新型冠狀病毒Omicron變異株利用多種動(dòng)物ACE2作為受體侵入細(xì)胞的能力

邱雅若 李星霖 陳丹瑛 劉永梅 宋焱君 李國(guó)力 宋 川 王 璽 趙學(xué)森

(1. 北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院，北京 100015；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所，北京 100015 )

截至2022年3月1日，新型冠狀病毒肺炎疫情在全球累計(jì)確診病例超過4億，累計(jì)死亡病例達(dá)到590多萬[1-2]。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組長(zhǎng)度為30 kb[3]。結(jié)構(gòu)蛋白包括刺突蛋白S、包膜蛋白E、基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N[3]。刺突蛋白S由S1和S2亞基組成，可以利用來自不同動(dòng)物的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ (angiotensin-converting enzyme Ⅱ，ACE2) 侵入宿主細(xì)胞[4-5]，該過程是病毒成功侵入細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。

SARS-CoV-2在傳播的過程中不斷產(chǎn)生突變，Omicron(B.1.1.529)變異株于2021年11月24日首次由南非報(bào)告給世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization, WHO)，此后該變異株迅速成為南非的主要流行株，并傳播至全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，截至2022年2月全球共有80多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告了Omicron株感染病例[6]。目前已有研究[6-7]表明，與其他關(guān)切變異株(variant of concern, VOC)相比，Omicron變異株出現(xiàn)免疫逃逸和再次感染的風(fēng)險(xiǎn)增加，這對(duì)全球新型冠狀病毒肺炎(COVID-19) 疫情防控提出了新的挑戰(zhàn)。

與之前發(fā)現(xiàn)的變異株相比，Omicron變異株具有更多的突變位點(diǎn)，其中Spike蛋白上的突變位點(diǎn)為32個(gè)[8]；而2020年在印度和其他國(guó)家引發(fā)大流行的Delta變異株，在Spike蛋白上僅有8個(gè)突變[9]。因此，Han等[10]認(rèn)為Omicron株和ACE2之間的親和力將會(huì)發(fā)生改變。此外，在Omicron株中檢測(cè)到的突變,有很多在之前的SARS-CoV-2變異株中幾乎沒有被報(bào)道過，這讓人們對(duì)Omicron的進(jìn)化和來源產(chǎn)生了一些爭(zhēng)議[11]，即Omicron株的變異過程具體是發(fā)生在哪些動(dòng)物身上[12]。由此可見，驗(yàn)證Omicron變異株可能存在的中間宿主是有必要的。

已有研究[4]證明Omicron變異株可利用來自人類、果子貍、大鼠、穿山甲等哺乳動(dòng)物的ACE2受體侵入細(xì)胞，但是否可以利用其他哺乳動(dòng)物(如兔、浣熊狗)的ACE2受體侵入細(xì)胞仍有待研究。為了研究Omicron株可能存在的潛在中間宿主，證明其潛在的種間傳播能力，本研究利用本實(shí)驗(yàn)室所建立的Omicron假病毒感染系統(tǒng)，驗(yàn)證Omicron株利用13種不同哺乳動(dòng)物來源的ACE2受體的能力，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人類ACE2質(zhì)粒、果子貍ACE2質(zhì)粒、中華菊頭蝠ACE2質(zhì)粒、豬獾A(chǔ)CE2質(zhì)粒、雪貂獾A(chǔ)CE2質(zhì)粒、貓科動(dòng)物ACE2質(zhì)粒、大鼠ACE2質(zhì)粒、墨西哥無尾蝠ACE2質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室提供；浣熊狗ACE2質(zhì)粒由加拿大西安大略大學(xué)Dr. Hanxin Lin饋贈(zèng)；293T細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室提供；細(xì)胞培養(yǎng)皿、12孔板、 96孔板、磷酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、胎牛血清均購自美國(guó)Corning公司；0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶與DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；Turbo轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國(guó)Thermoscientific公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建蛋白表達(dá)質(zhì)粒

首先將來自13種不同哺乳動(dòng)物的ACE2分子被克隆至修飾后的pcDNA3.1載體(pcDNA3.1-N-Myc/C-C9)。從該載體表達(dá)的ACE2蛋白在氨基(N)末端含有Myc標(biāo)簽，在羧基(C)端含有C9標(biāo)簽。再從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) GenBank數(shù)據(jù)庫下載VSV-G蛋白及新型冠狀病毒野生型的DNA序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后合成至pSecTag2載體上，獲取單克隆質(zhì)粒后大量擴(kuò)增，測(cè)序鑒定其序列正確。隨后將密碼子優(yōu)化后的Omicron株S蛋白序列送至生物公司合成至pSecTag2載體上。通過PCR定點(diǎn)突變以及分子克隆，構(gòu)建新型冠狀病毒D614G株、Delta株的S蛋白表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序鑒定其序列正確。

1.2.2 包裝D614G株、Delta株及Omicron 株VSV-ΔG-luc假病毒

用0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶消化并接種293T細(xì)胞至6孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h；待6孔板細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，按照Lipo 2000轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染新型冠狀病毒Spike蛋白表達(dá)質(zhì)粒。6 h后每孔以3.0×104TCID 50/mL的濃度感染VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒，并補(bǔ)充2 mL新鮮培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h后，每孔更換4 mL新鮮培養(yǎng)基；收取轉(zhuǎn)染后48 h及72 h的細(xì)胞上清液，經(jīng)0.45 μm的聚醚砜(polyethersulfone，PES)濾膜濾過，分裝后于-80 ℃儲(chǔ)存，即獲得SARS-CoV-2 D614G株、Delta株及Omicron株的VSV-ΔG-luc假病毒。

1.2.3 假病毒感染實(shí)驗(yàn)

用0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶消化并接種293T細(xì)胞至12孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h；待12孔板中的293T細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，按照Turbofect轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染不同動(dòng)物來源的ACE2質(zhì)粒和pcDNA3.1空載質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞消化并接種至96孔板，37 ℃ 培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；待96孔板中的細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，將病毒按1∶5比例進(jìn)行稀釋，每孔加入100 μL假病毒稀釋液；感染24 h后，棄掉病毒液。每孔加入30 μL細(xì)胞裂解液，室溫下放置10 min，待細(xì)胞充分裂解后，每孔加入50 μL熒光素酶底物，立即置于熒光素發(fā)光儀器上讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Omicron的Spike蛋白高度突變

根據(jù)全球共享流感數(shù)據(jù)庫(Global Initiative on Sharing all Influenza Data, GISAID)[13-14]發(fā)布的Omicron變異株基因組序列信息顯示，Omicron株和其他已知的VOC基因序列存在顯著差異，其在Spike蛋白上有32個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，主要集中于受體結(jié)合域(receptor-binding domain, RBD)和N段(N-terminal domain, NTD)(圖1)。

圖1 SARS-CoV-2 D614G、Delta、Omicron變異株Spike蛋白的示意圖概括和結(jié)構(gòu)域分布Fig.1 Overview and domain distribution of spike proteins of SARS-CoV-2 D614G, Delta, and Omicron variantsGISAID: Global Initiative on Sharing all Influenza Data; NTD：N-terminal domain; RBD：receptor-binding domain; TD：terminal domain.

2.2 新型冠狀病毒Omicron變異株可有效利用多種動(dòng)物的ACE2進(jìn)入細(xì)胞

結(jié)果顯示，不同ACE2的表達(dá)并不影響 Lassa virus (LASV) 對(duì)細(xì)胞的侵入，但卻明顯增強(qiáng)了D614G株、Delta株和Omicron株對(duì)細(xì)胞的侵入(圖2)。與D614G株和Delta株相比，Omicron利用中華菊頭蝠和

圖2 與D614G和Delta spike相比，Omicron spike以不同的效率介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞系，有效利用不同動(dòng)物的ACE2受體侵入細(xì)胞Fig.2 Compared to D614G and Delta spikes, Omicron spike mediate entry into cell lines with different efficiencies, effectively utilizing ACE2 receptors from different animals to invade cellsn=3； ACE2:angiotensin-converting enzyme Ⅱ;LASV: Lassa virus.

雪貂獾的ACE2的能力顯著減弱(P<0.05)。此外，與D614G株相比，Omicron株利用中華菊頭蝠、墨西哥無尾蝠、雪貂獾、豬獾、貓、兔和穿山甲的ACE2受體侵入細(xì)胞的能力降低(P<0.05)；與Delta株相比，Omicron株利用中華菊頭蝠、雪貂獾、豬獾和貓的ACE2受體侵入細(xì)胞的能力降低(P<0.05)。

3 討論

目前對(duì)新冠肺炎疫情防治而言，最大的困難即是病毒不斷地發(fā)生突變，產(chǎn)生新的變異株，這些變異株都出現(xiàn)了不同程度的免疫逃逸，以及毒力和傳染性的增強(qiáng)。目前WHO一共命名了5種VOC，分別是Alpha株(B.1.1.7)、Beta株(B.1.351)、Gamma株(P.1)、Delta株(B.1.617.2)和Omicron株(B.1.1.529)。與之前發(fā)現(xiàn)的變異株相比，Omicron變異株具有更多的突變位點(diǎn)[8-9]，其中不乏一些從未出現(xiàn)過的位點(diǎn)，RBD是病毒中首先與細(xì)胞接觸的部分，RBD與ACE2的親和力決定了SARS-CoV-2 的傳染性[15]。Chen等[16]在Omicron的RBD上共發(fā)現(xiàn)了15個(gè)突變，包括K417N、S477N、T478K、E484A、N501Y、G339D、S371L、S373P、S375F、N440K、G446S、Q493R、G496S、Q498R和Y505H，突變位點(diǎn)遠(yuǎn)超于之前發(fā)現(xiàn)的VOC，這意味著Omicron變異株的毒力和傳染性可能發(fā)生了顯著的變化[6, 14]。RBD中的一些突變是Omicron株特有的，比如G339D、S371L、S373P、S375F[4]，這可能提示在Omicron株進(jìn)化的過程中，存在特有的中間宿主或潛在擴(kuò)增宿主。

研究[12]表明，Omicron變異株的Q493R和Q498R突變?cè)趧e的VOC中不曾出現(xiàn)，卻在小鼠來源的突變體中被發(fā)現(xiàn)，因此懷疑小鼠是Omicron變異株的重要中間宿主，推進(jìn)了Omicron株的突變。本研究結(jié)果表明，在13種不同哺乳動(dòng)物來源的ACE2受體中，Omicron株利用小鼠ACE2受體的能力并沒有顯著優(yōu)勢(shì)，這提示在Omicron株的進(jìn)化過程中存在不止一個(gè)關(guān)鍵中間宿主。

目前已有研究[6-7]表明，Omicron變異株會(huì)造成康復(fù)患者的再次感染[6]，并且出現(xiàn)了明顯的免疫逃逸[7]。因此，不少人都認(rèn)為Omicron株將給世界帶來新一輪的疫情風(fēng)暴。Omicron變異株的出現(xiàn)給全球疫情防治帶來了新的挑戰(zhàn)，其傳播能力、毒力、致病性均發(fā)生了改變。Du等[11]推測(cè)Omicron株出現(xiàn)的原因可能是某種動(dòng)物群體感染了SARS-CoV-2，病毒在動(dòng)物群體傳播過程中發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化，突變速率遠(yuǎn)高于人類，隨后溢出傳染到人類。因此，本研究選取了Omicron變異株作為研究對(duì)象，且以在全球廣泛傳播的D614G株和Delta株作為對(duì)照，探討Omicron株利用不同動(dòng)物受體侵入細(xì)胞的能力，以進(jìn)一步探索其進(jìn)化來源及其跨物種傳播的特性。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室獲得的多種動(dòng)物來源的ACE2受體分子，結(jié)合VSV假病毒感染系統(tǒng)，證實(shí)Omicron株除了可利用人類、果子貍、穿山甲等動(dòng)物的ACE2受體之外，還可以有效利用兔、小鼠、浣熊狗等動(dòng)物的受體分子侵入細(xì)胞，這提示Omicron株在進(jìn)化過程中可能利用了多種動(dòng)物作為中間宿主?？偟膩碚f，本研究結(jié)果表明，Omicron株在Spike蛋白的大量突變并不影響其利用多種動(dòng)物的ACE2作為受體分子侵入細(xì)胞的能力，這意味著Omicron存在多種可能的跨宿主傳播途徑來感染人類。