LKB1基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞類固醇激素生成相關(guān)基因的調(diào)控作用

張靜，張姬越，岳永起，趙丹，范依琳，馬妍，熊燕，熊顯榮，字向東，李鍵，楊麗雪

LKB1基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞類固醇激素生成相關(guān)基因的調(diào)控作用

1青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041；2青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041；3動物科學(xué)國家民委重點實驗室，西南民族大學(xué)，成都 610041

【背景】顆粒細(xì)胞類固醇激素的合成能力對卵泡發(fā)育及成熟具有重要作用，但其關(guān)鍵的調(diào)控因子尚不完全清楚。筆者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）基因參與細(xì)胞的脂類代謝，類固醇激素的合成與脂類代謝密切相關(guān)，并且有研究結(jié)果亦顯示敲除可引起小鼠卵巢早衰，表明對維持卵巢的功能很關(guān)鍵，其在顆粒細(xì)胞的確切功能需要進一步研究?！灸康摹刻骄吭谂Ｂ雅葜械谋磉_模式及其對顆粒細(xì)胞類固醇激素生成相關(guān)基因的調(diào)控作用, 為母牛繁殖生理調(diào)控研究提供理論依據(jù)。【方法】采用免疫組織化學(xué)染色對LKB1蛋白在卵泡中進行定位研究；同時分離培養(yǎng)牛原代顆粒細(xì)胞，并以促卵泡素受體（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作為標(biāo)記基因，細(xì)胞免疫熒光染色鑒定顆粒細(xì)胞及純度；然后以原代顆粒細(xì)胞為模型，采用siRNA沉默的技術(shù)，利用qRT-PCR方法檢測功能缺失對類固醇激素合成相關(guān)基因表達的影響，另一方面采用腺病毒過表達，qRT-PCR和Elisa技術(shù)驗證對類固醇激素合成相關(guān)基因表達的調(diào)控作用及雌二醇分泌?！窘Y(jié)果】1) LKB1蛋白在卵泡中的細(xì)胞均表達，但顆粒細(xì)胞的染色信號強于膜細(xì)胞，進一步的定量分析顯示顆粒細(xì)胞的表達量顯著高于卵泡膜細(xì)胞。2) 分離培養(yǎng)的牛原代卵泡顆粒細(xì)胞貼壁生長、細(xì)胞形態(tài)多呈圓形，能被顆粒細(xì)胞標(biāo)志基因FSHR抗體標(biāo)記。3) RNAi技術(shù)能顯著抑制的表達。與對照相比，siRNA1和siRNA2干擾的效率分別為48% (＜0.05)和52% (＜0.05)；沉默顯著降低顆粒細(xì)胞類固醇激素合成基因(＜0.01)、(＜0.01)和(＜0.05)的表達，分別下調(diào)了約為對照組的60%、80%和50%。4)過表達腺病毒及對照組對顆粒細(xì)胞均具有高的感染效率，過表達效率高達10倍（＜0.01）；過表達顯著上調(diào)(＜0.01)、(＜0.01)和(＜0.05)的表達，進一步研究顯示LKB1基因功能獲得促進顆粒細(xì)胞雌二醇的分泌（＜0.05）?！窘Y(jié)論】在卵泡顆粒細(xì)胞中高表達，促進類固醇激素生成基因、和的表達和雌二醇的分泌。本研究將為調(diào)控牛顆粒細(xì)胞類固醇激素合成的功能提供直接的理論依據(jù)。

；牛；顆粒細(xì)胞；類固醇激素；卵巢

0 引言

【研究意義】卵巢是雌性生殖系統(tǒng)中的重要器官，在下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamic-pituitary-ovarian axis，HPOA）的調(diào)節(jié)下，參與卵泡的生長和排卵等生物學(xué)過程。顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）作為卵巢中重要的功能細(xì)胞之一，在HPOA的調(diào)節(jié)下，發(fā)生增殖、分化和凋亡等一系列變化[1-2]。研究表明顆粒細(xì)胞通過旁分泌、自分泌和縫隙連接信號等與卵母細(xì)胞發(fā)生相互作用[3]。同時顆粒細(xì)胞主要負(fù)責(zé)合成類固醇激素，如雌二醇和孕酮[4-5]，調(diào)節(jié)卵泡的生長、發(fā)育和閉鎖。然而，目前關(guān)于牛顆粒細(xì)胞類固醇激素生成的關(guān)鍵調(diào)控因子尚不完全清楚[6]?！厩叭搜芯窟M展】肝激酶B1（Liver kinase B1，）又稱絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶11（Serine/threonine kinase 11，），作為腫瘤抑制因子被發(fā)現(xiàn)[7]。目前的研究已探索了在其他細(xì)胞類型上的功能。例如，調(diào)控人胚胎腎臟細(xì)胞的細(xì)胞周期[8]及間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[9]；在成年β細(xì)胞中缺失促進葡萄糖誘導(dǎo)β細(xì)胞分泌胰島素[10]；脂肪組織特異敲除增加機體能量代謝及脂代謝[11-13]。在人類生殖或動物繁殖領(lǐng)域的研究報道自然突變導(dǎo)致個體罹患黑斑息肉綜合征（peutz-Jeghers syndrome，PJS），該患者在輸卵管、卵巢和子宮頸等器官易發(fā)生腫瘤[14-15]。此外，中一個SNP（單核苷酸多態(tài)性）的C等位基因會阻止二甲雙胍治療的多囊卵巢綜合癥患者的排卵[16]。并且在雄激素誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合癥小鼠模型中，雌激素水平下降，伴隨著表達水平顯著降低[17]。綜上所述可知與激素分泌、能量代謝相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】最近研究表明卵母細(xì)胞特異敲除，導(dǎo)致原始卵泡過度激活，卵巢早衰[18]。卵泡的生長發(fā)育與顆粒細(xì)胞的類固醇激素合成分泌密切相關(guān)，是否參與牛卵巢顆粒細(xì)胞類固醇激素合成的功能尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】首先采用免疫組化檢測蛋白在牛卵泡中的表達模式，檢測其在卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的表達差異。然后以體外培養(yǎng)的牛原代卵泡顆粒細(xì)胞為模型，采用siRNA介導(dǎo)基因沉默和腺病毒過表達的方法，探索對牛卵泡顆粒細(xì)胞類固醇激素合成相關(guān)基因表達及雌二醇分泌的影響。為作為母牛繁殖生理調(diào)控的新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本采集 樣本采集時間為2019年9—12月，均采自成都青白江屠宰場，以健康的母黃牛（4—5歲）為試驗動物。屠宰后，使用滅菌的醫(yī)用剪刀快速采集卵巢組織，滅菌生理鹽水沖洗3次，將牛卵巢置于37℃滅菌的生理鹽水（含10 IU·mL-1雙抗）中，2 h內(nèi)帶至西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室細(xì)胞房，備用。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清FBS購自CLARK公司；RNAiso Plus、RT reagent Kit With gDNA Eraser均購自Takara公司；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（100×）均購自Biosharp公司；Lipofectamine?3 000轉(zhuǎn)染試劑盒、綠色免疫熒光二抗Goat anti-Rabbit IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody（A-11034）均購自Invitrogen公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigama公司；一抗Rabbit Anti-antibody（bs-3948R）、Rabbit Anti-FSH receptor antibody（bs-20658R）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAPI染料購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2×Plus SYBR real-time PCR premixture購自北京百泰克生物技術(shù)公司；MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測在卵巢表達與定位 采集5頭健康母牛的卵巢，使用眼科剪與手術(shù)刀剝?nèi)≈睆綖?—13 mm正常卵泡，4%多聚甲醛固定牛卵泡組織24 h，4℃保存，每隔6 h晃動組織固定液，使其各個部位充分接觸固定液，經(jīng)脫水、透明、浸蠟包埋制作成5 μm厚切片，根據(jù)MaxVisionTMHRP- Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit檢測試劑盒說明書進行免疫組化染色，試驗組滴加的一抗為Rabbit Anti-antibody（稀釋濃度為1﹕400），對照組則滴加相同體積的PBS緩存液。染色完成后并封片，在顯微鏡下觀察并拍照，用Image Pro軟件進行免疫組化的定量分析。

1.2.2 顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)：用預(yù)熱37℃的PBS沖洗卵巢3次，移入無菌操作臺中。用10 mL注射器吸取少量培養(yǎng)基，吸取直徑大小為2—13 mm卵泡的卵泡液，避免吸入血細(xì)胞。將吸出的卵泡液，使用400目細(xì)胞篩過濾，收集液體至1.5 mL離心管中，1 000 r/min 離心5 min。吸去上清液，加入含10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸牛卵巢顆粒細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)3次。最后將沉淀收集在10 mL離心管中，加入適量完全培養(yǎng)基混懸、細(xì)胞以30%匯合度接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，八字形移動細(xì)胞培養(yǎng)板，移至顯微鏡下觀察，細(xì)胞均勻分布，將培養(yǎng)板放入5% CO2恒溫（37℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待牛卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)12 h，觀察顆粒細(xì)胞貼壁良好，PBS沖洗2次，去除雜質(zhì)，添加完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

顆粒細(xì)胞的鑒定：FSHR在顆粒細(xì)胞中特異性表達，采用免疫熒光法鑒定分離培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞。將牛卵巢顆粒細(xì)胞以0.5×106個/孔接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在CO2培養(yǎng)箱中恒溫（37℃）培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌1—2次，用4%多聚甲醛液固定顆粒細(xì)胞20 min。然后用PBS洗滌3次，每次5 min；用0.2%的Triton X-100溶液孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加3% 山羊血清封閉1 h；再加入稀釋好的一抗FSHR，4℃孵育過夜，PBS洗3遍，每次5 min；在室溫下加入上述熒光標(biāo)記（Alexa Fluor 488）的二抗及DAPI孵育1 h（注意避光），PBS洗3次，每次5 min。加入Mounting Medium進行封片，并用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 siRNA的設(shè)計及siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)CDS區(qū)序列，Invitrogen公司設(shè)計并合成2對干擾siRNA序列；分別命名為-siRNA-1和-siRNA-2，各siRNA序列見表1。

1.2.4 腺病毒感染顆粒細(xì)胞 將分離出的第1代牛卵巢顆粒細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（分離方法見1.2.2），待細(xì)胞融合率達到50%，加入適量的腺病毒，同時在培養(yǎng)液中加入10 μg·mL-1的聚凝胺，提高病毒的吸附作用，從而提高感染效率。試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，靜置培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進行后續(xù)檢測。

表1 靶向LKB1的siRNA序列

1.2.5 總RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄 將細(xì)胞用細(xì)胞刮收集于1.5 mL的無RNAase的EP管中，加入1 000 μL RNAiso裂解細(xì)胞，按照Takara公司的RNAiso Plus說明書進行RNA抽提。操作步驟如下：加入氯仿200 μL，渦旋離心15 s，室溫靜止5 min，12 000 r/min、4℃離心15 min，吸取400 μL上清液于新的離心管中。加入500 μL的異丙醇，室溫放置10 min。然后12 000 r/min、4℃離心10 min，棄去上清液。再用 75%的乙醇（DEPC水配置）洗滌RNA沉淀，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，在室溫靜置約10 min。最后加入30 μL DEPC水溶解RNA，測定RNA的濃度。細(xì)胞的總RNA通過 RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得細(xì)胞的cDNA，-20℃冷凍保存。

1.2.6 熒光定量PCR 根據(jù) GenBank 利用 NCBI 中 BLAST 軟件設(shè)計、細(xì)胞色素P450家族11亞家族A成員1（）、細(xì)胞色素P450家族17亞家族A成員1（）、細(xì)胞色素P450家族19亞家族A成員1（）、類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（）等基因的熒光定量引物（表2），以為內(nèi)參基因。采用qRT-PCR技術(shù)檢測干擾或過表達基因后類固醇激素分泌相關(guān)基因在牛顆粒細(xì)胞中的表達差異。qRT-PCR反應(yīng)體系為15 μL：2×Plus SYBR real-time PCR premixture 7.5 μL，上游引物（10 μmol·L-1）1 μL，下游引物（10 μmol·L-1）1 μL，cDNA 2 μL，補充ddH2O至15 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s共40個循環(huán)。顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個樣本設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。

1.2.7 雌激素的測定 感染過對照腺病毒和過表達腺病毒的顆粒細(xì)胞，48 h后更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液上清。配置標(biāo)準(zhǔn)品，按照上海邦奕生物公司酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒操作說明檢測標(biāo)準(zhǔn)品及樣本反應(yīng)后的吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品中雌二醇的濃度。

表2 熒光定量PCR檢測基因的引物序列

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法進行處理，SPSS 23.0軟件分析免疫組化定量、熒光定量PCR結(jié)果及雌激素含量的顯著性水平，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（S.E.M）表示，采用雙尾t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LKB1在牛卵泡中的表達與定位

將有腔卵泡制備石蠟切片（圖1-E），并做LKB1蛋白的免疫組織化學(xué)染色（設(shè)置不加抗體孵育的陰性對照）。LKB1抗體孵育結(jié)果顯示牛卵泡中不同細(xì)胞類型均有棕色信號，說明在這些細(xì)胞中均有表達，藍色箭頭表示顆粒細(xì)胞，紅色箭頭表示膜細(xì)胞（圖1-A—D）。相反的，免疫組化的陰性對照組顯示細(xì)胞中無棕色信號，細(xì)胞核被蘇木精染為藍色（圖1-A—D），表明圖中的棕色染色為LKB1蛋白的特異性顯色。研究表明顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞是卵泡中主要的細(xì)胞類型，顆粒細(xì)胞特異分泌雌激素，而膜細(xì)胞特異分泌雄激素，因此比較LKB1蛋白在這兩種細(xì)胞中的表達差異。結(jié)果顯示顆粒細(xì)胞的染色信號強于膜細(xì)胞（圖1-A—D），進一步采用Image Pro軟件對LKB1蛋白的特異性染色進行半定量分析，顯示顆粒細(xì)胞的染色信號強度極顯著高于膜細(xì)胞（圖1-F），表明LKB1蛋白在卵泡中的顆粒細(xì)胞高表達，提示LKB1蛋白在維持牛卵巢顆粒細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要作用。

A-D：有腔卵泡的LKB1蛋白免疫組織化學(xué)染色，A：卵泡直徑為2 mm，B：卵泡直徑為3 mm, C：卵泡直徑為5 mm，D：卵泡直徑為7 mm。藍色箭頭：牛卵泡顆粒細(xì)胞，紅色箭頭：卵泡膜細(xì)胞。E：不同大小的卵泡形態(tài)。F：LKB1在顆粒細(xì)胞及膜細(xì)胞中信號強度的定量分析。誤差線：S.E.M。** P < 0.01，雙尾t檢驗法。切片比例尺：500 μm

2.2 原代顆粒細(xì)胞的分離與鑒定

收集卵泡液內(nèi)的顆粒細(xì)胞，均勻接種于35 mm培養(yǎng)皿中，牛卵巢顆粒細(xì)胞大部分貼壁生長，原代顆粒細(xì)胞多呈圓形，如圖2-A所示。此外，研究表明FSHR蛋白為卵巢顆粒細(xì)胞的特異分子標(biāo)記，因此采用免疫熒光的方法鑒定卵巢顆粒細(xì)胞，如圖2-B所示，綠色表示FSHR蛋白，被綠色標(biāo)記的細(xì)胞為顆粒細(xì)胞；藍色表示被DAPI染色的細(xì)胞核。通過統(tǒng)計可得顆粒細(xì)胞純度達到95%以上。表明細(xì)胞純度較高，可用于后續(xù)試驗。

2.3 干擾LKB1下調(diào)顆粒細(xì)胞類固醇激素合成相關(guān)基因的表達

將2對靶向的siRNAs轉(zhuǎn)染原代顆粒細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測的干擾效率。結(jié)果如圖3所示，-和均可有效干擾的表達，干擾效率分別為48%（＜0.05）和52%（＜0.05）。因此，選用干擾效率更高的--進行后續(xù)試驗。

顆粒細(xì)胞接種至12孔板，待細(xì)胞融合度至80%，將siRNAs轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測與類固醇激素分泌相關(guān)基因，包括。其中調(diào)控膽固醇從細(xì)胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)運，干擾極顯著下調(diào)的表達，與對照相比下調(diào)了56%（＜0.01，圖4-A）；為類固醇合成過程中將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，的表達量決定著類固醇激素的合成能力，與對照相比沉默下調(diào)了79%的mRNA表達量（＜0.01，圖4-B）；特異分布于卵泡膜細(xì)胞，可將孕酮催化形成雄烯二酮，干擾對的表達量無影響（>0.05, 圖4-C）；可將顆粒細(xì)胞中睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，與對照相比沉默下調(diào)了約50%的mRNA表達量（＜0.05，圖4-D）。以上研究結(jié)果表明干擾的功能下調(diào)顆粒細(xì)胞類固醇激素合成基因的表達。

A：原代顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)形態(tài)觀察；B：綠色熒光標(biāo)記FSHR蛋白，DAPI核染色

誤差線：S.E.M，* P < 0.05，雙尾t檢驗法

2.4 過表達LKB1促進類固醇激素合成基因的表達及雌二醇的分泌

將實驗室保存的過表達腺病毒和對照腺病毒分別感染顆粒細(xì)胞，48 h后觀察細(xì)胞均有綠色熒光蛋白表達（圖5-A）。同時收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測的過表達效率。如圖5-B所示，過表達處理組的表達量極顯著升高。與對照組相比，的mRNA水平均升高約10倍（<0.01），表明腺病毒成功介導(dǎo)的過表達。

* P < 0.05, ** P < 0.01, ns P > 0.05，雙尾t檢驗法。下同

A：Control和LKB1-OE處理組顆粒細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達；B：LKB1的過表達效率檢測

待細(xì)胞融合度至80%，腺病毒感染牛卵巢顆粒細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測與雌激素生產(chǎn)相關(guān)的基因。研究結(jié)果顯示過表達顯著上調(diào)的表達，與對照相比，分別上調(diào)了約2.5、1.5倍（＜0.01，圖6-A和B），然而，過表達對的表達量沒有影響（圖6-C），過表達對顯著上調(diào)了約3倍（圖6-D）同時收集顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，檢測顆粒細(xì)胞雌二醇的分泌，結(jié)果顯示過表達顯著提高培養(yǎng)基中雌二醇的濃度（＜0.05，圖6-E）。以上研究結(jié)果表明過表達提高了顆粒細(xì)胞類固醇合成基因的表達及雌二醇的分泌。

圖6 過表達LKB1對類固醇激素合成相關(guān)基因表達及E2分泌的影響

3 討論

3.1 LKB1蛋白在卵泡顆粒細(xì)胞中高表達

首先對牛的卵泡進行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在牛卵泡上均有表達，但在卵泡顆粒細(xì)胞的表達量顯著高于卵泡膜細(xì)胞。在卵泡中，顆粒細(xì)胞之間通過同源縫隙相連，使整個卵泡（包括卵母細(xì)胞）形成一個功能合胞。顆粒細(xì)胞一方面通過縫隙連接為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)、代謝前體和信號分子[19]；另一方面顆粒細(xì)胞將卵泡膜細(xì)胞分泌的雄激素，經(jīng)過芳香化酶的作用合成雌激素[20-22]，對卵泡的發(fā)育和成熟起關(guān)鍵作用。然而，顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌功能異常，將會導(dǎo)致多囊卵巢綜合癥[23]、卵巢早衰[24]和子宮內(nèi)膜異位[25]等癥狀。本試驗發(fā)現(xiàn)在整個卵泡中，LKB1蛋白在顆粒細(xì)胞的表達量較高，提示在顆粒細(xì)胞類固醇激素的合成功能中具有重要作用。

3.2 LKB1基因在動物卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用

近年來，功能的研究主要集中在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期與極性的調(diào)控[26-30]以及機體能量代謝[31-32]。在調(diào)控卵巢功能方面，目前已證明在人、果蠅和小鼠卵巢中均表達[33]，果蠅中調(diào)控卵巢上皮卵泡干細(xì)胞的極性[33]。在線蟲中的研究顯示，未成熟的卵母細(xì)胞具有較高的LKB1激酶活性，磷酸化AMPK的T172位點，激活A(yù)MPK的活性；相反的，成熟的卵母細(xì)胞中及AMPK的活性下降[34]。以基因敲除小鼠為模型，特異敲除原始卵泡卵母細(xì)胞中，導(dǎo)致原始卵泡被過度激活，提前激活的卵泡發(fā)育異常不能成熟，且大量死亡，導(dǎo)致原始卵泡庫過早耗竭從而引發(fā)卵巢早衰，表明LKB1基因是體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟的必需調(diào)控因子[18]。以上研究顯示LKB1基因可在卵巢中不同細(xì)胞類型發(fā)揮生物學(xué)功能，但其在卵泡顆粒細(xì)胞中的功能未知。

3.3 LKB1基因?qū)︻w粒細(xì)胞雌激素生成的作用

為了探究顆粒細(xì)胞類固醇激素生成的調(diào)控，本研究培養(yǎng)牛原代顆粒細(xì)胞。前人的研究表明促卵泡激素受體（FSHR）是顆粒細(xì)胞的標(biāo)志蛋白[35-36]。因此，采用FSHR抗體的細(xì)胞免疫熒光方法鑒定顆粒細(xì)胞，顆粒細(xì)胞的純度達95%。以該細(xì)胞為實驗材料，干擾LKB1基因，抑制類固醇激素合成相關(guān)基因的表達。相反的，過表達LKB1基因，促進這些基因的表達，并提高了雌二醇的分泌能力。2019年XU等的研究與本研究結(jié)果一致，顯示小鼠顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒，上調(diào)雌激素合成關(guān)鍵基因的表達，促進顆粒細(xì)胞雌激素的分泌；而沉默抑制雌激素的分泌[17]。此外，該研究也發(fā)現(xiàn)膜細(xì)胞過表達，下調(diào)雄激素合成關(guān)鍵基因的表達，抑制雄激素的合成[17]。本研究中也檢測了的表達量，雖然qPCR技術(shù)檢測CT值超過32，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞中的表達沒有變化，但也從側(cè)面印證筆者分離的細(xì)胞不是膜細(xì)胞。上述在顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞的功能研究與本研究LKB1基因在牛卵泡中兩種細(xì)胞類型的表達差異吻合。在卵泡成熟過程中，需要大量雌激素的合成，故本研究發(fā)現(xiàn)在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達量顯著高于膜細(xì)胞。

3.4 LKB1基因影響顆粒細(xì)胞雌激素合成潛在的信號通路

大量研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）是LKB1激酶的經(jīng)典靶標(biāo)，其可增強AMPK的磷酸化水平，提高AMPK激酶活性，參與多種生物學(xué)過程[7]。在牛和大鼠中，使用二甲雙胍處理卵巢顆粒細(xì)胞可增強AMPK的酶活，但降低類固醇激素合成相關(guān)基因的表達，減少雌二醇和孕酮的分泌[37-39]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)過表達提高了類固醇合成相關(guān)基因及雌二醇的分泌，研究結(jié)果提示調(diào)控牛卵巢顆粒細(xì)胞的功能可能不通過調(diào)控AMPK激酶的活性發(fā)揮作用。小鼠的顆粒細(xì)胞研究結(jié)果顯示，過表達提高胰島素信號通路關(guān)鍵分子胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）、胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor1，IGF1）的磷酸化水平，促進雌激素的合成與分泌，阻斷胰島素信號通路，促進雌激素合成的能力減弱[17]。在牛卵巢顆粒細(xì)胞中，是否通過IGF1信號通路影響類固醇激素合成及分泌，有待進一步的研究。

4 結(jié)論

LKB1蛋白在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達量顯著高于膜細(xì)胞；沉默LKB1基因，抑制顆粒細(xì)胞類固醇激素合成相關(guān)基因（STAR 和CYP11A1）的表達。相反的，過表達LKB1基因促進上述基因的表達水平，并提高了顆粒細(xì)胞雌二醇的分泌能力。本研究為LKB1基因作為母牛繁殖生理調(diào)控的新靶點提供理論依據(jù)。

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Regulates Steroids Synthesis Related Genes Expression in Bovine Granulosa Cells

1Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Ministry of Education，Chengdu 610041;2Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Chengdu 610041;3Key Laboratory of Animal Science of State Ethnic Affairs Commission, Southwest Minzu University, Chengdu 610041

【Background】The Steroids synthesis capacity of ovarian granulosa cells plays the important roles in the development and maturation of follicles, however, the key regulators were involved in this process remains largely unknown. Our previously research reported that Liver kinase B1 (LKB1) influenced the cellular lipid metabolism, which is close associated with steroids synthesis. Further, another study showed that knockout ofcaused premature ovarian failure in mice. 【Objective】The aim of this study was to study the expression pattern of，and provided a theoretical basis for the research of the reproductive physiological regulation in the cow.【Method】The expression pattern of LKB1 in follicle was detected by immunohistochemically assay. Then the primary follicular granulosa cells were isolated and identified by immunofluorescence staining incubated by follicle stimulating hormone receptor (FSHR) antibody. Next, these verified granulosa cells were used as the cell model. On one hand, LKB1 loss-of-function was mediated by siRNAs. qRT-PCR was performed to measureregulation of steroid hormone synthesis related genes expression. On the other hand, LKB1 gain-of-function was mediated by adenovirus. qRT-PCR and ELISA analysis were carried out to confirm the changes of above detected genes influenced by LKB1 and estradiol (E2) secretion, respectively. 【Result】The data showed that: 1) LKB1 protein expressed in all cell types of follicles and the positive signal in granulosa cells is significantly higher than that of theca cells, which is verified by quantitative analysis. 2) The morphology of isolated bovine follicular granulosa cells was shape of round, which were specifically labeled by follicle stimulating hormone receptor (FSHR) using immunofluorescence staining, with 95% of positive cells. 3) The interference efficiency of LKB1 treated by siRNA1 and siRNA2 was respectively 48% (＜0.05) and 52% (＜0.05) to that of control. Knockdown of LKB1 significantly down-regulated mRNA levels of(＜0.01),(＜0.01) and＜, with the 60%, 80% and 50% decrease to those of the control. 4) The highly infected efficiency was observed infected by LKB1-OE and control adenovirus. In contrast, overexpression ofdramatically increased mRNA levels of(＜0.01),(＜0.01) and＜, which was associated with elevation of E2 secretion. 【Conclusion】In summary,was highly expressed in follicular granulosa cells, which promoted the expression of steroids synthesis related genes and E2 secretion. This result provides directly theoretical evidence for theregulation of steroids hormone synthesis in bovine.

; bovine; granulosa cells; steroid hormone; ovary

2021-04-07；

2022-03-29

四川省科技計劃（2019YJ0258）、國家自然科學(xué)基金（31902154）、國家重點研發(fā)專項（2018YFD0502304）、西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（2021PTJS20&2021PTJS26）

張靜，Tel：17844618658；E-mail：zjing2513338252@163.com。通信作者熊燕，E-mail：xiongyan0910@126.com。通信作者楊麗雪，E-mail：yanglixue_79@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.10.015

（責(zé)任編輯 林鑒非）