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    利多卡因?qū)σ认侔┘?xì)胞PANC-1增殖、凋亡和STING/IRF3/IFN-β通路的影響

    2022-06-29 01:03:02劉炯汪向飛江斌
    關(guān)鍵詞:利多卡因胰腺癌試劑盒

    劉炯, 汪向飛, 江斌

    (十堰市太和醫(yī)院肝膽胰外科診療中心,湖北省十堰市 444200)

    胰腺癌是全球第四大癌癥相關(guān)死亡原因,其5年總生存率低于7%,在所有癌癥中最低[1],探索胰腺癌的新治療策略具有重要意義。某些麻醉藥不僅可用于手術(shù)鎮(zhèn)痛,還具有一定抗癌作用[2-3]。局部麻醉劑利多卡因具有抗炎、抗腫瘤等特殊功效,但其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚[4]。干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)是一種跨膜蛋白,由環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)產(chǎn)生的環(huán)二核苷酸激活。STING通過促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的招募和激活來調(diào)節(jié)實(shí)體腫瘤的免疫抑制腫瘤微環(huán)境。STING激活導(dǎo)致了TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)的激活,磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)誘導(dǎo)干擾素-β(interferon-β,IFN-β)產(chǎn)生,從而觸發(fā)腫瘤抗原交叉遞呈和抗腫瘤T細(xì)胞免疫反應(yīng)[5]。激活STING/IRF3/IFN-β通路具有強(qiáng)大的抗癌作用[6]。因此,本研究檢測利多卡因?qū)σ认侔┘?xì)胞PANC-1增殖和凋亡的影響,并探討STING/IRF3/IFN-β通路在整個(gè)過程中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 主要試劑和儀器

    利多卡因(沈陽光大制藥有限公司);注射用鹽酸吉西他濱(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司);人胰腺癌PANC-1細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell count kit 8,CCK-8)和ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IFN-β酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);TRIzol(美國Invitrogen公司);RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司);Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司];STING、IRF3、Akt、Caspase-3和GAPDH引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成;RIPA裂解液(北京索萊寶生物技術(shù)公司);STING、IRF3、磷酸化IRF3(p-IRF3)、Akt、Caspase-3和GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司);BD FACSVerse流式細(xì)胞儀(美國BIO-RAD公司);辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Real-time PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司);DYCZ-24EN雙垂直電泳槽和WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠);Sunrise型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

    細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、利多卡因低、中、高劑量組和陽性對照組。對照組不干預(yù),利多卡因低、中、高劑量組分別用20、40、80 mg/L利多卡因干預(yù)[7],陽性對照組用10 mg/L吉西他濱干預(yù)[8],48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

    1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

    細(xì)胞接種于96孔板,干預(yù)44 h后加入CCK-8(10 μL/孔),培養(yǎng)4 h,酶標(biāo)儀檢測490 nm處光密度(OD),細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白孔OD)/(陰性對照組OD-空白組OD)×100%。

    1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

    細(xì)胞接種于6孔板,干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞,用PBS洗滌2次,分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶,充分混勻后室溫避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF-α和IFN-β水平

    細(xì)胞接種于6孔板,干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞,用PBS洗滌2次,加入1 mL PBS,細(xì)胞超聲破碎儀處理30 s,離心后收集上清液。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入孔中,并與TNF-α和IFN-β抗體進(jìn)行預(yù)孵育。2 h后,與HRP偶聯(lián)物孵育30 min,用酶標(biāo)儀測量450 nm處OD。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算TNF-α和IFN-β水平。

    1.6 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測STING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA水平

    細(xì)胞接種于6孔板中,干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞,用PBS洗滌2次,加入1 mL TRIzol提取總RNA,根據(jù)Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,再根據(jù)Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒說明,制備20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件93 ℃預(yù)變性40 s;93 ℃變性10 s,62 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s,共循環(huán)50次,然后72 ℃延長7 min,采用2-ΔΔCt法計(jì)算STING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量(以GAPDH為內(nèi)對照)。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.7 蛋白印跡法檢測STING、IRF3、Akt、Caspase-3蛋白水平

    細(xì)胞接種于6孔板,干預(yù)48 h后收獲細(xì)胞,用PBS洗滌2次,加入RIPA裂解液(200 μL),裂解2 h后離心取上清,電泳(20 μg/孔),切膠、轉(zhuǎn)膜后,將膜與STING(1∶500)、IRF3(1∶400)、p-IRF3(1∶200)、Akt(1∶200)和Caspase-3(1∶400)進(jìn)行孵育,4 ℃過夜,用PBS洗滌2次,將膜與辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗IgG(1∶10 000)在室溫下孵育30 min,用PBS洗滌2次,顯色,采集圖像進(jìn)行分析(以GAPDH為內(nèi)對照)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 利多卡因?qū)?xì)胞增殖和凋亡的影響

    與陰性對照組比較,其余各組細(xì)胞增殖率降低,細(xì)胞凋亡率增加,且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系,但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05;表2和圖1)。

    表2 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響(n=3) 單位:%

    圖1 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞凋亡的影響

    2.2 利多卡因?qū)NF-α和IFN-β水平的影響

    與陰性對照組比較,其余各組細(xì)胞TNF-α水平降低,IFN-β水平增加,且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系,但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05;表3)。

    表3 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞TNF-α和IFN-β水平的影響(n=3) 單位:ng/L

    2.3 利多卡因?qū)TING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA水平的影響

    與陰性對照組比較,其余各組細(xì)胞Akt mRNA水平降低,STING、IRF3和Caspase-3 mRNA水平增加,且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系,但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05;圖2和圖3)。

    圖2 利多卡因?qū)TING、IRF3、Akt和Caspase-3 mRNA水平的影響a為P<0.05,與陰性對照組比較;b為P<0.05,與利多卡因低劑量組比較;c為P<0.05,與利多卡因中劑量組比較;d為P<0.05,與利多卡因高劑量組比較。

    圖3 PANC-1細(xì)胞STING、IRF3、Akt和Caspase-3的溶解曲線

    2.4 利多卡因?qū)TING、IRF3、Akt和Caspase-3蛋白水平的影響

    與陰性對照組比較,其余各組細(xì)胞Akt蛋白水平降低,STING、p-IRF3/IRF3和Caspase-3蛋白水平增加,且利多卡因組隨利多卡因劑量增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系,但效應(yīng)不及陽性對照組(P<0.05;圖4)。

    圖4 利多卡因?qū)ANC-1細(xì)胞STING、IRF3、p-IRF3、Akt和Caspase-3蛋白水平的影響a為P<0.05,與陰性對照組比較;b為P<0.05,與利多卡因低劑量組比較;c為P<0.05,與利多卡因中劑量組比較;d為P<0.05,與利多卡因高劑量組比較。

    3 討 論

    腫瘤細(xì)胞可以通過多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)在和外在機(jī)制逃脫宿主的免疫反應(yīng),從而增強(qiáng)免疫療法的抵抗力。胰腺癌的免疫原性特別低,可能是由于存在廣泛的纖維炎性和細(xì)胞增殖,造成CD8+T細(xì)胞浸潤[9]。在胰腺癌的麻醉和術(shù)后疼痛治療中給予的藥物,如氯胺酮、羅匹卡伐因和利多卡因,均具有一定抗腫瘤效果[10]。值得注意的是,初步研究表明,利多卡因可改善胰腺癌患者的預(yù)后[11]。本研究結(jié)果顯示,利多卡因能抑制PANC-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用,與國內(nèi)外研究一致。吉西他濱單藥治療目前是國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)專家組推薦的一線治療方案,但大多數(shù)胰腺癌患者對吉西他濱耐藥[12]。雖然利多卡因的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用不如吉西他濱,但考慮到吉西他濱的耐藥性,對利多卡因的抗腫瘤作用進(jìn)行研究還是很有必要。

    目前利多卡因的抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚,特別是在免疫調(diào)節(jié)方面,近年來,免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint blockade,ICB)已成為一種很有前途的治療方法。已有研究提示,利多卡因可通過炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤浸潤[13]。本研究結(jié)果顯示,利多卡因可降低PANC-1細(xì)胞TNF-α水平,這可以解釋利多卡因抑制胰腺PANC-1細(xì)胞增殖的能力。STING/IRF3/IFN-β通路通過誘導(dǎo)IFN和其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[14]。cGAS在自身DNA與炎癥信號傳遞中起著重要作用。來自細(xì)胞核中的游離DNA可以通過cGAS激活STING,進(jìn)而招募TBK1。TBK1以腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6依賴的方式抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB的激活[15];同時(shí),TBK1可以直接誘導(dǎo)IRF3的激活,誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生[16]。IFN-β可以抑制免疫細(xì)胞的活力和功能,包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞,最終抑制TNF-α和白細(xì)胞介素等炎癥因子的產(chǎn)生,從而參與炎性反應(yīng)的調(diào)控[17]。2′3′-cGAMP是STING通路的第二信使,直接與STING結(jié)合并激活STING,2′3′-cGAMP能抑制腫瘤生長,延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間,在胰腺癌中2′3′-cGAMP已被證明可以調(diào)節(jié)免疫抑制腫瘤微環(huán)境并減輕腫瘤負(fù)擔(dān)[18]。本研究結(jié)果顯示,利多卡因可以激活STING/IRF3/IFN-β通路,為利多卡因治療胰腺癌提供了理論支撐。

    人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)/Akt信號已被證明負(fù)調(diào)控STING通路,利多卡因被證明可以抑制腫瘤細(xì)胞HER2/Akt信號[19]。HER2/Akt信號參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡調(diào)控。作為HER2/Akt信號的下游信號分子,Akt在許多類型的腫瘤中持續(xù)被高度激活[20]。本研究結(jié)果顯示,利多卡因通過抑制Akt的激活來增強(qiáng)STING表達(dá),揭示了利多卡因介導(dǎo)STING通路激活的機(jī)制。Caspase的激活介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程,而Caspase-3是凋亡中的重要啟動(dòng)子。Caspase-3的激活影響主要的結(jié)構(gòu)蛋白并激活其他酶,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。重要的是,Akt信號通路可以抑制裂解的Caspase-3活性[22]。本研究結(jié)果顯示,利多卡因通過促進(jìn)Caspase-3的激活誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。

    綜上所述,利多卡因通過激活STING/IRF3/IFN-β通路,抑制PANC-1細(xì)胞的炎癥反應(yīng),抑制PANC-1細(xì)胞增殖并促進(jìn)PANC-1細(xì)胞凋亡,為利多卡因治療胰腺癌提供了理論依據(jù),但后續(xù)還需大量體內(nèi)和體外研究來驗(yàn)證利多卡因治療胰腺癌的具體機(jī)制和作用療效。

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