細(xì)胞角蛋白的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性研究

司 海 劉 然 熊中原 曹邦偉

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)教研室，山東濰坊 261053；2.北京市平谷區(qū)醫(yī)院病理科，北京 101200；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤中心，北京 100050)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居高不下。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]顯示：其發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中分別位列第3位(10.00%)和第2位(9.40%)；在中國(guó)，結(jié)直腸癌在所有惡性腫瘤中的發(fā)病率和病死率分別位列第2位(12.20%)和第5位(9.50%)[2]。因此，探究新的分子標(biāo)志物對(duì)提高結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷與診療具有重要意義。

細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)是上皮細(xì)胞骨架的主要組成部分，主要作用是維持上皮組織的穩(wěn)定和完整，同時(shí)也是診斷病理學(xué)中用于檢測(cè)和分類上皮源性腫瘤的特異性標(biāo)志物[3-6]。腺癌一般以單層上皮細(xì)胞角蛋白為主，特別是CK7、8、18～20[7]。因此，CK的表達(dá)有可能作為結(jié)直腸癌較為理想的輔助診斷指標(biāo)。本研究檢測(cè)了結(jié)直腸癌及配對(duì)的癌旁正常組織中CK7、8、18～20的表達(dá)并分析其差異，目的是探究其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取北京市平谷區(qū)醫(yī)院2013年至2021年行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的病理組織蠟塊標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；②首次手術(shù)，且術(shù)前均未行放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)、化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱化療)及靶向治療。③病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他原發(fā)惡性腫瘤者。最終納入200例，其中男性100例、女性100例。本研究經(jīng)市平谷區(qū)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織中CK7、8、18～20的表達(dá)

所有標(biāo)本均經(jīng)10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)法采用MaxVision法，石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化和沖洗，并用抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗為鼠抗人CK7(貨號(hào)：YM3054)、CK8(貨號(hào)：YM3055)、CK18(貨號(hào)：YM6166)、CK19(貨號(hào)：YM6577)和CK20(貨號(hào)：YM6037)均購(gòu)自Immunoway公司；二抗為MaxVision/HRP〗試劑(貨號(hào)：KIT-5002)購(gòu)自中國(guó)福州邁新生物科技有限公司。DAB顯色，復(fù)染并封片。染色結(jié)果判斷：根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率分析CK7、8、18～20的表達(dá)水平[8]。染色判定標(biāo)準(zhǔn)為(細(xì)胞質(zhì)著色情況)：無(wú)著色，0分；弱著色(淺黃色)1分；中等強(qiáng)度著色(棕黃色)2分；強(qiáng)著色(棕褐色)，3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率的判定標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞質(zhì)著色為黃色或棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì)2分；51%～75%計(jì)3分；≥76%計(jì)4分。最終評(píng)分為兩項(xiàng)評(píng)分之積，并定義0～2分為陰性，3～12分為陽(yáng)性。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果最終由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家雙盲判斷，評(píng)分如有差異，取兩者平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

納入的200例患者，年齡27～89(65.69±10.46)歲，<65歲94例、≥65歲106例；結(jié)腸癌100例，直腸癌100例；高分化5例、中分化170例、低分化25例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移85例(42.50%)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移6例(3.00%)。Ⅰ期33例(16.50%)、Ⅱ期75例(37.50%)、Ⅲ期86例(43.00%)、Ⅳ期6例(3.00%)。

2.2 CK7、8、18～20在結(jié)直腸癌與癌旁組織中的表達(dá)

CK7主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中表達(dá)陰性(圖1A)；在癌旁組織中，1.00%(2/200)的病例呈陽(yáng)性表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.478)。CK8主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中有99.00%(198/200)的病例陽(yáng)性表達(dá)(圖1B)；在癌旁組織中，91.50%(183/200)病例陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。CK18主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中有94.50%(189/200)的病例表達(dá)陽(yáng)性(圖1C)；在癌旁組織中有25.00%(50/200)的病例表達(dá)陽(yáng)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。CK19主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中有8.00%(16/200)的病例表達(dá)陽(yáng)性(圖1D)；在癌旁組織中有3.00%(6/200)的表達(dá)陽(yáng)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。CK20主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中有79.50%(159/200)的病例陽(yáng)性表達(dá)(圖1E)；在癌旁組織中有11.00%(22/200)的病例表達(dá)陽(yáng)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見表1。

表1 結(jié)直腸癌癌組織和癌旁正常組織中CK7、8、18～20的表達(dá)

圖1 CK7、8和CK18～20在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)

2.3 CK7、8、18～20的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

CK7在癌及癌旁組織中均缺乏表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與患者臨床病理特征不相關(guān)。CK8和CK18～20的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期無(wú)關(guān)。CK8與腫瘤的浸潤(rùn)深度相關(guān)(P=0.048)，當(dāng)腫瘤穿透固有肌層到達(dá)漿膜下層時(shí)，CK8的陽(yáng)性表達(dá)率更高。CK19與腫瘤有無(wú)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.027)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，CK19的陽(yáng)性表達(dá)率更高。CK20與腫瘤的分化程度相關(guān)(P=0.010)，在中高分化的腫瘤組織中，CK20陽(yáng)性表達(dá)率更高。詳見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者癌組織中CK8、18～20的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 結(jié)直腸癌危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

以結(jié)直腸癌為因變量納入條件Logistic回歸分析，單因素結(jié)果顯示，CK8、CK18～20陽(yáng)性為患結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，CK18和CK20陽(yáng)性為患結(jié)直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。詳見表3。

表3 結(jié)直腸癌危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

3 討論

細(xì)胞角蛋白是臨床上常見的腫瘤標(biāo)志物之一, 其與上皮細(xì)胞化生、惡變、腫瘤轉(zhuǎn)移等病變有關(guān)[9-10]。CK根據(jù)等電點(diǎn)的不同分為酸性(Ⅰ型)和堿性(Ⅱ型)形式，Ⅰ型細(xì)胞角蛋白(CK9～CK20)相對(duì)分子質(zhì)量小，呈酸性; 而Ⅱ型細(xì)胞角蛋白(CK1～CK8)相對(duì)分子質(zhì)量較大，呈堿性。

本研究顯示CK7在結(jié)直腸癌和癌旁組織中都缺乏表達(dá)，但有研究[11]顯示在部分結(jié)直腸癌亞型中有表達(dá)，比如在BRAF突變的微衛(wèi)星穩(wěn)定型(microsatellite stable,MSS)結(jié)直腸癌中，有39%的病例表達(dá)CK7。目前關(guān)于CK8在結(jié)直腸癌中的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)CK8在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組織且與腫瘤的浸潤(rùn)深度成正相關(guān)。但也有研究顯示[12]，CK8在結(jié)直腸癌中的低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關(guān)，其低表達(dá)提示腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲性且預(yù)后更差，并且CK8的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，造成這種差異的原因可能和本研究病例數(shù)目過(guò)少有關(guān)。在本研究中，CK18在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組織，與腫瘤患者的臨床病理特征關(guān)聯(lián)性不高。也有研究[13-14]顯示CK18過(guò)表達(dá)可促進(jìn)PI3k-AKT信號(hào)通路及EMT，加快結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移，從而與癌癥患者的生存率降低相關(guān)，可作為大腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)。有報(bào)道[15]稱CK19作為敏感標(biāo)志物可提高大腸癌的早期診斷，在本研究中也發(fā)現(xiàn)CK19在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組織，同時(shí)其表達(dá)與腫瘤患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，因此其高表達(dá)對(duì)于診斷和判斷患者預(yù)后具有一定的參考意義。CK20在胃腸上皮細(xì)胞以及由這些細(xì)胞衍生的腫瘤中都有表達(dá)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，CK20在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織，并且其表達(dá)陽(yáng)性率隨著腫瘤分化程度的降低而降低。也有研究[18]顯示，結(jié)直腸癌患者血清中CK20 mRNA的表達(dá)明顯升高，可作為結(jié)直腸癌診斷的特異性血清標(biāo)志物。

綜上所述，CK7在結(jié)直腸癌癌組織和癌旁組織中都缺乏表達(dá)；CK8、18～20在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到一定的促進(jìn)作用，并且其表達(dá)上調(diào)對(duì)于結(jié)直腸癌的診斷也具有一定的指導(dǎo)意義。筆者還發(fā)現(xiàn)CK18、CK19和CK20在癌組織中的表達(dá)分別與腫瘤的浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)。因此CK在結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和分化中可能起到一定的作用，從而對(duì)臨床上判斷結(jié)直腸癌的惡性程度起到一定參考意義。但因本研究病例數(shù)目較少，且未深入探究CK與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，具有一定的局限性，后期將會(huì)擴(kuò)大樣本量，探究其在結(jié)直腸癌患者預(yù)后中的作用及其機(jī)制。