吳茱萸堿對酒精性胃潰瘍大鼠胃黏膜上皮細胞的保護作用

李有連， 張秉麗， 霍成英， 朱海宏

(1.青海仁濟醫(yī)院消化內科，青海省西寧市 810021；2.青海省人民醫(yī)院消化內科，青海省西寧市810000)

胃潰瘍發(fā)病原因多樣，包括幽門螺桿菌感染、不良飲食習慣、藥物、精神和遺傳因素等[1-2]。酒精的不適當使用和攝入會引起全身多器官損傷，其中，酒精對胃腸道的影響是最為直接和嚴重的，作為一種胃黏膜攻擊因子，大量高濃度乙醇可直接損傷胃黏膜組織，刺激胃腸道蠕動，引起水腫、出血和炎癥等損傷[3-4]。吳茱萸堿(evodiamine，EVO)提取自蕓香科植物吳茱萸、石虎、疏毛吳茱萸的果實，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗阿爾茨海默癥、治療內分泌系統(tǒng)疾病的作用[5-7]。研究表明，吳茱萸堿對胃炎、胃潰瘍等胃腸道疾病具有抑制作用，但其作用機制尚不清晰[8]。本研究通過建立酒精性大鼠胃潰瘍模型探討EVO對酒精性胃潰瘍的預防作用，探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，6周齡，體質量180～220 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]，飼養(yǎng)條件：室溫為(22±2) ℃，濕度為(50±10)%，保持屋內12 h光照和12 h無光照的光暗周期，攝食飲水不限。

1.2 材料與試劑

EVO(純度>98%，上海一基實業(yè)有限公司，批號：518-17-2)；奧美拉唑(重慶涪陵制藥，20160511)；無水乙醇(天津富宇精細化工有限公司)；HE染色試劑盒、中性樹膠、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；實驗所需檢測氧化應激及炎性因子試劑盒(武漢Elabscience生物科技有限公司)；蛋白定量試劑盒(博士德生物)；酪氨酸蛋白激酶2(Janus activating kinase 2，JAK2)、磷酸化的JAK2(phospho-JAK2，p-JAK2)、信號轉導子與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷酸化STAT3(phospho-STAT3，p-STAT3)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2關聯(lián)X蛋白(BCL2-associated X protein，Bax)兔單抗、羊抗兔二抗(美國CST公司)。

1.3 分組、造模與給藥

將60只大鼠隨機分為對照組、模型組、奧美拉唑組、EVO高劑量組、EVO低劑量組和酪氨酸蛋白激酶2特異性抑制劑(the specific inhibitor of tyrosine protein kinase 2，AG490)組，每組10只。除對照組和模型組每天使用等量生理鹽水灌胃給藥之外，奧美拉唑組(5 mg/kg)、EVO高劑量組(40 mg/kg)、EVO低劑量組(20 mg/kg)大鼠均采用灌胃給藥的方式進行預處理，每天1次，連續(xù)7天，AG490組大鼠腹腔注射5 mg/kg AG490，每2天一次，持續(xù)7天。末次給藥前1天禁食，末次給藥后2 h，除對照組外，其他各組大鼠均灌胃5 mL/kg無水乙醇建立酒精性胃潰瘍模型[9]，1 h后處死大鼠取材，進行后續(xù)實驗。

1.4 計算大鼠胃潰瘍面積及胃潰瘍抑制率

造模后1 h，處死大鼠，剖開腹腔，分離胃組織，沿著胃大彎剪開后用生理鹽水清洗至無內容物和血絲，置于冰盒上展平，測量胃潰瘍病灶的長徑和短徑，計算各個大鼠的潰瘍面積，然后計算藥物對胃潰瘍的抑制率。潰瘍抑制率(%)=[(模型組潰瘍面積-給藥組潰瘍面積)/模型組潰瘍面積]×100%。

1.5 HE染色觀察胃黏膜組織病理變化

收集胃黏膜組織潰瘍部分，取其中一部分修剪成適宜大小和形狀，浸泡在4%多聚甲醛中室溫固定2天；剩余部分組織清洗干凈后直接放置在EP管中，凍存于-80 ℃。胃組織固定后用蒸餾水清洗，使用梯度乙醇對組織進行脫水處理，然后放入二甲苯溶液中適當透明，放入不同熔點的石蠟中制成組織蠟塊，在切片機上制成厚度為4 μm的切片，固定在防脫載玻片上，烤片、脫蠟，梯度乙醇復水，行HE染色，封片后放在倒置顯微鏡下拍照并觀察胃黏膜病理變化。

1.6 TUNEL法觀察胃黏膜上皮細胞凋亡

切片制備方法同1.5。切片標本常規(guī)脫蠟、復水，嚴格按照TUNEL染色試劑盒說明書的步驟對各組大鼠的病理標本進行染色，常規(guī)脫水、透明后用中性樹膠封片，顯微鏡高倍鏡下觀察，每組隨機取4個視野拍照，計數(shù)胃黏膜上皮細胞區(qū)域凋亡細胞數(shù)量取平均值。

1.7 血清TNF-α、IL-6、IL-10水平及胃黏膜組織SOD活力、MDA含量檢測

取腹主動脈血于EP管中后放置于4 ℃冰箱中，2 h后取出，以3 000 r/min的轉速離心(半徑為12.5 cm)，10 min后用移液器小心吸取析出的上層血清，分裝后保存在-20 ℃冰箱。取血完畢后剝取大鼠胃黏膜組織潰瘍部分，剪碎、勻漿，以10 000 r/min的轉速離心，離心半徑同上，10 min后用移液器小心吸取上層清液，分裝和保存環(huán)境同血清環(huán)境。根據(jù)試劑盒說明書的要求，繪制標準曲線，計算各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-10(interleukin-6，IL-10)的含量及胃黏膜中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.8 Western blotting法檢測

剝取大鼠胃黏膜組織潰瘍部分，剪碎后放入研磨器，在冰上研磨勻漿，加入裂解液提取各組胃黏膜組織總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定胃黏膜組織蛋白的水平，在各組蛋白中加入上樣緩沖液混合均勻，于沸水中煮沸變性，然后進行SDS-PAGE電泳，每個樣品上樣20 μg，將分離的目的蛋白轉至PVDF膜上，轉膜結束后將所有膜放入5%脫脂奶粉中，恒溫搖床孵育2 h，TBST緩沖液清洗后將膜放入1∶1 000的一抗中，4 ℃孵育12 h，用TBST緩沖液清洗好后加入1∶2 000的二抗中，37 ℃恒溫搖床孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次，PVDF膜后于避光處均勻滴加ECL曝光試劑，置于凝膠成像儀中觀察并拍照記錄，使用Image J對結果進行量化分析。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠胃潰瘍面積及抑制率比較

奧美拉唑組、EVO高、低劑量組和AG490組潰瘍面積均小于模型組(均P<0.05)。與奧美拉唑組比較，EVO低劑量組潰瘍面積增加，潰瘍抑制率降低(P<0.05)。與EVO高劑量組比較，EVO低劑量組潰瘍面積增加，潰瘍抑制率降低(P<0.05)。與EVO低劑量組比較，AG490組潰瘍面積減少，潰瘍抑制率升高(P<0.05；表1)。

表1 各組大鼠胃潰瘍面積及抑制率比較

2.2 各組大鼠胃黏膜組織病理學變化

HE染色顯示，對照組大鼠胃黏膜組織細胞排列整齊、有序，無炎性細胞浸潤，而模型組大鼠胃黏膜組織可見明顯的損傷，黏膜細胞壞死、炎性細胞增加。與模型組比較，EVO高、低劑量組和AG490組潰瘍損傷和炎性細胞浸潤程度均減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理學變化(HE，200×)

2.3 各組大鼠胃黏膜上皮細胞凋亡情況

與對照組比較，其余各組凋亡細胞數(shù)量均增加(P<0.05)。與模型組比較，除對照組外其他各組凋亡細胞數(shù)量均降低(P<0.05)。EVO低劑量組凋亡細胞數(shù)量高于奧美拉唑組和EVO高劑量組(P<0.05)。AG490組凋亡細胞數(shù)量低于奧美拉唑組、EVO高劑量組和EVO低劑量組(均P<0.05；圖2)。

圖2 各組大鼠胃黏膜上皮細胞凋亡情況比較(TUNEL，400×)

2.4 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平及胃黏膜組織SOD活力、MDA含量的比較

與對照組比較，其余各組大鼠的胃黏膜組織IL-10含量和SOD活力降低，TNF-α、IL-6及MDA的含量增加(P<0.05)。奧美拉唑組、EVO高、低劑量組和AG490組胃黏膜組織IL-10含量和SOD活力高于模型組，TNF-α、IL-6及MDA的含量低于模型組(P<0.05)。EVO低劑量組IL-10含量和SOD活力低于奧美拉唑組、EVO高劑量組及AG490組，TNF-α、IL-6、MDA含量高于奧美拉唑組、EVO高劑量組及AG490組(均P<0.05；表2)。

表2 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平及胃黏膜組織SOD活力、MDA含量的比較

2.5 各組大鼠胃黏膜組織Bcl-2、Bax表達的比較

與對照組比較，其他各組Bcl-2表達降低，Bax表達增加(P<0.05)。與模型組比較，奧美拉唑組、EVO高、低劑量組和AG490組Bcl-2表達增加，Bax表達減少(P<0.05)。EVO低劑量組Bcl-2表達低于奧美拉唑組、EVO高劑量組及AG490組，Bax表達高于奧美拉唑組、EVO高劑量組及AG490組(P<0.05；圖3)。

圖3 Western blotting法檢測胃黏膜組織Bcl-2、Bax表達

2.6 各組大鼠胃黏膜組織JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表達的比較

與對照組比較，其他各組JAK2和STAT3磷酸化水平均增加(P<0.05)。與模型組比較，奧美拉唑組、EVO高劑量組和AG490組JAK2和STAT3磷酸化水平均降低(P<0.05)。EVO低劑量組JAK2和STAT3磷酸化水平高于奧美拉唑組、EVO高劑量組和AG490組(P<0.05；圖4)。

圖4 Western blotting法檢測胃黏膜組織JAK2、STAT3磷酸化水平

3 討 論

胃潰瘍是一種發(fā)病率高、病因復雜的異質性疾病，常見的臨床治療藥物包括抗菌藥物、抗酸藥、質子泵抑制劑和H2受體阻斷劑等，但均存在副作用較多、易復發(fā)、療程長等缺點，因此，從傳統(tǒng)中藥天然活性成分中尋找安全有效的抗胃潰瘍藥物具有重要的研究意義[10]。EVO源自中藥吳茱萸、石虎及疏毛吳茱萸的成熟果實，是一種具有多種藥理學作用的生物堿[11]。研究表明，吳茱萸及含吳茱萸的中藥方劑對胃炎、胃潰瘍等疾病具有良好的治療作用，其活性成分EVO對胃腸道疾病亦有一定程度的保護作用，但其具體作用機制仍需進一步研究并加以闡明[12-13]。

本研究通過藥物預處理后灌胃5 mL/kg無水乙醇建立大鼠酒精性胃潰瘍模型，結果顯示奧美拉唑組、EVO高、低劑量組和AG490組均出現(xiàn)不同程度的胃潰瘍，病理切片顯示各組大鼠均出現(xiàn)胃黏膜細胞壞死、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象，但奧美拉唑組、EVO高劑量組和低劑量組均對酒精性胃潰瘍具有抑制作用，能夠縮小胃潰瘍面積，減輕胃黏膜損傷和炎癥浸潤，EVO高劑量的作用優(yōu)于低劑量。研究表明，炎癥和氧化應激反應是胃潰瘍發(fā)生的重要過程，潰瘍患者往往出現(xiàn)血清炎性細胞因子紊亂，TNF-α、IL-6含量異常增加而IL-10含量降低，TNF-α和IL-6是機體重要的炎性因子，與細胞凋亡和分化、免疫調節(jié)相關，而IL-10可通過降低TNF-α等炎性因子的表達而產(chǎn)生抗炎作用[14-15]。SOD作為機體的重要抗氧化酶可反映機體清除自由基的能力；MDA則與胃潰瘍時機體受損程度相關，是氧自由基損傷胃黏膜后產(chǎn)生的脂質過氧化物[16]。在本研究中，酒精性胃潰瘍大鼠血清炎性因子水平TNF-α、IL-6增加，IL-10減少，胃黏膜組織SOD活力降低，MDA含量增加，而預先使用EVO處理可減輕胃潰瘍大鼠炎癥反應和氧化應激損傷。EVO可減少胃黏膜上皮細胞凋亡數(shù)量，顯著降低胃黏膜組織Bax表達，增加Bcl-2的表達，且高劑量EVO的上述作用優(yōu)于低劑量EVO，表明一定劑量EVO具有抗炎、抗氧化應激和抗凋亡作用。

JAK/STAT信號通路是一種高度保守的信號轉導途徑，在機體的免疫調節(jié)和炎癥過程中具有重要作用[17]。JAK2是一種非跨膜型酪氨酸激酶，當受到多種細胞因子刺激后可與細胞受體結合，使JAK2磷酸化，進而誘導下游的STAT3磷酸化，并參與細胞的多種生物學過程[18]。AG490是JAK2/STAT3信號通路特異性抑制劑，在本研究中，酒精性胃潰瘍大鼠JAK2和STAT3磷酸化水平增加，大鼠預先使用AG490進行預處理后，胃潰瘍面積、胃黏膜損傷和炎癥浸潤得到明顯改善，炎癥反應和氧化應激損傷減輕，JAK2和STAT3磷酸化水平降低，提示酒精誘導的大鼠胃潰瘍可能與JAK2/STAT3信號通路活化有關。同時，高劑量和低劑量EVO均可降低JAK2和STAT3的磷酸化水平，EVO高劑量組的作用優(yōu)于EVO低劑量組，提示EVO可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路磷酸化產(chǎn)生對酒精性胃潰瘍的抑制作用。

綜上所述，EVO可能通過阻斷JAK2/STAT3信號通路抑制酒精性胃潰瘍的形成，抑制炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡，減輕組織損傷，為EVO的臨床應用提供理論依據(jù)。