長鏈非編碼RNA FOXC2-AS1在腫瘤中的研究進展

李 靜，李里香

長鏈非編碼RNA(long nocoding RNA, lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，lncRNA已被證實參與腫瘤多種復(fù)雜的生物學(xué)過程，如細(xì)胞生長、增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等[1-3]。FOXC2-AS1(又稱ODRUL)是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，是由FOXC2負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄的單條反義寡核苷酸RNA。研究表明，F(xiàn)OXC2-AS1在骨肉瘤、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等中的表達存在差異，其不僅促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，還參與腫瘤的多種生物學(xué)過程。本文現(xiàn)對FOXC2-AS1在不同腫瘤中的研究進展進行綜述，并對其研究前景進行展望。

1 FOXC2-AS1簡述

多個研究結(jié)果顯示反義寡核苷酸RNA可通過調(diào)節(jié)其內(nèi)源基因的表達，參與細(xì)胞的生理和病理過程[4-5]。FOXC2-AS1定位于人類基因組16號染色體q24.1上，全長為319個核苷酸?，F(xiàn)有研究表明，F(xiàn)OXC2-AS1在不同腫瘤中存在差異表達，其在骨肉瘤中通過FOXC2-AS1/miR-3182/MMP途徑發(fā)揮致癌作用；在肺癌和黑色素瘤中通過p15發(fā)揮致癌作用；在前列腺癌中通過FOXC2-AS1/miR-1253/EZH2途徑發(fā)揮致癌作用；在結(jié)直腸癌中通過Ca2+-FAK信號途徑發(fā)揮致癌作用。因此，F(xiàn)OXC2-AS1被認(rèn)為是未來腫瘤的治療靶點標(biāo)志物。

2 FOXC2-AS1與腫瘤的關(guān)系

隨著lncRNA的研究不斷深入，其與腫瘤的關(guān)系逐漸被認(rèn)知。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2-AS1在一些腫瘤中表達上調(diào)，特別是在骨肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等中表達上調(diào)(表1)。

表1 不同腫瘤中FOXC2-AS1的作用

2.1 FOXC2-AS1與骨肉瘤骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[6]。新輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用增加了患者保肢治療的可能性。然而，化療耐藥性的出現(xiàn)極大地阻礙患者5年生存率的提高[7]。Zhang等[8]通過qRT-PCR檢測骨肉瘤細(xì)胞系及組織中FOXC2-AS1的表達水平，發(fā)現(xiàn)在多柔比星耐藥的骨肉瘤細(xì)胞系和組織中，F(xiàn)OXC2-AS1與FOXC2共同上調(diào)。與FOXC2-AS1相似，F(xiàn)OXC2也通過調(diào)節(jié)ABCB1的表達促進骨肉瘤對多柔比星的耐藥性。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中FOXC2-AS1高表達與較低的疾病進展率和總生存期顯著相關(guān)。CCK-8及集落分析實驗表明FOXC2-AS1可以促進骨肉瘤對多柔比星的耐藥。此外，作者還發(fā)現(xiàn)FOXC2-AS1與其編碼有義配偶體FOXC2的外顯子有重疊區(qū)域，進一步的生物信息學(xué)分析和FISH檢測結(jié)果顯示，這兩種分子主要定位于細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)OXC2-AS1敲除顯著降低FOXC2的基因水平，Western blot法檢測結(jié)果亦顯示敲除FOXC2-AS1表達亦降低FOXC2蛋白水平。相比之下，敲除FOXC2后，F(xiàn)OXC2-AS1的表達水平未見明顯下降。此外，進一步的機制研究表明，F(xiàn)OXC2-AS1通過其重疊區(qū)域的保護作用，形成一個防止FOXC2 mRNA被RNase降解的RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，隨后在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平穩(wěn)定FOXC2表達，進而刺激ABCB1的表達，從而導(dǎo)致骨肉瘤對多柔比星的耐藥。因此，作者推測FOXC2-AS1可能是一個候選的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物和逆轉(zhuǎn)多柔比星耐藥性的目標(biāo)。Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn)FOXC2-AS1在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中上調(diào)，并可以誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9的表達進而促進骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)FOXC2-AS1表達水平可降低MMP的表達，體外和體內(nèi)實驗結(jié)果顯示其抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤生長。微陣列篩選結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫分析顯示，在表達sh-FOXC2-AS1的MG63細(xì)胞中，miR-3182上調(diào)、MMP-2下調(diào)，并且miR-3182具有FOXC2-AS1和MMP-2的mRNA 3’UTR潛在結(jié)合位點。此外，miR-3182的表達和功能與體外和體內(nèi)的FOXC2-AS1表達呈負(fù)相關(guān)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果進一步表明FOXC2-AS1直接與miR-3182競爭性結(jié)合，并上調(diào)MMP-2的表達。該研究首次闡明了FOXC2-AS1/miR-3182/MMP-2通路在骨肉瘤中的作用，并揭示FOXC2-AS1可能為骨肉瘤新的潛在治療靶點。

2.2 FOXC2-AS1與非小細(xì)胞肺癌非小細(xì)胞肺癌是一種常見的惡性腫瘤，多數(shù)患者確診時已為晚期，預(yù)后差。因此，探究非小細(xì)胞肺癌的分子機制及有價值的生物學(xué)標(biāo)志物和腫瘤治療靶點具有重要意義[10]。Sun等[11]的研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中FOXC2-AS1的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且FOXC2-AS1高表達與非小細(xì)胞肺癌患者的總生存期密切相關(guān)。CCK-8實驗及細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，敲除FOXC2-AS1可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549、H460)的增殖，加速細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。機制實驗進一步表明，F(xiàn)OXC2-AS1通過將PRC2募集到p15的啟動子上抑制p15的表達。PRC2是個多亞基復(fù)合物，包括EZH2、EED和SUZ12?；貜?fù)實驗驗證了FOXC2-AS1和p15之間的相互作用?？傊?，此研究結(jié)果證實FOXC2-AS1可通過相互作用EZH2抑制p15的表達而加重非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生，可為非小細(xì)胞肺癌的治療策略提供新思路。

2.3 FOXC2-AS1與前列腺癌Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)FOXC2-AS1在前列腺癌組織和細(xì)胞中表達上調(diào)。CCK-8實驗、集落形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)的周期分析及體內(nèi)異種移植試驗等結(jié)果表明，F(xiàn)OXC2-AS1在體外和體內(nèi)均有促進前列腺癌細(xì)胞增殖和生長的作用。為研究FOXC2-AS1在前列腺癌中的分子作用機制，作者首先使用生物信息學(xué)分析，預(yù)測miR-1253與FOXC2-AS1的3’UTR具有共同的結(jié)合位點，此外，兩者的相互作用通過熒光素酶報告分析得到證實。Pearson相關(guān)分析表明，F(xiàn)OXC2-AS1表達與miR-1253表達呈負(fù)相關(guān)，而miR-1253表達與EZH2表達呈正相關(guān)。隨后Western blot、CCK-8和集落形成實驗證實，F(xiàn)OXC2-AS1/miR-1253/EZH2軸對前列腺癌細(xì)胞增殖和進展的重要調(diào)節(jié)功能。因此，作者推斷FOXC2-AS1可通過作為miR-1253的競爭性內(nèi)源性RNA來調(diào)節(jié)增殖和腫瘤生長，與EZH2蛋白互補結(jié)合，從而加速前列腺癌細(xì)胞的致癌作用。

2.4 FOXC2-AS1與乳腺癌乳腺癌是女性常見的癌癥之一，屬于復(fù)雜的異質(zhì)性疾病。近年發(fā)現(xiàn)lncRNA在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其在腫瘤免疫逃逸的調(diào)控作用也備受關(guān)注[13-14]。Yang等[15]首先通過qPCR實驗對56例乳腺癌組織和相應(yīng)正常組織進行分析，發(fā)現(xiàn)FOXC2-AS1在乳腺癌組織中表達明顯增加，且乳腺癌細(xì)胞系中FOXC2-AS1的表達明顯高于正常人乳腺細(xì)胞系。研究發(fā)現(xiàn)FOXC2-AS1表達與乳腺癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2/neu狀態(tài)和TNM分期顯著相關(guān)，與患者年齡、腫瘤大小、ER以及PR表達無關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，F(xiàn)OXC2-AS1高表達與乳腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。采用特定的siRNA沉默內(nèi)源性水平的FOXC2-AS1后，MTT實驗結(jié)果顯示沉默F(xiàn)OXC2-AS1明顯降低相對細(xì)胞活力，細(xì)胞增殖被明顯抑制。集落形成實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染sh-FOXC2-AS1可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)OXC2-AS1引起細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)凋亡。此外，敲除FOXC2-AS1還導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞在G1期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為更深入地了解FOXC2-AS1對乳腺癌的影響，我們需要進一步分析其在乳腺癌中的具體分子作用機制。

2.5 FOXC2-AS1與結(jié)直腸癌Pan等[16]研究發(fā)現(xiàn)FOXC2-AS1在結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)。同時，轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中FOXC2-AS1表達高于非轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，且FOXC2-AS1高表達與TNM分期和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。qPCR檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116、HT-29、SW620和LoVo)和正常結(jié)腸細(xì)胞系NCM460中FOXC2-AS1的內(nèi)源性表達，F(xiàn)OXC2-AS1在腫瘤細(xì)胞系中表達明顯上調(diào)，其中SW620和LoVo細(xì)胞系的表達高于HCT116和HT-29細(xì)胞系。因此，選擇SW620和LoVo進行功能喪失試驗。實驗結(jié)果證實，通過轉(zhuǎn)染FOXC2-AS1 siRNA-1和siRNA-2，F(xiàn)OXC2-AS1表達被有效抑制。MTT和克隆形成實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2-AS1的減少顯著阻礙細(xì)胞的增殖和生長。值得注意的是，敲除FOXC2-AS1明顯抑制裸鼠皮下異種移植物的腫瘤體積、生長率和重量。劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果亦表明敲除FOXC2-AS1明顯損害結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。上述結(jié)果證實：FOXC2-AS1在體內(nèi)外均可促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，F(xiàn)OXC2-AS1可與相鄰基因FOXC2形成雙鏈體，正向調(diào)節(jié)并穩(wěn)定FOXC2基因。回復(fù)試驗及系列功能實驗結(jié)果表明，F(xiàn)OXC2-AS1可通過增強FOXC2基因的穩(wěn)定性，在體內(nèi)外促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。為進一步探討FOXC2-AS1/FOXC2介導(dǎo)的結(jié)直腸癌進展的分子機制，對TCGA數(shù)據(jù)集中的GSEA進行分析，發(fā)現(xiàn)FOXC2表達與鈣信號通路和局部粘連呈正相關(guān)。敲除FOXC2-AS1可降低細(xì)胞內(nèi)FOXC2的表達水平，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平也進一步降低，最后抑制黏著斑形成和FAK信號傳導(dǎo)。該結(jié)果進一步表明，F(xiàn)OXC2-AS1通過激活Ca2+-FAK信號增強FOXC2基因的穩(wěn)定性，以促進結(jié)直腸癌的增殖、遷移和侵襲，作者推測FOXC2-AS1可能是結(jié)直腸癌進展的潛在有效治療靶點。

2.6 FOXC2-AS1與其他腫癌Xu等[17]的研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移或II～IV期黑色素瘤組織中FOXC2-AS1表達異常升高，且FOXC2-AS1高表達的黑色素瘤患者比低表達患者生存率更低。敲除FOXC2-AS1可抑制A375和sk-mel-110細(xì)胞的活力，并刺激其凋亡。此外，轉(zhuǎn)染si-FOXC2-AS1的黑色素瘤細(xì)胞中p15水平上調(diào)，主要分布于細(xì)胞質(zhì)。RNA-RIP法分析驗證了FOXC2-AS1與EZH2和SUZ12的相互作用。ChIP法分析結(jié)果亦證實FOXC2-AS1通過募集EZH2調(diào)節(jié)p15轉(zhuǎn)錄的作用。實驗進一步發(fā)現(xiàn)FOXC2-AS1/p15軸對黑色素瘤細(xì)胞活力和凋亡具有調(diào)節(jié)作用。劉偉等[18]的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2-AS1在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中呈高表達，其可能與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤惡性增殖、侵襲、治療、預(yù)后有關(guān)。因此，作者猜測FOXC2-AS1可能作為腫瘤癌基因，參與腫瘤的發(fā)生，但仍需深入分析FOXC2-AS1在腫瘤中的分子機制。

3 結(jié)語

非編碼RNA在生命調(diào)控過程中扮演重要角色，其可與蛋白質(zhì)、DNA、RNA相互作用并調(diào)控相關(guān)基因的表達，參與原癌基因活化調(diào)節(jié)、免疫細(xì)胞分化和免疫系統(tǒng)調(diào)控等一系列重要過程。越來越多的證據(jù)表明lncRNA起著癌基因或抑癌基因的作用，它們在正常情況下保持平衡[19-20]。目前，F(xiàn)OXC2-AS1的重點腫瘤研究領(lǐng)域局限于骨肉瘤、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌及乳腺癌，在其他腫瘤中的研究仍在起步階段，隨著對FOXC2-AS1的不斷深入探究，其有望為腫瘤的診斷和靶點治療帶來新進展。