氯胍通過下調(diào)FASN/SREBP-1c通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、集落形成及遷移

岳壯壯， 黃玲俐， 吳添雨， 伍燕， 顏新建， 李高峰

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院腫瘤科，湖南省株洲市 412000)

原發(fā)性肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一，其治療原則是以手術(shù)為主的綜合治療[1-2]。研究表明，雙胍類藥物氯胍在腫瘤細(xì)胞系中抗增殖作用最強(qiáng)[3]。代謝重編程在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[4],在肝癌患者中調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)被上調(diào)，從而導(dǎo)致脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)轉(zhuǎn)錄激活[5-6]。目前氯胍對肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制暫無相關(guān)報(bào)道，本研究檢測不同濃度的氯胍對Hep-G2及SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞增殖、集落形成及遷移能力的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞株Hep-G2(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)和SMMC-7721(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院)；氯胍(中國上海阿拉丁試劑公司)；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、南美胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(trypsin 0.25% EDTA)、PBS磷酸鹽緩沖液、青鏈霉素(美國Hyclone公司)；FASN、SREBP-1c、β-actin抗體(美國CST公司)；Transwell小室(3422)(美國康寧公司)；倒置熒光顯微鏡-DMI3000B(德國Leica公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)-4600(上海天能科技有限公司)；多功能酶標(biāo)儀-Synergy HTX(美國BioTeK公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將肝癌細(xì)胞株Hep-G2及SMMC-7721培養(yǎng)于含10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 藥物配置

用PBS將氯胍配制成40 mmol/L的母液，分裝后置于-20 ℃保存。用培養(yǎng)基將母液稀釋成相應(yīng)濃度后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖

收集對數(shù)期的Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞，重懸后以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入不同濃度的氯胍(0、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L)處理48 h，每孔加入50 μL 2 g/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲亞砜，置于搖床上避光震蕩15 min，使用多功能酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的光密度(OD值)，使用Graphprism繪制MTT曲線，計(jì)算IC50。細(xì)胞相對活力=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD組。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力

收集對數(shù)期的Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞，重懸后以8×103個(gè)/孔接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄上清液，PBS洗滌2次，加入不同濃度的氯胍(0、10、20、40 μmol/L)處理5～7天，待對照組細(xì)胞生長至70%左右，棄上清液，PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定15～20 min，PBS沖洗2次，每孔加入0.5 mL結(jié)晶紫染色30 min，流動(dòng)水沖洗，烘干，多功能酶標(biāo)儀檢測550 nm波長處的OD值。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達(dá)情況

收集對數(shù)期的Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞，重懸后以6×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄上清液，PBS洗滌2次，加入不同濃度的氯胍(0、10、20、40 μmol/L)處理12 h，加入細(xì)胞裂解液后煮沸10 min，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、剪膜、5%脫脂牛奶封閉1 h、一抗4 ℃孵育過夜、TBST洗滌5～6次、二抗室溫孵育2 h、TBST洗滌條帶3～4次、加入ECL化學(xué)發(fā)光液后使用TANON機(jī)器進(jìn)行曝光，使用Image J軟件對目標(biāo)條帶進(jìn)行分析。

1.7 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力

收集對數(shù)期的Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞，加入無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，配制成無血清細(xì)胞混懸液，取200 μL含4×104個(gè)細(xì)胞的混懸液接種于小室上層，加入不同濃度的氯胍(0、10、20、40 μmol/L)，小室下層加入600 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗2次，每孔加入0.5 mL結(jié)晶紫染色2 h，流動(dòng)水沖洗后拭去小室上層細(xì)胞，待小室烘干后在顯微鏡下拍照，使用Image J進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度氯胍對SMMC-7721及Hep-G2細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，與氯胍0 μmol/L比較，SMMC-7721、Hep-G2細(xì)胞活力隨氯胍濃度升高而降低(P<0.05；圖1)。SMMC-7721及Hep-G2兩種細(xì)胞株的IC50分別為50 μmol/L及40 μmol/L。當(dāng)氯胍濃度為40 μmol/L時(shí)，對兩種細(xì)胞株的抑制效果已經(jīng)很明顯，最終實(shí)驗(yàn)選擇0～40 μmol/L的氯胍。

圖1 不同濃度氯胍對細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05，與同細(xì)胞氯胍0 μmol/L比較。

2.2 不同濃度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞集落形成能力

與氯胍0 μmol/L組比較，其他氯胍濃度組Hep-G2及SMMC-7721的集落形成能力降低(P<0.05；圖2)。

圖2 不同濃度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞集落形成能力1、2、3、4分別為0、10、20、40 μmol/L氯胍組。a為P<0.05，與同細(xì)胞氯胍0 μmol/L比較。

2.3 不同濃度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞遷移

Transwell結(jié)果顯示，與氯胍0 μmol/L組比較，其他氯胍濃度組對細(xì)胞遷移的抑制作用增強(qiáng)(P<0.05；圖3)。

圖3 不同濃度氯胍抑制Hep-G2及SMMC-7721細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫染色，100×)1、2、3、4分別為0、10、20、40 μmol/L氯胍組。a為P<0.05，與同細(xì)胞氯胍0 μmol/L比較。

2.4 不同濃度氯胍抑制FASN、SREBP-1c在Hep-G2及SMMC-7721中的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與氯胍0 μmol/L組比較，氯胍其他濃度組FASN、SREBP-1c在兩種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)均降低(P<0.05；圖4)。

圖4 不同濃度氯胍抑制FASN、SREBP-1c在Hep-G2及SMMC-7721中的表達(dá)A為Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B為蛋白表達(dá)柱狀圖。1、2、3、4分別為0、10、20、40 μmol/L氯胍組。a為P<0.05，與同細(xì)胞氯胍0 μmol/L比較。

3 討 論

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常見的癌癥。雖然近年來肝癌在治療上取得了顯著進(jìn)展，但肝癌患者的預(yù)后仍然相對較差，特別是那些無法接受手術(shù)治療的晚期肝癌患者。目前對肝癌細(xì)胞增殖影響因素已有報(bào)道[7-8]，但國內(nèi)外尚無氯胍對肝癌細(xì)胞增殖影響的報(bào)道。氯胍是一種雙胍類藥物，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯胍對膀胱癌細(xì)胞增殖具有抑制作用[9]。本研究40 μmol/L的氯胍對Hep-G2、SMMC-7721細(xì)胞株的抑制效果明顯，所以選擇最高濃度40 μmol/L用于實(shí)驗(yàn)。通過MTT、克隆形成及遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了氯胍對兩種肝癌細(xì)胞系Hep-G2及SMMC-7721增殖及遷移具有抑制作用，并深入探索其對脂代謝相關(guān)蛋白的影響，提示氯胍是一種潛在的抗肝癌藥物。

脂質(zhì)代謝的改變是癌癥進(jìn)展的標(biāo)志之一。在癌細(xì)胞中，脂肪酸的合成主要受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SREBP-1的調(diào)節(jié)[10]。SREBP-1c是SREBP-1的同工型，通過增加其靶基因的轉(zhuǎn)錄來激活脂肪酸生物合成途徑[11]。從而提供用于膜和信號分子的生物合成的原料。FASN是脂肪酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶，并在多種癌癥中過表達(dá)，例如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、肺癌和肝癌，但其在癌旁組織中的表達(dá)較低，在許多情況下與不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。大多數(shù)癌細(xì)胞依賴于FASN介導(dǎo)的合成途徑，因此FASN是一個(gè)良好的治療靶標(biāo)。研究表明，F(xiàn)ASN的過表達(dá)與肝癌的發(fā)展密切相關(guān)，與腫瘤細(xì)胞的生存和遷移密切相關(guān)[13-14]。Zhang等[15]研究表明，沉默F(xiàn)ASN能夠抑制肝癌細(xì)胞株Hep-G2增殖。Yu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ZHX2通過抑制SREBP-1c介導(dǎo)的新生脂肪生成進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖。因此，抑制FASN/SREBP-1c通路可能是肝癌潛在的治療靶點(diǎn)，本研究結(jié)果顯示，氯胍抑制FASN、SREBP-1c的表達(dá)。

綜上所述，氯胍具有良好的抗腫瘤活性，能抑制肝癌細(xì)胞系Hep-G2及SMMC-7721的增殖及遷移。其機(jī)制可能是氯胍通過抑制FASN/SREBP-1c通路，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。