均相時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)降鈣素原的性能評(píng)價(jià)

江長(zhǎng)綠,劉結(jié)清,陳飛宇,江文力,黃昊川,杜利軍

廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東廣州 510800

降鈣素原(PCT)為無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，在內(nèi)毒素等細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，2～3 h開始增加[1-3]，6～8 h體內(nèi)水平快速升高，12～48 h到達(dá)峰值,2～3 d后恢復(fù)正常，為感染性疾病診斷及鑒別診斷的有效指標(biāo)[1-3]。當(dāng)嚴(yán)重細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時(shí)，其在血漿中的水平升高，自身免疫性疾病、過敏和病毒感染時(shí)PCT水平不會(huì)升高。PCT水平升高的幅度與細(xì)菌感染的嚴(yán)重性有關(guān)[4]。PCT>0.5 μg/L時(shí)，應(yīng)考慮患者是否具有發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥或敗血癥休克的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。潛在細(xì)菌感染的成功治療往往伴隨著PCT水平的降低，恢復(fù)正常的半衰期為24 h[7]。常見的檢測(cè)方法有時(shí)間分辨熒光免疫法[5](TRFIA)、化學(xué)發(fā)光法(CIIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫層析法(ICT)，而TRFIA又有均相TRFIA與非均相TRFIA之分，均相TRFIA簡(jiǎn)化了常規(guī)TRFIA檢測(cè)中“沖洗”的步驟，既減少了反應(yīng)體系誤差，又使得整個(gè)反應(yīng)過程更為快捷。本研究依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP系列文件及原中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部相關(guān)文件要求，全面評(píng)價(jià)賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀的檢測(cè)性能，從而為臨床感染性病例的診治提供更為有效的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1材料來源 參考區(qū)間驗(yàn)證標(biāo)本:選取2021年3-10月本院體檢中心體檢血常規(guī)標(biāo)本80份(其中男性40份、女性40份，年齡1～69歲，白細(xì)胞與C反應(yīng)蛋白均正常，排除感染性疾病和其他急慢性疾病)，經(jīng)2 500×g離心力離心10 min后用于參考區(qū)間的驗(yàn)證。其余實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均為本實(shí)驗(yàn)室完成常規(guī)檢測(cè)后的剩余標(biāo)本，對(duì)患者無任何損害，且試驗(yàn)結(jié)果只用于比對(duì)研究，不作為輔助診斷依據(jù)，不會(huì)給受試者帶來任何風(fēng)險(xiǎn)[5]。

1.2儀器與試劑 評(píng)價(jià)儀器為賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀,檢測(cè)系統(tǒng)已獲得國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局認(rèn)可，校準(zhǔn)品批號(hào)LOT:25044/6A，質(zhì)控品批號(hào)LOT:25038B,試劑批號(hào)LOT：25204C；比對(duì)儀器為雷度AQT90FLEX 免疫分析儀，校準(zhǔn)品批號(hào)LOT:19605，質(zhì)控品批號(hào)LOT:18426/17816,試劑批號(hào)LOT：19605。用于正確度驗(yàn)證的參考物質(zhì)水平為28.7 μg/L。本評(píng)價(jià)所有試驗(yàn)均嚴(yán)格按照儀器標(biāo)準(zhǔn)化操作程序文件操作，試驗(yàn)前所有質(zhì)控均參照《臨床實(shí)驗(yàn)室定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)量控制指南：GB/T20468-2006》文件執(zhí)行[8],且均在控。

1.3方法

1.3.1精密度驗(yàn)證 按照CLSI EP15-A2文件[9]要求，使用2個(gè)水平(低水平1和高水平2均接近醫(yī)學(xué)決定水平)的患者血漿標(biāo)本制備的質(zhì)控血漿，每個(gè)水平各分裝5管，凍存于-20 ℃以下，每天各解凍1管，上機(jī)重復(fù)測(cè)定3次，每次間隔2 h，共測(cè)5 d。分別計(jì)算批內(nèi)和批間精密度的變異系數(shù)(CV)，根據(jù)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)系統(tǒng)不精密度CV<1/4系統(tǒng)總誤差(TEa)(±7.5%)。

1.3.2準(zhǔn)確度驗(yàn)證 按照《能力驗(yàn)證規(guī)則：CNAS-RL02:2018》[10]要求,本實(shí)驗(yàn)室參加國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心2021年4月組織的第一次PCT室間質(zhì)評(píng)，將其發(fā)放的5份室間質(zhì)評(píng)物質(zhì)在評(píng)價(jià)儀器上進(jìn)行檢測(cè)，以室間質(zhì)評(píng)回報(bào)結(jié)果的靶值作為標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果是否在允許范圍內(nèi)。

1.3.3正確度驗(yàn)證 根據(jù)《臨床檢驗(yàn)定量測(cè)定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證：WS/T492-2016》[11]使用廠家提供的具有溯源性及互換性的正確度驗(yàn)證物質(zhì)(參考物質(zhì)水平為28.7 μg/L，不確定度為1.6)，在3～5 d內(nèi)每批進(jìn)行2次重復(fù)測(cè)定，然后計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差、合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度,以及95%CI等驗(yàn)證指定值。

1.3.4稀釋度驗(yàn)證 選取40份接近檢測(cè)線性上限的患者標(biāo)本，水平介于40.83～48.15 μg/L，在評(píng)價(jià)儀器上分別進(jìn)行50倍和100倍稀釋檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果與原始結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算相應(yīng)偏倚，要求小于1/3TEa(10%)。

1.3.5線性范圍驗(yàn)證 依據(jù)CLSI EP6-A文件[12]，準(zhǔn)備水平為0.02～50.00 μg/L的兩個(gè)低水平標(biāo)本(L)和高水平標(biāo)本(H)為母液(5 mL)，按(1∶L,2∶0.80 L+0.20 H,3∶0.60 L+0.40 H,4∶0.40 L+0.40 H,5∶0.20 L+0.80 H,6∶H)配成6個(gè)梯度的線性測(cè)量標(biāo)本，每份為500 mL,每個(gè)水平標(biāo)本分別上機(jī)檢測(cè)2次，計(jì)算均值，繪制線性擬合曲線，要求R2≥0.95。

1.3.6干擾物驗(yàn)證 依據(jù)CLSI EP7-A2文件[13]，在血漿PCT低水平(接近臨界值下限0.5 μg/L)和高水平(接近醫(yī)學(xué)決定點(diǎn)2.0 μg/L)標(biāo)本中加入臨床常見干擾物質(zhì)(清蛋白1 g/dL、未結(jié)合膽紅素 20 mg/dL、三酰甘油22 mg/mL、洗滌紅細(xì)胞配制血紅蛋白500 mg/dL)，并檢測(cè)干擾(為不影響臨床誤診誤治，以干擾<±10%為驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn))。

1.3.7攜帶污染率驗(yàn)證 依據(jù)《臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求：WS/T406-2012》[14]要求,取高水平血漿標(biāo)本,重復(fù)測(cè)定3次,分別獲得結(jié)果H1、H2、H3，再取低水平血漿標(biāo)本，重復(fù)測(cè)定3次，分別獲得結(jié)果L1、L2、L3，代入公式(L1-L3)/(H3-L3)×100%,計(jì)算其攜帶污染率。

1.3.8參考區(qū)間驗(yàn)證 參照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床化學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明：CNAS-CL02-A003:2018》[15]要求,因PCT水平在人群中呈偏態(tài)分布，故參考區(qū)間采用P95表示更符合臨床，檢測(cè)健康人群血漿PCT水平，計(jì)算其P95。

1.3.9不同儀器間比較 依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)定量檢驗(yàn)結(jié)果的可比性驗(yàn)證指南：WS/T 407-2012》[16]要求，采用本實(shí)驗(yàn)室在用的雷度AQT90FLEX 免疫分析儀作為對(duì)照機(jī)型，將其與賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀同時(shí)檢測(cè)80例血漿標(biāo)本，按試劑說明書對(duì)PCT不同水平(<0.5、0.5～<2、2～10 μg/L和>10 μg/L)進(jìn)行臨床意義的劃分，4個(gè)水平的血漿標(biāo)本數(shù)均為20例，對(duì)賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT試劑盒和對(duì)照試劑檢測(cè)的2組數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；線性及比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1精密度驗(yàn)證結(jié)果 按照CLSI EP15-A2文件要求，2個(gè)接近醫(yī)學(xué)決定水平的自制質(zhì)控血漿的批內(nèi)精密度的CV分別為0.51%、3.47%，批間精密度的CV分別為1.66%、5.14%，均小于國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)±7.5%(1/4TEa)，見表1。

表1 PCT精密度驗(yàn)證結(jié)果(血漿)

2.2準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果 2021年4月上報(bào)的5份標(biāo)本室間質(zhì)評(píng)結(jié)果均通過國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果均在允許范圍內(nèi),成績(jī)?yōu)?00%，見表2。

表2 PCT準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果(血漿)

2.3正確度驗(yàn)證結(jié)果 均值為28.11 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為0.61 μg/L，臨界值為3.25 μg/L，95%CI為27.48～28.74 μg/L，指定標(biāo)準(zhǔn)差為1.6 μg/L，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.612，測(cè)量不確定度驗(yàn)證限為22.87～33.35 μg/L，驗(yàn)證物質(zhì)的水平均落在以上驗(yàn)證區(qū)間內(nèi)，儀器正確度通過驗(yàn)證。

2.4稀釋度驗(yàn)證結(jié)果 40份接近檢測(cè)線性上限的患者標(biāo)本，稀釋50倍偏倚為±7.2%,稀釋100倍偏倚為±7.4%，結(jié)果偏倚均<±10%(1/3TEa)。

2.5線性范圍 通過具有梯度水平的血漿標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，得出回歸方程Y=1.000X-0.708，R2=0.998，表明檢測(cè)范圍在0.02～50 μg/L 內(nèi)呈線性。

2.6干擾物驗(yàn)證結(jié)果 常見潛在的內(nèi)源性干擾物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響均<±10%，見表3。

表3 常見潛在的內(nèi)源性干擾

2.7攜帶污染率 賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀的攜帶污染率為0.03%，見表4。

表4 賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀攜帶污染率測(cè)定結(jié)果

2.8參考區(qū)間驗(yàn)證 檢測(cè)80份健康人群的PCTP95為0.064 μg/L，且與性別無關(guān)，男性與女性的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，95%CI相近重疊，見表5。

表5 健康人群的PCT P95與95%CI

2.9實(shí)驗(yàn)室不同儀器結(jié)果比較 賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀與雷度AQT90FLEX免疫分析儀檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性(R2=0.995)，線性回歸方程Y=0.896X+0.055，在醫(yī)學(xué)決定水平0.5 μg/L和2.0 μg/L時(shí)相對(duì)偏差分別為8.83%和7.95%,均<±10%(CLIA88/2)。

3 討 論

PCT自上世紀(jì)90年代問世以來一直備受臨床關(guān)注，不僅在細(xì)菌(特別是革蘭陰性菌)感染、膿毒血癥等方面為臨床提供有效、高特異度的參考依據(jù)，同時(shí)，在上、下呼吸道感染，主要在社區(qū)獲得性肺炎(CAP)、急性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)等疾病中，為鑒別是否存在細(xì)菌感染和可疑感染提供有力參考，有效防止抗菌藥物濫用。PCT水平下降也是臨床治療有效的可靠反饋。正因?yàn)镻CT在臨床上具有如此舉足輕重的地位，更加要求實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方便快速，而對(duì)檢測(cè)儀器進(jìn)行全面系統(tǒng)的性能驗(yàn)證，才能為臨床提供準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果[17-19]。

為充分了解賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀的性能，本實(shí)驗(yàn)室參照一系列文件要求，對(duì)其進(jìn)行全面系統(tǒng)的性能評(píng)估。本研究表明，其批內(nèi)精密度CV分別為0.51%、3.47%，批間精密度CV分別為1.66%、5.14%，均小于國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)±7.5%(1/4TEa)，優(yōu)于ELISA(CV為7%～10%)，這與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的結(jié)果一致。準(zhǔn)確度與正確度均通過驗(yàn)證，表明其能為臨床提供更加安全、準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。稀釋度在1∶50倍時(shí)偏倚<7.2%,1∶100倍偏倚<7.4%，可為臨床重度感染患者提供更寬的檢測(cè)范圍，充分滿足臨床需求，優(yōu)于同類型儀器(100 μg/L)。臨床常見干擾物質(zhì)(清蛋白1 g/dL、血紅蛋白500 mg/dL、未結(jié)合膽紅素20 mg/dL、三酰甘油22 mg/mL)的干擾度均<±10%，表明檢測(cè)不受明顯干擾，與廠家的宣傳相符，已達(dá)到常規(guī)方法的抗干擾能力。攜帶污染率僅為0.03%，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)[6]報(bào)道的同類型檢測(cè)儀器的0.11%，表明其特異度良好，不會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果而誤導(dǎo)臨床診療。參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果顯示，PCTP95水平為0.064 μg/L，因PCT水平在人群中呈偏態(tài)分布，故參考區(qū)間采用P95表示更符合臨床需求，且研究表明其無性別差異。本研究結(jié)果還表明，賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀檢測(cè)結(jié)果與本科室在用的雷度AQT90FLEX 免疫分析儀具有良好的相關(guān)性(R2=0.995)，且在醫(yī)學(xué)決定水平0.5 μg/L和2.0 μg/L時(shí)相對(duì)偏差分別為8.83%和7.95%,均<±10%(CLIA88/2)。

綜上所述，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)賽默飛KRYPTOR COMPACT PLUS-PCT分析儀3個(gè)月以來的使用經(jīng)驗(yàn)，其特別適用于大量標(biāo)本的檢測(cè)，為一款自動(dòng)化程度高、使用便捷、檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠且故障率低的PCT檢測(cè)分析儀。