miR-34a和miR-145在宮頸癌及癌前病變中的表達(dá)及與HPV16感染的相關(guān)性

喻金梅，李霞，鄒美燕，安云婷，喬志強(qiáng)

（江西省婦幼保健院腫瘤科，江西 南昌 330006）

宮頸癌嚴(yán)重影響女性患者的身體健康，研究[1-2]顯示，全世界約有30 萬名女性的死亡原因是宮頸癌，其中大部分發(fā)生在發(fā)展中國家。因此，采取準(zhǔn)確的方案預(yù)防和治療宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展具有重要的臨床意義。隨著臨床及科研技術(shù)的不斷發(fā)展，宮頸癌及癌前病變的檢測篩查技術(shù)逐漸成熟，其中人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的檢測是宮頸癌及癌前病變篩查的主要方式，不同分型的HPV致病能力也存在差異[3]。目前在不同高危HPV類型中，以HPV-16 最為常見[4]。研究[5]顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）在多種腫瘤發(fā)生進(jìn)展中起到重要的作用，主要以調(diào)控蛋白和相關(guān)基因的表達(dá)水平形式，同時miR-145 和miR-34a 在結(jié)腸癌和乳腺癌等惡性腫瘤中呈低表達(dá)。目前關(guān)于miR-145和miR-34a 在宮頸癌中與HPV16 感染間的關(guān)系等相關(guān)研究較少。基于此，本研究旨在探討miR-34a和miR-145在宮頸癌及癌前病中的表達(dá)水平及其與HPV16感染的相關(guān)性，以期為臨床靶向治療宮頸癌提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年6 月至2020 年6 月于本院經(jīng)宮頸活檢病理學(xué)確診的41例宮頸癌患者作為A組，42例癌前病變患者作為B組，40例慢性宮頸炎患者為C組。A組年齡45～72歲，平均（61.12±8.17）歲。B組年齡47～71歲，平均（60.39±7.99）歲。C組44～75歲，平均（63.15±8.45）歲。所有患者臨床診斷均由高年資病理醫(yī)師確診。3組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)宮頸組織檢測，明確為宮頸癌前病變?yōu)閷m頸低級別上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasmgrade1，CIN1）及宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變（CIN2-3）；患者及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書；組織標(biāo)本經(jīng)病理科醫(yī)生統(tǒng)一閱片，有病理依據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：宮頸原位腺癌；宮頸鱗癌；其他病理類型癌。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 miR-34a 和miR-145 表達(dá)水平檢測 采用實(shí)時免疫熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測miR-145 和miR-34a在宮頸組織中表達(dá)水平。cDNA 逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR根據(jù)相關(guān)說明書，使用全合一的TM-miRNA 和RTPCR檢測試劑盒。PCR反應(yīng)在95 ℃下預(yù)熱10 min，然后在95 ℃下變性40個循環(huán)，每次10 s，在60 ℃下退火20 s，在72 ℃下延伸10 s。miR-145 引物序列，正向：TGCGCGTCCAGTTTTCCCAGGAA，反向：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT；miR-34a引物序列，正向：TGCGCTGGCAGTGTCTTAGCT，反向：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。內(nèi)參U6 引物序列，正向：CGGGTTTGTTTTGCATTTGT，反向：AGTCCCAGCATGAACAGCTT。通過2-ΔΔCt方法計算miR-145和miR-34a的相對含量，每個標(biāo)本重復(fù)檢測3次，并取平均值。

1.3 HPV16 感染檢測 采用原位雜交法檢測患者HPV16的表達(dá)陽性率，使用10%的甲醛溶液固定所有患者的宮頸標(biāo)本，同時，使用石蠟包埋，將組織連續(xù)切片（4 μm厚），然后使用原位雜交染色法檢測所有患者的HPV16感染情況及感染陽性率，原位雜交染色使用的試劑盒購自北京奧科鼎盛生物科技有限公司，使用過程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，陽性指標(biāo)為陽性探針，同時，使用超純水作為陰性對照。

1.4 觀察指標(biāo) 比較3 組miR-34a 和miR-145 表達(dá)水平；比較3 組宮頸組織中HPV16 感染陽性率；分析3 組宮頸組織miR-34a 和miR-145 表達(dá)與HPV16感染的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以“±s”表示，3組比較采用單因素F分析（one-way ANOVA），計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組中miR-34a和miR-145表達(dá)水平比較 A組宮頸組織中miR-34a和miR-145表達(dá)水平顯著低于B組、C組，B組宮頸組織中miR-34a和miR-145表達(dá)水平顯著低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組宮頸組織miR-34a、miR-145水平比較（±s）Table 1 Comparison of miR-34a and miR-145 levels in cervical tissue among the three groups(±s)

表1 3組宮頸組織miR-34a、miR-145水平比較（±s）Table 1 Comparison of miR-34a and miR-145 levels in cervical tissue among the three groups(±s)

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05

組別A組B組C組F值P值例數(shù)414240 miR-34a水平0.21±0.090.46±0.22a 1.06±0.45ab 90.691＜0.001 miR-145水平0.24±0.130.64±0.25a 1.05±0.45ab 71.570＜0.001

2.2 3組宮頸組織中HPV16感染陽性率比較 3組宮頸組織中HPV16 感染陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A 組HPV16 感染陽性率顯著低于B 組、C 組，B 組HPV16 感染陽性率顯著低于C 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組宮頸組織中HPV16感染陽性率比較[n（%）]Table 2 Comparison of the positive rate of HPV16 infection in cervical tissue among the three groups[n(%)]

2.3 3組宮頸組織miR-34a和miR-145表達(dá)與HPV16感染的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，宮頸癌及癌前病變患者組織中miR-34a和miR-145的表達(dá)與HPV16感染呈高度負(fù)相關(guān)（P＜0.05），同時宮頸癌組織中相關(guān)性更高；慢性宮頸炎患者組織中上述表達(dá)與HPV16感染無關(guān)，見表3。

表3 3組宮頸組織miR-34a、miR-145表達(dá)與HPV16感染的相關(guān)性Table 3 Correlation between the expression of miR-34a and miR-145 in cervical tissue of three groups and HPV16 infection

3 討論

宮頸癌是威脅我國女性患者身體健康的重大疾病，早期篩查診斷宮頸癌及癌前病變具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會意義[6]。研究顯示，HPV的感染是導(dǎo)致女性患者發(fā)生宮頸癌及癌前病變的重要原因，是目前普遍認(rèn)可的主要因素，HPV感染的準(zhǔn)確檢測是目前早期篩查診斷宮頸癌與癌前病變的重要方法[7]，尤其對于高危型HPV病毒，其中HPV16最為常見[8-9]。目前對于宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡釋，多與微小RNA基因等異常表達(dá)有關(guān)。研究[10]顯示，miR-145和miR34a對于宮頸癌及癌前病變的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于宮頸癌及癌前病變組織miR-145 和miR34a 表達(dá)與患者HPV感染之間的關(guān)系報道較少。

本研究結(jié)果顯示，A組HPV16感染陽性率顯著高于B 組、C 組（P＜0.05），與靳榮等[11]研究結(jié)果一致，表明隨著患者宮頸病變嚴(yán)重程度的增加，HPV感染陽性率隨之增加，HPV16可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因。同時相關(guān)研究[12]顯示，開展接種9價HPV 疫苗可有效降低高危HPV 的感染率，可預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，A 組宮頸組織中miR-34a 和miR-145 表達(dá)水平顯著低于B 組、C組，B組宮頸組織中miR-34a和miR-145表達(dá)水平顯著低于C 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明在宮頸上皮組織不斷向?qū)m頸癌病變的進(jìn)展期間，miR-145 和miR34a 的低表達(dá)可能起關(guān)鍵作用。同時，宮頸癌及癌前病變患者中miR-145和miR34a的低表達(dá)與HPV16感染顯著相關(guān)，miR-145和miR34a的表達(dá)水平越低，患者感染HPV16 的風(fēng)險越高，因此，可將miR-145和miR34a動態(tài)監(jiān)測結(jié)果作為患者宮頸癌及癌前病變早期篩查與診斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，宮頸癌及癌前病變患者miR-145、miR-34a 呈低表達(dá)，與HPV16 感染高度相關(guān)，miR-145、miR-34a表達(dá)水平越低，患者HPV16感染風(fēng)險越高，未來可將miR-145和miR-34a動態(tài)監(jiān)測結(jié)果作為宮頸癌及癌前病變早期篩查與診斷的重要標(biāo)志物。