外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p對胃癌MGC-803細胞增殖及凋亡的影響

高正興， 趙琳

(北京市大興區(qū)人民醫(yī)院體檢中心，北京市 102600)

手術(shù)是胃癌治療的首選方法，但治療期間的輔助化療，具有靶向性差、不良反應(yīng)多等缺點[1]。外泌體是具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，直徑40～100 nm，可轉(zhuǎn)運多種生物活性物質(zhì)，并參與細胞間信號傳導(dǎo)[2]。在腫瘤微環(huán)境中，癌細胞分泌的外泌體和miRNAs可以被其他細胞內(nèi)化，在外泌體中穿梭并傳遞給受體細胞，從而介導(dǎo)基因表達[3]。因此，與目標miRNA相結(jié)合的治療可能是治療耐藥腫瘤的一個方向[4]。miR-324-5p在胃癌組織中呈差異性表達，并參與胃癌的惡性進展[5]。同時，miR-324-5p在肝癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中均表達降低，并參與細胞生長調(diào)控[6]。目前尚無外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p對胃癌小鼠移植瘤生長的研究。本研究探討了外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p對胃癌小鼠移植瘤生長的影響，為外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p治療胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細胞株MGC-803(上海通派公司)，RPIM-1640培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Hyclone公司)，Exo-quick-TC exosomes外泌體提取試劑盒(上海蘭興公司)，PKH26試劑盒(美國Sigma公司)，Cy3-miR-324-5p mimic(5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC-3′)和Lipofect轉(zhuǎn)染試劑盒(北京天根試劑公司)，細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent protein kinase inhibitor 1A,p21)、β-actin、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)和HRP標記山羊抗鼠二抗(美國Santa Cruz公司)，BIO-RAD ChemiDocTM成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，TRIzol試劑盒、MTT、細胞凋亡檢測試劑盒(美國Amresco公司)。雌性BALB/c-nu裸鼠30只[(蘇州斯萊克生物公司，動物合格證號為SXCK(蘇)2020-0001]，體質(zhì)量(22±1.27) g，SPF級，6～8周齡。

1.2 細胞培養(yǎng)和外泌體提取

取對數(shù)生長期MGC-803細胞于無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h收集上清并離心30 min(2 000 r/min)，去除細胞碎片并過濾，將Exo-quick-TC exosomes外泌體提取以1∶5的比例加入過濾液中，混勻，4 ℃過夜；離心，棄上清，管壁白色沉淀即為外泌體。將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中，用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，調(diào)整質(zhì)量濃度為100 mg/L，得到外泌體，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic的制備

取質(zhì)量濃度為200 mg/L Cy3-miR-324-5p mimic溶于1.2提取的外泌體混懸液中，定容至1 mL，在恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h(37 ℃)，離心10 min(3 000 r/min)，用孔徑0.22 μm過濾器進行過濾后離心120 min(12 000 r/min，4 ℃)，棄上清，將沉淀溶于100 μL磷酸鹽緩沖液中得到外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic混懸液。

1.4 MGC-803細胞攝取外泌體檢測

向外泌體混懸液和外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic混懸液加入4 μL PKH26稀釋液，混勻后靜置3 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色，用孔徑0.22 μm過濾器進行過濾后離心120 min(2 000 r/min，4 ℃)，將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中得到PKH26標記的外泌體和PKH67標記的外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic。取對數(shù)生長期MGC-803細胞，接種于96孔板中，待細胞融合后分別加入PKH26標記的外泌體和PKH67標記的外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic，24 h后，調(diào)整細胞為1×106個/mL，37 ℃ DiO染色10 min，離心棄上清，觀察細胞攝取情況。攝取效率(%)=轉(zhuǎn)染陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5 細胞分組

實驗分為對照組、外泌體組和miR-324-5p mimic組。對照組細胞不進行處理，外泌體組加入外泌體混懸液，miR-324-5p mimic組加入外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic混懸液。

1.6 MTT法檢測細胞增殖率

按1.5分組方法處理細胞，44 h后加入MTT(50 μL/孔)，后加入二甲基亞砜，甲醛經(jīng)固定后0.1%結(jié)晶紫液染色30 min，用酶標儀檢測各孔OD值。細胞增殖率(%)=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(空白對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.7 流式細胞法檢測細胞凋亡率

按1.5分組方法處理細胞，48 h后用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，用Annexin V Binding Solution(1×)調(diào)整細胞為1×106/mL。一次性加入5 μL Annexin V-FITC與碘化丙啶，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 移植瘤模型建立

按1.5分組方法處理MGC-803細胞，在每只裸鼠左腋下注射0.2 mL細胞懸液(1×108個/mL)，每組3只，第20天處死大鼠，分離瘤體，對瘤體進行稱重，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.9 qRT-PCR檢測瘤體中miR-324-5p、p21、CyclinD1和LC3 mRNA的表達

取部分凍存的瘤體組織，制成勻漿，加入1 mL TRIzol進行總RNA提取，根據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒說明書嚴格進行試驗，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司)：miR-324-5p F：5′-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3，R：5′-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3′；p21 F：5′-GAGTTCTCACTTTCATCTGTT-3′，R：5′-TGTCCGATCTACTTTC CC-3′；CyclinD1 F：5′-TCCGACCGGCCTTTCAAGCAG-3′，R：5′-GAGAACCTGACCAGAACTCCCAG-3′；LC3 F：5′-AAACGCATTTGCCATCACAGT-3′，R：5′-GTGAGG ACTTTGGGTGTGGTTC-3′；GAPDH F：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3，R：5′-AGTCTTCTGGGTGGCA GTGAT-3′。U6作為內(nèi)參。

1.10 Western blotting檢測蛋白表達

瘤體組織加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解(30 min)離心取上清，進行電泳(20 μg/孔)，蛋白質(zhì)經(jīng)8%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉，將膜與p21、CyclinD1和LC3抗體進行孵育，過夜(4 ℃)，洗膜后與相應(yīng)的HRP標記山羊抗鼠二抗孵育30 min，使用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，用BIO-RAD ChemiDocTM成像系統(tǒng)進行光密度定量，β-actin為內(nèi)對照。

1.11 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 MGC-803細胞攝取外泌體效率

外泌體組、miR-324-5p mimic組MGC-803細胞攝取外泌體效率分別為(60.3±1.2)%和(57.4±1.1)%(圖1)。

圖1 MGC-803細胞攝取外泌體效率(DiO染色,400×)

2.2 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對MGC-803細胞增殖和凋亡的影響

與對照組和外泌體組比較，miR-324-5p mimic組MGC-803細胞增殖率降低，凋亡率增加(P<0.05；表1和圖2)。

表1 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對MGC-803細胞增殖、凋亡的影響

圖2 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對MGC-803細胞增殖、凋亡的影響A為細胞增殖圖(結(jié)晶紫染色，400×);B為細胞凋亡圖。

2.3 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對移植瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響

與對照組和外泌體組比較，miR-324-5p mimic組裸鼠移植瘤質(zhì)量降低、抑瘤率增加(P<0.05；表2)。

表2 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對移植瘤質(zhì)量和抑瘤率的影響(n=3)

2.4 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對移植瘤miR-324-5p、p21、CyclinD1、LC3 mRNA及蛋白的影響

與對照組和外泌體組比較，miR-324-5p mimic組裸鼠移植瘤中CyclinD1 mRNA與蛋白降低，miR-324-5p、p21、LC3 mRNA與p21、LC3蛋白增加(P<0.05；表3和圖3)。

表3 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對移植瘤miR-324-5p、p21、CyclinD1和LC3 mRNA的影響(n=3)

圖3 外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic對移植瘤中p21、CyclinD1和LC3蛋白的影響a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與外泌體組比較。

3 討 論

目前，關(guān)于胃癌的發(fā)病機制尚不明確，由于其高發(fā)病率和高死亡率，當務(wù)之急是尋找積極有效的治療方法[7]。有研究表明，腫瘤來源的外泌體能傳遞細胞間信號，能與靶細胞結(jié)合其所攜帶的生物分子經(jīng)胞吞方式被接收，從而釋放到靶細胞內(nèi)并發(fā)揮作用[8]。外泌體具有極強的癌細胞親和力，能夠靶向性選擇癌細胞，是新型的納米級藥物運輸載體[9]。外泌體對miRNA具有高選擇性，可由生物工程途徑將外泌體攜帶的miRNA轉(zhuǎn)移至靶細胞，具有靶向治療潛力[10]。目前，外泌體已成功將小干擾RNA、miRNA及紫杉醇等藥物轉(zhuǎn)運至靶細胞[4]。

研究表明，miR-324-5p是腫瘤細胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與癌細胞的增殖、侵襲[11]。腫瘤細胞來源外泌體可參與腫瘤進展，外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p后可通過與相應(yīng)抗體結(jié)合從而激活靶細胞，在體外抗腫瘤中具有明顯效果[12]。肝癌細胞中，高表達miR-324-5p導(dǎo)致癌細胞侵襲性和轉(zhuǎn)移性降低，抑制miR-324-5p時肝癌細胞侵襲性增強[13]。p21基因是一種細胞周期抑制因子，與細胞衰老有關(guān)[14]。由于p21在細胞周期調(diào)控中的核心作用，p21被認為是一種真正的腫瘤抑制因子，p21在其N末端結(jié)合細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)4/6、CDK2和CDK1[15]。為了實現(xiàn)CDK抑制，p21必須同時與Cyclin和CDKs結(jié)合，而p21水平依賴于p53，p21介導(dǎo)p53依賴的G1期阻滯，以應(yīng)對發(fā)生在S期的DNA損傷[16]。因此p53/p21可能在細胞周期凋亡中具有重要作用。p21是p53的一個已知靶點，與多種Cyclin-CDK復(fù)合物相互作用以控制細胞周期進程。本研究制備外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic載體，經(jīng)MGC-803細胞攝取，結(jié)果顯示，外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic能抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic可提高移植瘤miR-324-5p和p21 mRNA及蛋白水平，降低CyclinD1 mRNA及蛋白水平，減緩移植瘤生長。提示外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p可能在胃癌腫瘤細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，其研究可能對胃癌靶向治療具有重要意義。

受各類因素影響，胃癌患者初次診斷時已進入進展期并存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與浸潤等[17]。胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的初始表現(xiàn)為自噬紊亂，LC3是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，通過抑制或耗盡上游復(fù)合物，將減少自噬體的數(shù)量，促進細胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic后可以提高移植瘤組織中LC3 mRNA水平，表明外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p對于腫瘤細胞自噬和凋亡具促進作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p和Mtfr1在心肌細胞凋亡和心肌梗死過程中具有互補的表達模式[19]，提示miR-324-5p可通過下調(diào)Mtfr1抑制線粒體分裂、凋亡，這與本研究結(jié)果相似。然而，miR-324-5p的作用通路比較復(fù)雜，對移植瘤的影響機制還不明確，本研究將在后續(xù)深入分析。

綜上所述，外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p能抑制胃癌小鼠移植瘤細胞增殖和促進凋亡，其可能是通過對p21和LC3表達上調(diào)和CyclinD1表達下調(diào)，從而促進細胞自噬，降低移植瘤質(zhì)量。