右美托咪定聯(lián)合布比卡因通過(guò)cAMP/PKA-CREB-BDNF信號(hào)通路對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)阻滯效果的影響

鄭龍蛟， 王志萍

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省徐州市 221009；2.無(wú)錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，江蘇省無(wú)錫市 214000；3.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇省徐州市 221000)

全身麻醉聯(lián)合超聲引導(dǎo)下區(qū)域神經(jīng)阻滯能有效降低術(shù)中麻醉藥物用量，并減少不良反應(yīng)。局部麻醉藥在區(qū)域神經(jīng)阻滯中的作用時(shí)間有限，且高劑量容易誘發(fā)神經(jīng)毒性[1]。臨床上為延長(zhǎng)神經(jīng)阻滯作用時(shí)間，嘗試聯(lián)合腎上腺素及可樂(lè)定等其他局部麻醉輔助藥物以增強(qiáng)外周神經(jīng)阻滯效果[2]。右美托咪定通過(guò)激活中樞神經(jīng)α2受體發(fā)揮鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛作用，且對(duì)中樞呼吸抑制程度較小，臨床運(yùn)用廣泛[3]。多項(xiàng)研究顯示，局部麻醉藥聯(lián)合右美托咪定不但可以提高蛛網(wǎng)膜下腔和硬膜外阻滯效果，也可以延長(zhǎng)外周神經(jīng)阻滯作用時(shí)間，加快神經(jīng)阻滯效果，改善術(shù)后鎮(zhèn)痛作用[4-5]。本研究分析右美托咪定聯(lián)合布比卡因?qū)Υ笫笞巧窠?jīng)阻滯效果并探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

選取SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠36只，8～10周齡，體質(zhì)量180～220 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將其隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、布比卡因組(Bup組)、右美托咪定+布比卡因組(Dex組)和毛喉素+右美托咪定+布比卡因組(Fors組)，每組9只。

所有大鼠均參照文獻(xiàn)[6]制備大鼠坐骨神經(jīng)阻滯模型。吸入2%～3%七氟醚麻醉下，俯臥位固定、備皮、消毒。于股骨內(nèi)測(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)節(jié)處向遠(yuǎn)端方向切開(kāi)皮膚，鈍性分離各層肌肉組織，暴露股二頭肌，充分暴露坐骨神經(jīng)及其3個(gè)分支。選擇坐骨神經(jīng)周圍為注射點(diǎn)，分別對(duì)Bup組、Dex組及Fors組大鼠注射0.5%布比卡因0.2 mL、1.0%布比卡因0.1 mL+6 μg/kg右美托咪定0.1 mL、1.0%布比卡因0.1 mL+6 μg/kg右美托咪定0.1 mL+毛喉素0.1 mL。其中Fors組先注射0.1 mL毛喉素，10 min后再注射右美托咪定和布比卡因，其他3組均加入0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)注射，Sham組注射0.2 mL生理鹽水。注射完畢后逐層縫合切口，并以抗生素消毒傷口預(yù)防感染，整個(gè)操作過(guò)程約10 min。術(shù)畢放入飼養(yǎng)籠，分別于大鼠復(fù)位反射恢復(fù)后按時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)觀察。

1.2 大鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期測(cè)定

采用KW-RB型智能熱板測(cè)痛儀(南京卡爾文生物公司)于阻滯前及阻滯后10、20、30、60、120、180、240、300、360 min進(jìn)行大鼠右后肢熱踏板試驗(yàn)，溫度55 ℃，按照先左后右順序交替測(cè)定后足熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)[7]，每只后肢重復(fù)3次，間隔5 min，取平均值。為避免組織損傷，監(jiān)測(cè)時(shí)間設(shè)定為10 s，如果超過(guò)10 s仍然未出現(xiàn)縮足反應(yīng)，則停止刺激，PWTL記為10 s。計(jì)算最大效應(yīng)百分比(maximum percentage effect，MPE)來(lái)反應(yīng)感覺(jué)阻滯程度，其中基礎(chǔ)PWTL以阻滯前的PWTL為基線值。MPE(%)=[(給藥后PWTL-基礎(chǔ)PWTL)/(10-基礎(chǔ)PWTL)]×100%。

1.3 大鼠后肢伸姿推力測(cè)定

于阻滯前及阻滯后10、20、30、60、90、120、150、180 min進(jìn)行大鼠后肢伸姿推力(elevated posture thrust，EPT)測(cè)定[8]：將大鼠直立上提，保持后肢伸展姿勢(shì)，以便遠(yuǎn)端足趾和足尖支撐體質(zhì)量，置于電子秤上方，大鼠后肢伸展所顯示的數(shù)值即為EPT(g)。

1.4 免疫組化

坐骨神經(jīng)阻滯后12 h，取各組大鼠3只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注大鼠，分離并取L4～L6節(jié)段脊髓，經(jīng)多聚甲醛后浸泡固定24 h，再進(jìn)行蔗糖梯度脫水后，置入恒冷箱切片機(jī)進(jìn)行冠狀冰凍切片(30 μm)，冰凍切片室溫晾干15 min后置于含10%正常山羊血清的PBS中室溫封閉1 h，SP法免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，p-CREB)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果2.1 大鼠各時(shí)點(diǎn)MPE、EPT的比較

Bup組和Fors組在阻滯后10～180 min，Dex組在阻滯后10～360 min MPE較Sham組明顯升高(P<0.05)；Dex組在阻滯后10～360 min MPE較Bup組明顯升高(P<0.05)；Fors組在阻滯后的10～360 min MPE較Dex組明顯降低(P<0.05；表1)。Bup組在阻滯后10～90 min，Dex組和Fors組在阻滯后10～120 min EPT較Sham組明顯降低(P<0.05)；Dex組和Fors組在阻滯后10～120 min EPT較Bup組降低(P<0.05；表2)。

表1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)MPE的比較 單位：%

表2 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)EPT的比較 單位：g

2.2 各組大鼠脊髓cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表達(dá)

與Sham組比較，其他3組cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表達(dá)水平均下降(P<0.05)；與Bup組比較，Dex組各指標(biāo)較Bup組降低(P<0.05)；Fors組各指標(biāo)表達(dá)水平較Dex組明顯升高(P<0.05；圖1)。

圖1 各組大鼠脊髓中cAMP、PKA、p-CREB和BDNF蛋白表達(dá)水平A為典型免疫組織圖(SP法，40×)；B為蛋白表達(dá)水平的柱狀統(tǒng)計(jì)圖。a為P<0.05，與Sham組比較；b為P<0.05，與Bup組比較；c為P<0.05，與Dex組比較。

3 討 論

臨床發(fā)現(xiàn)單次給予局部麻醉藥物產(chǎn)生的神經(jīng)阻滯時(shí)效相對(duì)短暫，而穿刺部位連續(xù)給藥以及增加藥物劑量雖然可延長(zhǎng)神經(jīng)阻滯時(shí)間，但存在誘發(fā)神經(jīng)毒性和感染等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道指出[9-10]，通過(guò)聯(lián)合使用局部麻醉藥物佐劑包括阿片類或α2受體激動(dòng)劑等可以提高中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)阻滯的效果及延長(zhǎng)阻滯時(shí)間。Singh等[11]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定聯(lián)合羅哌卡因可以延長(zhǎng)尺神經(jīng)阻滯的持續(xù)時(shí)間。而本研究結(jié)果顯示，相比單獨(dú)使用布比卡因，右美托咪定聯(lián)合布比卡因可以延長(zhǎng)大鼠坐骨神經(jīng)阻滯的持續(xù)效果和時(shí)間，增強(qiáng)鎮(zhèn)痛效能。

右美托咪定具有抑制感覺(jué)神經(jīng)元超極化激活環(huán)核苷酸門控陽(yáng)離子(hyperpolarization cyclic nucleotide，HCN)電流的作用，以此降低神經(jīng)元興奮性，達(dá)到鎮(zhèn)痛效果[12]。Parsons等[13]報(bào)道，當(dāng)胞內(nèi)cAMP水平增加時(shí)，可直接作用HCN通道，并引起通道的半數(shù)激活電位向去極化方向偏移，以增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性。而毛喉素是cAMP類似物，可以刺激哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶活化，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。本文結(jié)果顯示，相比sham組，其余3組在阻滯后的一段時(shí)間內(nèi)MPE明顯升高，EPT明顯降低，說(shuō)明3個(gè)干預(yù)組均成功阻斷了坐骨神經(jīng)的傳導(dǎo)功能；相比Dex組，加入毛喉素的Fors 組大鼠MPE 明顯縮短，MPE的縮短意味著神經(jīng)反射靈敏度升高，表明毛猴素能夠抑制右美托咪定對(duì)坐骨神經(jīng)的阻滯作用，同時(shí)也說(shuō)明cAMP介導(dǎo)的HCN通道是右美托咪定的鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)之一。

史艷燕等[14]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可以通過(guò)降低BDNF和NF-κB的表達(dá)緩解神經(jīng)病理性疼痛。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛傳導(dǎo)過(guò)程中，BDNF的表達(dá)量不僅僅在初級(jí)傳入神經(jīng)元中有所增加，在二級(jí)傷害感受神經(jīng)元中也有所增加。BDNF作為疼痛的介質(zhì)或調(diào)節(jié)劑，用于調(diào)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活。本文單獨(dú)注射布比卡因降低脊髓中cAMP、PKA、p-CREB和BDNF的表達(dá)水平，而右美托咪定聯(lián)合布比卡因有助于促進(jìn)cAMP/PKA-CREB-BDNF信號(hào)通路的抑制。提示該信號(hào)通路可能參與了右美托咪定延長(zhǎng)阻滯時(shí)效的機(jī)制。

綜上所述，右美托咪定聯(lián)合布比卡因相比單獨(dú)使用布比卡因，延長(zhǎng)了大鼠坐骨神經(jīng)感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)阻滯效果和持續(xù)時(shí)間，且延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)阻滯時(shí)效的機(jī)制與抑制cAMP/PKA-CREB-BDNF信號(hào)通路有關(guān)。