卡維地洛對ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞中NLRP3炎癥小體介導(dǎo)焦亡及炎癥的影響

閆凱欣， 徐 霄， 補 娟， 徐 紅

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 1.老年醫(yī)學(xué)中心，2.骨科關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學(xué)病區(qū)，3.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市830000；4.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市 830000)

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)對血管內(nèi)皮細胞的損害貫穿動脈粥樣硬化全過程，卡維地洛是臨床上廣泛應(yīng)用的第三代β受體阻滯劑，新近有研究證實其在ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷過程中發(fā)揮保護作用[1]，但相關(guān)的分子機制尚不清楚。NLRP3炎癥小體在高糖高脂環(huán)境下發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，一方面促進GSDMD剪切為GSDMD-N并介導(dǎo)細胞焦亡，另一方面促進白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18釋放并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[2]。已有研究報道ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷時高表達NLRP3炎癥小體介導(dǎo)細胞焦亡及炎癥反應(yīng)，抑制NLRP3顯著減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷[3-4]?；诖?，本研究將NLRP3炎癥小體為靶點，探討卡維地洛對ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)中NLRP3炎癥小體介導(dǎo)焦亡及炎癥的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVEC(上海子實生物科技有限公司)?？ňS地洛(上海佰世凱化學(xué)科技公司)，ox-LDL(MEC公司)，陰性對照(NC)及過表達NLRP3的腺病毒(金唯智生物科技公司)，MTS檢測試劑盒(Abcam公司)，IL-1β、IL-18 ELISA檢測試劑盒(江蘇科特生物科技公司)，GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1及β-actin的特異性一抗及辣根過氧化物酶二抗(CST公司)。

1.2 HUVEC培養(yǎng)及分組

HUVEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，常規(guī)消化傳代后進行分組干預(yù)。對照組不干預(yù)，ox-LDL組用100 mg/L ox-LDL處理，低劑量組、高劑量組分別用含0.01或0.1 mmol/L卡維地洛+100 mg/L ox-LDL處理。在上述干預(yù)基礎(chǔ)上，Ad-NC組、Ad-NC+ox-LDL組和Ad-NC+高劑量組轉(zhuǎn)染NC腺病毒，Ad-NLRP3+高劑量組轉(zhuǎn)染過表達NLRP3腺病毒。腺病毒轉(zhuǎn)染的系數(shù)均設(shè)置為75。每組均連續(xù)干預(yù)24 h。

1.3 MTS法檢測細胞活力

細胞接種于96孔板，分組干預(yù)后12、24 h分別加入MTS試劑盒檢測液，20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)板放入酶標儀，波長490 nm，檢測各組光密度OD490。

1.4 ELISA檢測IL-1β、IL-18含量

細胞接種于12孔板，分組干預(yù)后24 h收集培養(yǎng)基，采用ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-18含量，收集細胞并采用BCA法檢測細胞裂解液中蛋白含量，計算IL-1β、IL-18含量與細胞蛋白含量比值。

1.5 Western blotting檢測GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1表達

細胞接種于12孔板，分組干預(yù)后24 h棄去培養(yǎng)基、收集細胞，裂解細胞后得到裂解液，將含有30 μg蛋白裂解液與緩沖液混合后行Western blotting檢測，分別進行電泳、電轉(zhuǎn)膜、孵育特異性一抗過夜及孵育辣根過氧化物酶二抗，最后在凝膠成像系統(tǒng)中通過ECL法顯影得到目標蛋白GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1，以β-actin為內(nèi)參計算GSDMD-N、NLRP3、Cleaved Caspase-1表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 過表達NLRP3對卡維地洛抑制細胞活力的影響

干預(yù)12、24 h，HUVEC細胞活力ox-LDL組低于對照組，不同劑量卡維地洛組高于ox-LDL組，且高劑量組高于低劑量組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染腺病毒后，HUVEC細胞活力Ad-NC+ox-LDL組低于Ad-NC組，Ad-NC+ox-LDL組和Ad-NLRP3+高劑量組低于Ad-NC+高劑量組(P<0.05；表1)。

表1 各組HUVEC細胞活力的比較(n=4)

2.2 過表達NLRP3對卡維地洛抑制細胞焦亡及炎癥反應(yīng)的影響

干預(yù)24 h，IL-1β、IL-18及GSDMD-N水平ox-LDL組高于對照組，不同劑量卡維地洛組低于ox-LDL組，且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染腺病毒后，IL-1β、IL-18及GSDMD-N水平Ad-NC+ox-LDL組高于Ad-NC組，Ad-NC+ox-LDL組和Ad-NLRP3+高劑量組高于Ad-NC+高劑量組(P<0.05；表2和圖1)。

表2 各組HUVEC中IL-1β、IL-18含量及GSDMD-N表達水平的比較(n=4)

圖1 各組HUVEC中GSDMD-N表達的比較(Western blotting)

2.3 過表達NLRP3對卡維地洛抑制NLRP3炎癥小體表達的影響

干預(yù)24 h，NLRP3、Cleaved Caspase-1表達水平ox-LDL組高于對照組,不同劑量卡維地洛組低于ox-LDL組,且高劑量組低于低劑量組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染腺病毒后，NLRP3、Cleaved Caspase-1表達水平Ad-NC+ox-LDL組高于Ad-NC組，Ad-NC+ox-LDL組和Ad-NLRP3+高劑量組低于Ad-NC+高劑量組(P<0.05；表3和圖2)。

表3 各組HUVEC中NLRP3、Cleaved Caspase-1表達水平的比較(n=4)

圖2 各組HUVEC中NLRP3、Cleaved Caspase-1表達的比較(Western blotting)

3 討 論

卡維地洛是β受體阻滯劑，有研究報道卡維地洛對As大鼠的動脈病理改變具有改善作用，提示卡維地洛具有抗As的作用[5]。文波等[1]細胞實驗證實，卡維地洛在ox-LDL誘導(dǎo)主動脈內(nèi)皮細胞損傷過程中起保護作用，這與其在動物模型中改善As的作用吻合。本研究參考文獻[6]以100 mg/L ox-LDL刺激HUVEC建立內(nèi)皮細胞損傷模型，不同劑量卡維地洛干預(yù)后細胞活力明顯增加，表明卡維地洛對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷具有保護作用。

Ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷的過程涉及炎癥反應(yīng)、凋亡及焦亡、氧化應(yīng)激等，其中炎癥反應(yīng)和焦亡在調(diào)控機制上存在共同的上游分子即NLRP3炎癥小體[7]。在高糖、高脂、高同型半胱氨酸、吸煙等病理因素的刺激下，NLRP3表達增加并招募Caspase-1使其裂解為有活性的Cleaved Caspase-1，后者一方面使GSDMD氨基末端發(fā)生裂解生成GSDMD-N并介導(dǎo)細胞焦亡，另一方面使無活性的IL-1β、IL-18前體裂解為有促炎活性的IL-1β、IL-18成熟體并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[8-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL處理HUVEC后，培養(yǎng)基中IL-1β、IL-18含量及細胞中NLRP3、Cleaved Caspase-1、GSDMD-N表達水平均增加，提示ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷過程中存在細胞焦亡及炎癥反應(yīng)的過度激活。本研究給予不同劑量卡維地洛干預(yù)后，ox-LDL誘導(dǎo)的細胞焦亡及炎癥反應(yīng)均顯著受到抑制，提示卡維地洛在ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷過程中起到抗焦亡及抗炎作用，這可能是該藥物發(fā)揮內(nèi)皮保護作用相關(guān)的分子機制。

NLRP3炎癥小體對細胞焦亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用已經(jīng)被多項研究證實，使用NLRP3抑制劑或敲低NLRP3均能減輕ox-LDL或高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷，同時抑制細胞焦亡和炎癥反應(yīng)[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，卡維地洛在ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷過程中抑制NLRP3炎癥小體的表達及下游細胞焦亡、炎癥反應(yīng)，為了進一步明確NLRP3炎癥小體在卡維地洛減輕內(nèi)皮損傷中的作用，本研究設(shè)計了過表達NLRP3的腺病毒，在卡維地洛干預(yù)的同時轉(zhuǎn)染腺病毒以增加NLRP3的表達，在過表達NLRP3后，卡維地洛增加細胞活力、減輕細胞焦亡及炎癥反應(yīng)的作用被削弱，提示卡維地洛在ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷過程的保護作用部分與其抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，卡維地洛在ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷過程中發(fā)揮保護作用，抑制ox-LDL誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細胞焦亡及炎癥反應(yīng)是卡維地洛發(fā)揮上述變化作用的相關(guān)分子機制之一，為As發(fā)病過程中內(nèi)皮損傷防治手段提供了新思路，也為深入認識NLRP3炎癥小體介導(dǎo)內(nèi)皮細胞焦亡及炎癥反應(yīng)在As發(fā)病中的作用提供了新靶點。