乳腺癌中PGRMC1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

趙 越 阮祥燕 程姣姣 谷牧青 許 新 王月姣

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院內(nèi)分泌科，北京 100026)

每位女性都會(huì)經(jīng)歷絕經(jīng)，其中大部分會(huì)出現(xiàn)絕經(jīng)相關(guān)癥狀，這影響了中老年女性的健康并顯著降低了其生活質(zhì)量。到目前為止，絕經(jīng)激素治療(menopausal hormone therapy, MHT)是治療絕經(jīng)相關(guān)癥狀和預(yù)防骨質(zhì)疏松等最有效的方法[1-2]。然而，MHT的安全性問題，如乳腺癌，仍是困擾醫(yī)生和患者的重要問題[3]。在我國，乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。近年來，乳腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，55～65歲為第二個(gè)發(fā)病高峰，已逐漸成為威脅女性生命健康最常見的疾病之一[4-5]。目前，全球?qū)θ橄侔┌l(fā)病機(jī)制做了很多研究，而對(duì)于激素應(yīng)用過程中乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增高的原因，則沒有定論。乳腺癌是激素依賴性腫瘤，其生長受雌激素受體、孕激素受體調(diào)控?，F(xiàn)今普遍認(rèn)為其受體表達(dá)對(duì)判斷乳腺癌患者的預(yù)后、選擇治療方案和預(yù)測療效等方面都有重要意義[6]。

本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究[7-10]中發(fā)現(xiàn)孕激素受體膜組分1(progesterone receptor membrane component 1, PGRMC1)在乳腺癌組織中高表達(dá)，很可能是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子?；赑GRMC1在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要的作用，尤其是預(yù)測腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級(jí)等重要的與侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)的指標(biāo)，本研究將分析乳腺癌組織、乳腺良性腫瘤組織中PGRMC1表達(dá)的差異情況，同時(shí)分析乳腺癌患者中PGRMC1與人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, Her-2)、細(xì)胞增殖核抗原(nuclear-associated antigen, Ki-67)及雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體 (progesterone receptor, PR)表達(dá)之間可能存在的聯(lián)系，為明確PGRMC1與乳腺癌惡性增殖間的相關(guān)性提供相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年9月至2019年1月間于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院乳腺外科就診診斷為乳腺癌的患者的乳腺癌組織標(biāo)本90例，患者年齡24～70歲，年齡中位數(shù)為47歲。乳腺良性疾病標(biāo)本60例，正常乳腺組織60例(來自經(jīng)乳腺麥默通微創(chuàng)旋切良性疾病周圍1 cm左右的正常組織，病理證實(shí)乳腺組織無異常者)，60例乳腺良性疾病患者年齡26～65歲，年齡中位數(shù)為45歲，均為女性，所有組織來源者在術(shù)前經(jīng)空心針活檢或經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：IEC-B-03-V01-FJ1)，所有入組參加研究者均自愿簽署知情同意書。

1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①乳腺癌：病理診斷乳腺癌(無論有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，無其他惡性腫瘤治療史，所有患者均未經(jīng)過任何術(shù)前針對(duì)性治療，足夠可利用的組織標(biāo)本。②乳腺良性疾?。喝橄倮w維腺瘤，乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤，乳腺囊性增生病。

2)排除標(biāo)準(zhǔn)：男性乳腺癌，術(shù)前接受任何形式新輔助化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)、靶向治療等的患者，近3個(gè)月內(nèi)接受激素替代治療者。

1.2 蠟塊制備、免疫組化檢測

實(shí)驗(yàn)組織取材1.0×1.0×0.5 cm3，以4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定1周。組織流水沖洗過夜，脫水、透明及浸蠟。石蠟包埋的病理組織塊，行4 μm厚連續(xù)切片7張，進(jìn)行免疫組化及蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色。采用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，用一只陽性切片作為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒方法介紹進(jìn)行。ER 1∶100、PR 1∶50、Her-2 1∶200、Ki-67 1∶300、PGRMC1 1∶100稀釋原液備用。石蠟切片脫蠟至水后進(jìn)行抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、血清封閉、加一抗、二抗[一抗是山羊來源的用10%(體積分?jǐn)?shù))正常兔血清封閉，一抗其他來源的用3%(體積分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白封閉]。二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)顯色、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片。采用組織切片掃描儀及Pannoramic viewer軟件存儲(chǔ)切片，免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分進(jìn)行閱片[11]。

1.3 病理診斷及評(píng)估

所有患者病理診斷依據(jù)術(shù)后病理診斷結(jié)果。乳腺癌組織學(xué)類型：浸潤性導(dǎo)管癌80例，浸潤性小葉癌5例，導(dǎo)管內(nèi)癌1例，乳頭狀癌3例，髓樣癌1例；病理診斷和分期按照美國癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)修訂的乳腺癌分期(第7版)標(biāo)準(zhǔn)[12]；組織學(xué)病理分級(jí)依照世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization, WHO)的標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行分級(jí)：Ⅰ級(jí)21例，Ⅱ級(jí)38例，Ⅲ級(jí)31例。乳腺良性疾病組織學(xué)類型：乳腺腺病(瘤)24例，乳腺纖維腺瘤28例，乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤8例。

1.4 免疫組化結(jié)果的判讀和評(píng)估

將未經(jīng)化療的陽性乳腺癌組織切片作為陽性對(duì)照，同時(shí)用抗體稀釋液代替一抗作為陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)具有代表性的視野觀察陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度，其中ER、PR、Ki-67的陽性以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色為主，少數(shù)為較弱的細(xì)胞質(zhì)染色；PGRMC1、Her-2表達(dá)產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜，以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色或者棕黃色判定為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)>5%為陽性(+)，≤5%為陰性(-)。蘇木精染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法。PGRMC1陽性表達(dá)與相關(guān)因子間的關(guān)系采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者基本信息、臨床病理特征及PGRMC1表達(dá)情況比較

乳腺癌組織、乳腺良性疾病組織及正常乳腺組織患者基本信息、臨床病理特征及PGRMC1等相關(guān)蛋白表達(dá)情況，詳見表1。乳腺癌組織HE染色鏡下顯示，乳腺癌組織學(xué)Ⅰ級(jí)：癌細(xì)胞以腺樣、索狀結(jié)構(gòu)為主，核仁均不明顯，核分裂罕見(圖1A)。乳腺癌組織學(xué)Ⅱ級(jí)：癌細(xì)胞以索狀和巢團(tuán)狀排列為主，腺樣少見，核分裂易見(圖1B)。乳腺癌組織學(xué)Ⅲ級(jí)：癌細(xì)胞以巢團(tuán)為主，細(xì)胞核多形性和分裂象均較顯著，核仁易見(圖1C)。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中PGRMC1的表達(dá)陽性率為63.33%(57/90)，乳腺良性疾病組織中的表達(dá)陽性率為28.33%(17/60)，正常對(duì)照組PGRMC1表達(dá)陽性率僅為6.67%(4/60)，3組間PGRMC1的表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 PGRMC1、ER、PR、Her-2、Ki-67蛋白表達(dá)情況及臨床基本特征Tab.1 Expression of PGRMC1, ER, PR, Her-2, Ki-67 and clinical basic characteristics n(%)

圖1 不同分級(jí)的乳腺癌組織Fig.1 Different grade of breast cancer tissue (HE staining，200×)

各組PGRMC1的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，乳腺癌組織中細(xì)胞膜棕色深染、著色強(qiáng)度明顯(圖2A、2D)；乳腺良性疾病組織中細(xì)胞膜淡黃色染色，著色強(qiáng)度中等(圖2B、2E)；正常乳腺組織中細(xì)胞膜幾乎無染色，著色強(qiáng)度弱(圖2C、2F)。

圖2 PGRMC1在乳腺癌、乳腺良性疾病及正常乳腺組織的表達(dá)Fig.2 Expression of PGRMC1 in breast cancer, benign breast diseases and normal breast tissues

2.2 PGRMC1在乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理生物學(xué)特征的關(guān)系

腫瘤直徑大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)高的乳腺癌患者，PGRMC1陽性表達(dá)率升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而與患者的月經(jīng)情況無關(guān)(P>0.05)，詳見表2。

表2 PGRMC1在乳腺癌中的陽性表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 PGRMC1 expression and the correlation between PGRMC1 expression and clinicopathological features n(%)

2.3 PGRMC1與相關(guān)受體、標(biāo)志物表達(dá)間的相關(guān)性

配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌組中的PGRMC1表達(dá)與ER、Ki-67、PR、Her-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組中PGRMC1表達(dá)與ER的關(guān)系最為密切，其次是Ki-67，而與PR、Her-2表達(dá)的關(guān)系較弱,詳見表3。

表3 PGRMC1在乳腺癌中的表達(dá)及與其他指標(biāo)的關(guān)系Tab.3 Correlation between PGRMC1 expression and ER, PR, Ki-67 and Her-2 expression in breast cancer

乳腺良性疾病組中，PGRMC1表達(dá)與ER、PR的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而PGRMC1表達(dá)與Ki-67及Her-2表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺良性疾病組中PGRMC1表達(dá)與Ki-67(r=0.569)表達(dá)關(guān)系的密切程度大于Her-2(r=0.228)表達(dá)，詳見表4。

表4 PGRMC1在乳腺良性疾病中的表達(dá)及與其他指標(biāo)的關(guān)系Tab.4 Correlation between PGRMC1 expression and ER, PR, Ki-67 and Her-2 expression in benign breast disease

3 討論

規(guī)范的絕經(jīng)激素治療自20世紀(jì)始應(yīng)用于臨床，現(xiàn)已成為全面解決絕經(jīng)相關(guān)健康問題首選的臨床醫(yī)療措施。MHT是一種性激素補(bǔ)充治療方案，針對(duì)女性因生殖功能衰老，性激素缺乏引起的身體異常癥狀，預(yù)防心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松、早老性癡呆、改善性生活質(zhì)量，是目前其他任何單一藥物不能替代的，但廣大女性在考慮MHT的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)仍然將乳腺病變列為重中之重。我國診斷為乳腺癌的年齡為45～55歲，其中62.9%的女性被診斷為乳腺癌時(shí)還未絕經(jīng)[14-15]。因此臨床需求的客觀存在使得人們不可能放棄MHT。因此多年來研究者關(guān)注MHT的焦點(diǎn)實(shí)際上在于其治療所帶來的一系列風(fēng)險(xiǎn)，尤其是乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)在最近10余年更成為研究的熱點(diǎn)。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，臨床上可通過腫瘤分子生物學(xué)因子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)來評(píng)估腫瘤的生物學(xué)特征，從而進(jìn)一步指導(dǎo)腫瘤的臨床治療。ER、PR、Her-2具有指導(dǎo)乳腺癌臨床內(nèi)分泌治療和評(píng)估預(yù)后的作用[16]。PGRMC1是近年發(fā)現(xiàn)的新型膜激素受體，可能與激素相關(guān)腫瘤的惡性增殖及化療敏感性密切相關(guān)，尤其是作為乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的新的生物學(xué)標(biāo)志物具有良好前景[17-18]。明確PGRMC1與乳腺癌惡性增殖間的相關(guān)性，這是本研究力求解決的科學(xué)問題。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測了乳腺癌組織、乳腺良性疾病組織及正常乳腺組織中PGRMC1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PGRMC1在乳腺癌組織中陽性率為63.33%，在乳腺良性疾病中為28.33%，在正常乳腺組織中僅為6.67%，可見PGRMC1在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，但表達(dá)水平不一，部分強(qiáng)陽性表達(dá)，部分僅可見淡黃色陽性顆粒，故進(jìn)一步深入探討了PGRMC1的表達(dá)與乳腺癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示PGRMC1的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及組織學(xué)分級(jí)間高度相關(guān)，這提示PGRMC1可能可以作為指導(dǎo)乳腺癌治療及預(yù)后的新指標(biāo)。

本研究同時(shí)顯示在乳腺癌組織中PGRMC1的表達(dá)與ER的關(guān)系最為密切，其次是Ki-67，而與PR、Her-2表達(dá)的關(guān)系較弱，這也進(jìn)一步提示：孕激素與PGRMC1結(jié)合促乳腺癌細(xì)胞惡性增殖可能與參與調(diào)控ER信號(hào)通路有關(guān)。但具體機(jī)制不明，相關(guān)機(jī)制研究仍亟待解決。

在接下來的研究中，筆者將進(jìn)一步篩選出ER+乳腺癌中PGRMC1調(diào)控蛋白如Akt、IkB、Bad、c-Jun、Caspase-3等，闡明PGRMC1與ER相關(guān)信號(hào)通路的相互作用機(jī)制。同時(shí)免疫組化檢測Her-2的表達(dá)只是從蛋白水平上做一初步篩查，而聯(lián)合熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測才是檢測有無Her-2基因擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)[19]，接下來的研究中筆者將采用FISH檢測法檢測乳腺癌組織中Her-2表達(dá)情況，分析PGRMC1與經(jīng)典Her-2間表達(dá)的相關(guān)性。為將來建立一套關(guān)于PGRMC1對(duì)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的預(yù)測系統(tǒng)，指導(dǎo)臨床激素治療的安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。