SPI復(fù)合膜不透明度與PCA添加量呈正相關(guān)關(guān)系[7,22]。

圖2 不同紫甘藍(lán)花青素添加量對復(fù)合膜不透明度的影響

2.3 機(jī)械性能分析

機(jī)械性能是衡量食品包裝膜的重要指標(biāo)，機(jī)械性能較好的食品包裝膜在運輸和儲存過程中能對食品起到較好的保護(hù)作用[15,19]。圖3為不同PCA添加量對PCA/SPI復(fù)合膜機(jī)械性能的影響。復(fù)合膜機(jī)械性能隨PCA添加量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢且復(fù)合膜在PCA添加量為15%時具有較好的機(jī)械性能。PCA/SPI復(fù)合膜TS和EB分別從0%PCA添加量的1.44 MPa、64.67%增至15%PCA添加量的2.14 MPa、129.38%。這可能是因為添加PCA后，PCA與SPI均勻混合形成致密結(jié)構(gòu)，提升復(fù)合膜機(jī)械性能，但當(dāng)PCA添加量超過15%時，過量的PCA會使SPI蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中鍵合作用減弱，加之PCA自身團(tuán)聚從而使復(fù)合膜機(jī)械性能降低。

圖3 不同紫甘藍(lán)花青素添加量對復(fù)合膜機(jī)械性能的影響

2.4 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡(SEM)分析復(fù)合膜表面、截面結(jié)構(gòu)，復(fù)合膜表面、截面越粗糙說明PCA與SPI之間的相容性越差[23]。圖4為不同PCA添加量復(fù)合膜表面、截面掃描電鏡。SPI膜(0%PCA添加量)表面不平整，存在許多小團(tuán)粒和空隙。隨著PCA添加量增加，膜內(nèi)空隙逐漸減少，當(dāng)PCA添加量超過15%時，復(fù)合膜表面SEM圖出現(xiàn)細(xì)小孔隙和顆粒。這主要是因為PCA能填充SPI蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得復(fù)合膜內(nèi)部空隙減少，結(jié)構(gòu)致密，同時PCA中羥基與SPI中的羥基形成分子間氫鍵，使復(fù)合膜機(jī)械性能和相容性得到改善。但PCA添加量為20%時，由于SPI自身的團(tuán)聚作用，PCA添加量越大，與SPI之間的相容性越差，導(dǎo)致復(fù)合膜存在許多細(xì)小孔隙。通過圖4(b)復(fù)合膜截面SEM圖可知，當(dāng)PCA添加量超過15%時，復(fù)合膜出現(xiàn)細(xì)小顆粒，說明添加過量花青素會使PCA與SPI之間的相容性變差，出現(xiàn)SPI團(tuán)聚，降低復(fù)合膜的機(jī)械性能[15]。這與之前復(fù)合膜阻隔性能、機(jī)械性能解釋一致。

(a) 復(fù)合膜表面SEM圖(b) 復(fù)合膜截面SEM圖

2.5 傅里葉紅外光譜分析

圖5為不同PCA添加量復(fù)合膜的傅里葉紅外光譜(FTIR)圖。與空白膜相比，PCA/SPI復(fù)合膜未出現(xiàn)新的特征峰，說明添加PCA未改變膜的化學(xué)性質(zhì)。SPI、PCA、PCA/SPI復(fù)合膜的O-H伸縮振動分別在3 466 cm-1、3 322 cm-1和3 292 cm-1處，復(fù)合膜O-H伸縮振動峰向右偏移，說明PCA和SPI之間為物理結(jié)合且復(fù)合膜中PCA和SPI分子間存在氫鍵相互作用[25]。PCA/SPI復(fù)合膜C-H伸縮振動峰在2 958 cm-1處，與2 871 cm-1處SPI的C-H伸縮振動相比向左發(fā)生偏移，說明添加PCA后對復(fù)合膜C-H有明顯影響作用。復(fù)合膜C=O伸縮振動峰在1 637 cm-1處，N-H彎曲的吸收峰分別在1 538 cm-1和1 260 cm-1處[1,5]。以上結(jié)果說明PCA和SPI之間具有較好的相容性。

圖5 不同紫甘藍(lán)花青素添加量復(fù)合膜紅外光譜

2.6 X-射線衍射分析

通過X-射線衍射(XRD)分析不同PCA添加量對復(fù)合膜晶體結(jié)構(gòu)和相容性的影響，出現(xiàn)高而窄的衍射峰表明樣品結(jié)晶度高，低而寬的衍射峰則說明樣品結(jié)晶度低[14]。PCA、SPI和純SPI膜在2θ為16.6°處有一高而窄的衍射峰，此外29.1°處還有一較弱衍射峰，這說明PCA、SPI和純SPI膜結(jié)晶性高[7]。添加PCA后，復(fù)合膜在2θ為9.1°處的衍射峰消失，僅在2θ為26.6°時存在較弱衍射峰，說明PCA與成膜基質(zhì)之間相容性良好，同時PCA和SPI中的氫鍵形成范德華力使復(fù)合膜結(jié)晶性減弱[7]。

圖6 不同紫甘藍(lán)花青素添加量復(fù)合膜XRD光譜圖

2.7 差示量熱掃描儀分析

通過樣品在監(jiān)測溫度范圍內(nèi)出現(xiàn)的吸熱峰分析樣品熔融溫度[19,25]。由圖7可知，與SPI相比，純SPI膜熱穩(wěn)定性較差，添加PCA可提高復(fù)合膜熔融溫度。純SPI膜熔融溫度為87.26 ℃，當(dāng)PCA添加量為15%時，復(fù)合膜熔融溫度最高，為138.47 ℃。這可能是因為添加PCA后SPI和PCA分子之間形成了強(qiáng)烈的分子間作用力，需要更多的熱能對這些作用力進(jìn)行解離。PCA添加量較少時，PCA與SPI之間形成的作用力較弱，所需熱能也較少；結(jié)合SEM可以看出PCA添加過量時，花青素與大豆分離蛋白復(fù)合膜表面分布不均影響復(fù)合膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使20%PCA添加量復(fù)合膜的熔融溫度下降至101.84 ℃。在食品材料包裝中，提高復(fù)合膜熱穩(wěn)定性可延長食品貨架期。

圖7 不同紫甘藍(lán)花青素添加量對復(fù)合膜熱性能的影響

2.8 復(fù)合膜pH值響應(yīng)性分析

圖8a為PCA在pH3～11環(huán)境下的顯色響應(yīng)。當(dāng)pH為3時，PCA為亮紅色，pH為4～7時，PCA由亮紅色變?yōu)闇\紅色，pH為8時，PCA為紫色，隨著溶液環(huán)境堿性增大，PCA從淺綠變?yōu)樯罹G。這主要是由于花青素的四種結(jié)構(gòu)在不同酸堿環(huán)境下引起的變化[15]。當(dāng)花青素在pH為2～3的環(huán)境中時，其主要以紅色的黃烊鹽離子為主，隨著pH值的增加，花青素中陽離子與OH-離子結(jié)合后形成無色甲醇假堿，紅色逐漸變淡，當(dāng)pH大于8后，花青素部分結(jié)構(gòu)在堿性條件下極不穩(wěn)定，發(fā)生去質(zhì)子反應(yīng)，使PCA逐漸呈現(xiàn)藍(lán)綠色[11]。

圖8b為不同PCA添加量復(fù)合膜在pH3～11環(huán)境下的顯色響應(yīng)。各PCA添加量復(fù)合膜在pH3～11環(huán)境下顏色變化趨勢大致相同，均由酸性條件下的紅色逐漸變?yōu)闇\紅最后變?yōu)榫G色，這與PCA在不同pH環(huán)境下的顯色響應(yīng)變化一致，但與PCA本身顏色存在一定差異。PCA添加量為15%時，復(fù)合膜顏色響應(yīng)變化最為明顯。以上分析表明，以15%PCA添加量制備的復(fù)合膜對pH反應(yīng)敏感，可以通過復(fù)合膜顏色變化對食品鮮度進(jìn)行監(jiān)測。

(a) PCA(b) PCA/SPI復(fù)合膜

3 結(jié)論

本文研究PCA添加量對紫甘藍(lán)花青素/大豆分離蛋白復(fù)合膜性能及其對pH色敏性的影響。結(jié)果表明，15%PCA添加量的復(fù)合膜在機(jī)械性能、阻隔性能方面均有較好表現(xiàn)；復(fù)合膜不透明度隨PCA添加量增加呈現(xiàn)上升趨勢；SEM分析表明，PCA與成膜基質(zhì)之間相容性較好；FTIR分析表明，添加PCA后復(fù)合膜化學(xué)結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變；XRD分析表明，添加PCA會降低復(fù)合膜結(jié)晶度；DCS分析表明，PCA添加量為15%時的復(fù)合膜熱穩(wěn)定性最好，熔融溫度為138.47 ℃。通過PCA和復(fù)合膜pH響應(yīng)性分析表明，花青素和復(fù)合膜在pH3～11環(huán)境下的變化趨勢一致，過程為亮紅色—淺紅色—紫色—淺綠—深綠，同時15%PCA添加量復(fù)合膜在不同pH環(huán)境下顏色變化最敏銳。