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    抗腫瘤多肽M1-21 的劑型優(yōu)化

    2022-06-28 11:56:02譚擁軍裴超柱程浩杰卜會銅譚桂湘鄧?yán)?/span>
    關(guān)鍵詞:多肽靶向納米

    譚擁軍,裴超柱,程浩杰,卜會銅,譚桂湘,鄧?yán)?/p>

    (湖南大學(xué)生物學(xué)院,湖南長沙 410082)

    自1920 年胰島素療法問世以來,多肽藥物以持續(xù)穩(wěn)定的速度進(jìn)入臨床開發(fā)[1].天然多肽由于較差的化學(xué)和物理穩(wěn)定性以及較短的血漿半衰期,通常不適合直接用于治療,已經(jīng)利用許多化學(xué)的修飾的方法,或增強(qiáng)肽的二級結(jié)構(gòu)(即折疊)來防止被蛋白水解酶降解,從而改善多肽藥物的體內(nèi)半衰期[2-5].

    多肽可自組裝成不同的結(jié)構(gòu),包括納米管、納米球、納米線和納米纖維[6].這些有序納米結(jié)構(gòu)的形成與各種分子間非共價相互作用的協(xié)同效應(yīng)有關(guān),包括氫鍵、π-π 堆積、靜電、疏水和范德華相互作用[7].自組裝球形肽(NPs)直徑小于100 nm,由于易被細(xì)胞吸收特別適合生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.NPs 還可以在自組裝過程中將疏水性藥物加載到其內(nèi)核中,從而使其成為藥物遞送系統(tǒng)的理想候選藥物[8-9].較小的顆粒(<100 nm)避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)立即清除,而較大的顆粒(>250 nm)通過吞噬作用和腎臟的天然過濾系統(tǒng)迅速清除[10].腫瘤血管系統(tǒng)的高滲透性允許大分子和納米顆粒進(jìn)入腫瘤間質(zhì)空間,這種自發(fā)性積累或“被動”靶向作用被稱為增強(qiáng)的通透性和保留(EPR)效應(yīng),EPR 效應(yīng)介導(dǎo)的藥物遞送目前被認(rèn)為是將藥物引入腫瘤的有效方法,特別是大分子藥物和載有藥物的藥物納米載體[11-12].

    本課題組篩選出了一種來源于FOXM1 的抗腫瘤多肽M1-21(專利號:CN108440671B),已經(jīng)展現(xiàn)出抗腫瘤效果[13],具體的藥理機(jī)制已經(jīng)完成正在投稿中.我們通過去溶劑化的方式,使抗腫瘤多肽M1-21 自組裝形成一定大小的納米顆粒,增強(qiáng)了多肽的二級結(jié)構(gòu),不易被水解酶快速降解,并且Nano-M1-21 可通過EPR 效應(yīng)在腫瘤組織部位富集,更好地發(fā)揮抗腫瘤的效果.

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    二氯樹脂、氨基酸購于希施生物科技有限公司,DMF、PIP、DIEA、HBTU、DCM、TFA、EDT、TIS、無水乙醚、乙腈(色譜級)、無水乙醇、甲醇、異丙醇、吡啶等購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,DMEM 培養(yǎng)基購于GIBCO 公司,胎牛血清(FBS)為Hyclone 公司產(chǎn)品,乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、4T1 細(xì)胞購自TACC,臺盼藍(lán)、FITC、BCA 試劑盒購自生工生物工程有限公司,balb/c小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司.

    1.2 方 法

    1.2.1 設(shè)置程序進(jìn)行多肽M1-21 的合成以及純化、鑒定、標(biāo)記

    利用全自動多肽合成儀合成多肽M1-21[圖2(a)],合成的多肽粗品在蛋白純化儀上使用C18 柱反向?qū)游鲞M(jìn)行純化,流動相分別是水(0.05%TFA)和乙腈(0.05%TFA),乙腈上升洗脫.先對純化出的多肽進(jìn)行質(zhì)譜定性分析,再用高效液相色譜儀對純化的多肽M1-21 進(jìn)行純度檢測,采用C18 柱反向?qū)游鲞M(jìn)行,流動相分別是水(0.05%TFA)和乙腈(0.05%TFA),乙腈上升洗脫,最后軟件積分求出峰面積百分比.用過量摩爾比的FITC 對多肽進(jìn)行標(biāo)記,F(xiàn)ITC 粉末溶于Py∶DMF∶DCM=12∶7∶5 的混合溶液中,再與連有多肽的二氯樹脂混合反應(yīng)6 h,反應(yīng)結(jié)束后用DMF、異丙醇、DCM,先后各洗兩遍,再用切割液將標(biāo)記好的多肽切割下來,用9 倍體積乙醚進(jìn)行沉淀,凍干.

    1.2.2 單體M1-21 去溶劑化形成Nano-M1-21 及表征

    10 mg 的多肽M1-21 溶于1 mL 的1*PBS 中,取100 μL 于反應(yīng)瓶中,置于磁力加熱攪拌器上(600 r/min,25 ℃)攪拌,以1 mL/min 的流速加入4 倍體積的無水乙醇,持續(xù)攪拌20 min,18 000 g 離心收集沉淀,用PBS 清洗沉淀,去上清,再用PBS 超聲重懸Nano-M1-21.最后用BCA 試劑盒測量Nano-M1-21 的濃度(圖1).動態(tài)光色散(DLS)儀測量納米顆粒流體動力學(xué)直徑及其分布.取10 μL 乙酸鈾染色的Nano-M1-21 懸浮液滴吸附在碳涂層的300 目銅網(wǎng)上5 min,然后用濾紙除去殘留的液體,干燥,再進(jìn)行TEM 觀察.

    圖1 Nano-M1-21的制備Fig.1 Preparation of Nano-M1-21

    1.2.3 Nano-M1-21細(xì)胞水平效果驗(yàn)證

    將MCF-7、MDA-MB-231、4T1 乳腺癌細(xì)胞鋪到24 孔板中,待細(xì)胞貼壁后,按10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM 的濃度分別加入M1-21、Nano-M1-21,36 h 后去上清加入0.04%的臺盼藍(lán)溶液處理3~5 min,去除臺盼藍(lán)溶液并用PBS 清洗兩遍,顯微鏡下拍照,再進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù).按照上述方法,將FITC 標(biāo)記的M1-21 與未標(biāo)記的多肽按1∶9 的比例混合制備帶熒光的Nano-M1-21,按照前面相同的方法測量濃度以及表征.再按30 μM 的濃度加入到MCF-7,MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中處理2 h,然后觀察熒光判斷M1-21、Nano-M1-21進(jìn)入細(xì)胞的情況.

    1.2.4 Nano-M1-21動物水平效果驗(yàn)證

    狀態(tài)較好的balb/c 小鼠,年齡達(dá)到6 周后,皮下接種5×105個4T1 乳腺癌細(xì)胞建立皮下實(shí)體瘤模型.3 d 后,M1-21、Nano-M1-21 分別以25 mg/kg 的劑量尾靜脈給藥,隔天給藥一次,并對小鼠體重和腫瘤大小進(jìn)行測量.

    2 結(jié)果

    2.1 多肽M1-21的合成與鑒定

    為了檢測多肽合成的質(zhì)量,我們通過質(zhì)譜分析多肽M1-21[圖2(a)],質(zhì)譜結(jié)果顯示[圖2(b)]在3560處有明顯峰圖,與M1-21相對分子質(zhì)量一致,說明多肽M1-21 合成成功,并且高效液相色譜檢測純化后的M1-21濃度高達(dá)96.161%[圖2(c)].

    圖2 多肽M1-21的鑒定及純度檢測Fig.2 Identification and purity detection of peptide M1-21

    2.2 Nano-M1-21的制備與表征

    單體多肽M1-21通過去溶劑化自組裝形成納米顆粒(圖1),TEM和DLS的結(jié)果顯示納米顆粒大小均勻地分布在50 nm 左右[圖3(a)(b)].體外37 ℃穩(wěn)定性測試(DLS 檢測)可知,24 h 后納米顆粒的大小主要分布在45 nm 左右,48 h 后大小主要分布在27 nm左右,8 d后納米顆粒大小一直維持在27 nm左右[圖3(c)],說明納米顆粒在37 ℃下具有比較好的穩(wěn)定性,不會完全解聚為單體.

    圖3 Nano-M1-21的表征Fig.3 characterization of Nano-M1-21

    2.3 細(xì)胞水平上Nano-M1-21能更好地抑制腫瘤細(xì)胞的活力

    為了驗(yàn)證Nano-M1-21 的效果,在MDA-MB-231、MCF-7、4T1 乳腺癌細(xì)胞中,將M1-21 和Nano-M1-21按濃度梯度分別加入這三種腫瘤細(xì)胞中,36 h后,用臺盼藍(lán)染色后活細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),Nano-M1-21達(dá)到和M1-21 單體多肽相同的效果所需的量更少.在MDA-MB-231、MCF-7和4T1細(xì)胞中,相對于M1-21,Nano-M1-21 的IC50 分別減少1.53 倍、3.37 倍以及1.5倍(見圖4).

    圖4 Nano-M1-21能更好地抑制腫瘤細(xì)胞的活力Fig4 Nano-M1-21 can better inhibit the activity of tumor cells

    2.4 Nano-M1-21更易于被細(xì)胞吸收

    按照前面去溶劑的方法,將FITC 標(biāo)記的M1-21和未標(biāo)記的M1-21 按1∶9 混合制備了帶熒光的Nano-M1-21,DLS 和TEM 表征發(fā)現(xiàn),顆粒大小均勻分布在50 nm 左右[圖5(a)(b)].在MDA-MB-231、MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中,熒光圖[圖5(c)(d)]可知Nano-M1-21更易于被細(xì)胞吸收,可能由于納米化后改變了細(xì)胞對M1-21 的攝取方式,明場細(xì)胞圖發(fā)現(xiàn)Nano-M1-21組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變.

    圖5 Nano-M1-21更易于被腫瘤細(xì)胞吸收Fig5 Nano-M1-21 is more easily absorbed by tumor cells

    2.5 Nano-M1-21 明顯抑制balb/c 荷瘤小鼠腫瘤的生長

    在balb/c小鼠皮下實(shí)體瘤模型中,通過隔天尾靜脈給藥進(jìn)行治療,給藥過程中[圖6(a)],小鼠體重沒有發(fā)生明顯變化[圖6(b)],Nano-M1-21比起M1-21單體肽展現(xiàn)出更好的抑瘤效果[圖6(c)],治療結(jié)束后,將小鼠處死,取出每組皮下瘤觀察大?。蹐D6(d)]并稱量瘤子的質(zhì)量[圖6(e)],這些結(jié)果都表明,在小鼠腫瘤模型中Nano-M1-21有更好的抑瘤效果.

    圖6 Nano-M1-21在小鼠腫瘤模型中有比較好的抑瘤效果Fig6 Nano-M1-21 has a better anti-tumor effect in mouse tumor models

    3 討論

    肽類藥物給藥后可能受到蛋白水解酶降解或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)而受到限制,所以將多肽充分遞送至腫瘤部位是具有挑戰(zhàn)性的[14].因此,部分肽類藥物需要改進(jìn)其遞送方式以成功開發(fā)出抗癌肽.藥物遞送研究的基本目標(biāo)是通過改善治療分子的遞送來提高治療分子的功效.制劑、控釋、遞送途徑和保存期限的改進(jìn)大大提高了治療效果[15-19].納米顆粒已被用于改善小分子抗癌藥(例如阿霉素和紫杉醇)的藥代動力學(xué)特性和治療效果[20].通過這種方式,納米顆粒具有通過增強(qiáng)滲透和保留(EPR)效應(yīng)在腫瘤微環(huán)境中維持藥物暴露的能力[21].另外,可以用與腫瘤細(xì)胞表面特異性的靶標(biāo)結(jié)合的配體來修飾納米顆粒[22],從而達(dá)到抗癌藥物靶向腫瘤治療的效果.

    因此,我們在具有抗腫瘤效果的多肽M1-21 的基礎(chǔ)上,通過去溶劑化的方式,使單體多肽分子間在疏水力的相互作用下自組裝形成50 nm 左右的多肽納米顆粒.納米化后,細(xì)胞對顆粒物質(zhì)進(jìn)行胞吞,納米顆粒的大小會影響它與細(xì)胞膜的相互作用,并最終影響細(xì)胞內(nèi)吸收,直徑約50 nm 的納米顆粒通常更容易被細(xì)胞吸收[23],因此M1-21 單體多肽通過納米化后易于被細(xì)胞吸收,改善了多肽對于腫瘤的抑制效果.而自組裝方法可用于治療性肽藥物的劑型改造,以改善其穩(wěn)定性和治療活性,從而開發(fā)無載體的藥物遞送系統(tǒng).在本次研究中,Nano-M1-21 在小鼠腫瘤模型中取得了比較好的抗腫瘤活性,但Nano-M1-21 通過EPR 效應(yīng)在腫瘤部位的富集以及延長其代謝周期還需進(jìn)一步驗(yàn)證.除了通過M1-21本身自組裝形成納米顆粒完成遞送外,還可嘗試其他可自組裝的兩親性材料(脂質(zhì)體等)來完成多肽M1-21 的遞送,這兩種方法往往只是EPR 效應(yīng)的被動靶向.想要取得更好的靶向效果,可以考慮采用主動靶向的策略,在納米粒子表面直接修飾與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的受體定向結(jié)合的配體(iRGD)來靶向腫瘤細(xì)胞.因此,多肽M1-21可嘗試結(jié)合被動靶向和主動靶向的優(yōu)化策略,達(dá)到更好的抑瘤效果.

    最后,多肽在自組裝過程中可將疏水性藥物(紫杉醇,阿霉素)載入其疏水內(nèi)核[9],那么我們的多肽M1-21 成為藥物遞送系統(tǒng)的理想候選藥物的同時也可聯(lián)合其他藥物共同治療腫瘤.一種重組蛋白(四聚體M2e)可通過去溶劑化先形成納米粒子核心,然后在其表面交聯(lián)抗原肽(HA),這種納米顆粒疫苗可誘導(dǎo)持久且強(qiáng)大的免疫力[24],所以Nano-M1-21可成為有效抗原的載體,進(jìn)入體內(nèi)關(guān)鍵區(qū)域誘導(dǎo)免疫反應(yīng).

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