高效液相色譜法測(cè)定杜仲壯骨丸中馬兜鈴酸A

龐逸輝，李岳，張憲

(北京市藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

杜仲壯骨丸是采用貴州省道地藥材杜仲等作為主要原料所研制的中藥復(fù)方制劑，該制劑由杜仲、人參、細(xì)辛、淫羊藿、黃芪、豹骨，尋骨風(fēng)等24 味藥材組成，具有益氣健脾，養(yǎng)肝壯腰，活血通絡(luò)，強(qiáng)筋健骨，祛風(fēng)除濕的功效[1-2]。臨床上用于治療風(fēng)濕痹痛，筋骨無(wú)力，屈伸不利，步履艱難，腰膝疼痛，畏寒喜溫等癥[3]。但該制劑成分中含有尋骨風(fēng)、細(xì)辛這兩味藥材，尤其是尋骨風(fēng)已經(jīng)研究表明其中含有毒性成分馬兜鈴酸A[4-5]，而細(xì)辛則根據(jù)其不同來(lái)源被認(rèn)為可能含微量的馬兜鈴酸A[6-7]。雖然目前未有直接的證據(jù)表明馬兜鈴酸能夠誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生，但部分研究已證實(shí)：馬兜鈴酸存在著明顯的腎毒性，可以對(duì)腎小管功能造成損害，甚至存在誘導(dǎo)腎癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。為保障及提高患者的用藥安全，自2008 年起，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)含有馬兜鈴酸的藥材及制劑進(jìn)行更為嚴(yán)格的監(jiān)督管理[10]。2017 年10 月30 日，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局官方網(wǎng)站公布了《含馬兜鈴屬藥材的已上市中成藥品種名單》、《可能含有馬兜鈴酸的馬兜鈴科藥材名單》，杜仲壯骨丸被收錄入《含馬兜鈴屬藥材的已上市中成藥品種名單》中。

諶晶晶等[11]發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚有一定的腎毒性和耳毒性。朱哿瑞等[12]研究發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸Ⅰ能致使小鼠發(fā)生急性肝毒性損傷。謝大英等[13]研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸A 有一定的致突變性。于巧紅等[14]研究發(fā)現(xiàn)，市售的17 種中成藥均符合生物藥劑分類學(xué)Ⅲ類藥物的特點(diǎn)，在含有馬兜鈴酸A 的制劑中馬兜鈴酸A 具有體內(nèi)體外一致性，有申請(qǐng)生物豁免的潛力。為更好的保證市面上所銷售的杜仲壯骨丸的用藥安全，應(yīng)對(duì)該中藥復(fù)方制劑所含有的毒性成分馬兜鈴酸A 進(jìn)行嚴(yán)格的限量控制。邱泉等[15]用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)量神農(nóng)蛇藥酒中馬兜鈴酸A 的含量，該方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，靈敏度高。目前尚未發(fā)現(xiàn)采用HPLC 法對(duì)杜仲壯骨丸中馬兜鈴酸A 含量測(cè)定的研究報(bào)道。

筆者經(jīng)探索建立了高效液相色譜法測(cè)定杜仲壯骨丸中馬兜鈴酸A 的含量，該方法操作簡(jiǎn)單、所使用試劑價(jià)廉易得，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于杜仲壯骨丸中馬兜鈴酸A 的限量檢查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20A 型，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。

工作站：LCsolution，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。

紫外檢測(cè)器：SPD-20A 型，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。

電子天平：MS104S 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DB 型，昆山市超聲儀器有限公司。

馬兜鈴酸A 對(duì)照品：批號(hào)為112054-201902，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，上海雅吉生物科技有限公司。

甲醇：色譜純，美國(guó)天地有限公司。

杜仲壯骨丸樣品：貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)有限公司。

實(shí)驗(yàn)用其余試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇-水(體積比為4∶1)溶液，流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：315 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 溶液配制

馬兜鈴酸A 對(duì)照品溶液：0.15 μg/mL，精密稱取于五氧化二磷干燥器中減壓干燥至恒重的馬兜鈴酸A 對(duì)照品適量，加入流動(dòng)相，混勻。

馬兜鈴酸A 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密吸取馬兜鈴酸A 對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，分別置于6 只10 mL 容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成馬兜鈴酸A 的質(zhì)量濃度分別為0.007 5、0.015、0.03、0.075、0.12、0.15 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

取50 粒杜仲壯骨丸樣品，碾細(xì)，精密稱取樣品粉末1.0 g 至具塞錐形瓶中，精密加入40 mL 甲醇溶液，稱重并記錄，超聲40 min (功率為500 W，頻率為40 kHz)，冷卻后再次稱重，用甲醇溶液補(bǔ)足損失的重量，搖勻，用0.22 μm 過(guò)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件選擇

2.1.1 提取溶劑

分別選用乙醇、50%乙醇溶液、甲醇、50%甲醇溶液4 種溶劑對(duì)杜仲壯骨丸樣品中的馬兜鈴酸A進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑時(shí)，色譜基線平穩(wěn)、馬兜鈴酸A 色譜峰峰形較好，色譜峰面積較大，因此選擇甲醇為提取溶劑。

2.1.2 提取方法

以甲醇作為提取溶劑，分別采用連續(xù)回流提取法及超聲提取法對(duì)杜仲壯骨丸樣品中的馬兜鈴酸A進(jìn)行提取，結(jié)果表明，兩種提取方法測(cè)定的色譜峰峰形相近，色譜峰面積大小幾乎一致，考慮到超聲提取法操作更為便捷，因此選定超聲提取法。

2.1.3 提取時(shí)間

考察超聲提取時(shí)間分別為20、30、60 min 時(shí)杜仲壯骨丸樣品中馬兜鈴酸A 的提取效果，結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min 后，提取液中馬兜鈴酸A 的色譜峰面積趨于穩(wěn)定，表明目標(biāo)物質(zhì)馬兜鈴酸A 的提取較完全，為保證馬兜鈴酸A 提取完全，選擇將超聲時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)至40 min。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

采用紫外檢測(cè)器于250～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描對(duì)照品溶液，獲得馬兜鈴酸A 在全掃描波長(zhǎng)的紫外吸收光譜圖如圖1 所示。由圖1 可以看出，馬兜鈴酸A 在315 nm 處有最大吸收，因此選擇馬兜鈴酸A 的檢測(cè)波長(zhǎng)為315 nm。

圖1 馬兜鈴酸A 在250～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外吸收光譜圖

2.3 色譜條件優(yōu)化

分別考察甲醇-水溶液和乙腈-水溶液兩種流動(dòng)相體系對(duì)馬兜鈴酸A 的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水(體積比4∶1)溶液時(shí)，色譜基線平穩(wěn)、色譜峰的分離效果更好，故選擇甲醇-水(體積比4∶1)溶液為流動(dòng)相。

以甲醇-水(體積比4∶1)溶液為流動(dòng)相，分別考察流量為0.8、1.0，1.2 mL/min 時(shí)馬兜鈴酸A的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相流量為1.0 mL/min 時(shí)，馬兜鈴酸A 的色譜峰峰形對(duì)稱，且分離效果最好，故選擇流動(dòng)相流量為1.0 mL/min。

以甲醇-水(體積比4∶1)溶液為流動(dòng)相，相流量為1.0 mL/min。分別考察柱溫為25、30、35、40 ℃時(shí)馬兜鈴酸A 的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)色譜柱溫度為35 ℃時(shí)，色譜峰的分離效果最好，故選擇柱溫為35 ℃。

2.4 對(duì)照品與樣品色譜圖

在1.2 色譜條件下，對(duì)馬兜鈴酸A 對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2 和圖3 所示。對(duì)照?qǐng)D2 和圖3 可知，在樣品溶液色譜圖中，馬兜鈴酸A 色譜峰與其它色譜峰分離良好，適于定量。

圖2 對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 樣品溶液色譜圖

2.5 線性方程與檢出限

按照1.2 色譜條件，自動(dòng)進(jìn)樣器依次吸取10μL馬兜鈴酸A 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積。以馬兜鈴酸A 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程得y=837.224x+12.416 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，線性范圍為0.007 5～0.150 μg/mL。將對(duì)照品溶液用甲醇逐級(jí)稀釋，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，該方法檢出限為0.001 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取杜仲壯骨丸樣品，按照1.4 方法平行制備6份樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.96%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)馬兜鈴酸A 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 %

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定含量的杜仲壯骨丸樣品6 份，每份約0.1 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入馬兜鈴酸A 對(duì)照品1 mL，然后按1.4 方法制備樣品溶液。在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算馬兜鈴酸A 的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，馬兜鈴酸A 平均回收率為99.27%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批杜仲壯骨丸樣品，按1.4 樣品處理方法制備樣品溶液，在制備完成后第0、2、6、8、12、24 h分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了反相高效液相色譜法測(cè)定杜仲壯骨丸中馬兜鈴酸A 含量的方法，該方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性，以及較高的準(zhǔn)確度，方法易于操作、相關(guān)試劑價(jià)廉易得，可用于中藥復(fù)方制劑杜仲壯骨丸的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)。