生防細(xì)菌TB17的篩選、鑒定及其對苦瓜枯萎病的生防作用

張涵，趙瑩，仲榮榮，文才藝，孟顥光

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 ，河南 鄭州 450002)

苦瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌苦瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.momordicae)侵染引起的一種土傳病害，具有發(fā)病快、危害嚴(yán)重以及防治困難等特點[1]。隨著近年來苦瓜種植面積不斷擴大，連作現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致病害的發(fā)生日趨頻繁，嚴(yán)重影響苦瓜的產(chǎn)量和質(zhì)量，成為苦瓜種植業(yè)的重要限制因素[2-3]。目前，生產(chǎn)上對苦瓜枯萎病的防治主要是以化學(xué)防治為主[4]。但是，由于苦瓜枯萎病是典型的土傳維管束病害，常用的化學(xué)農(nóng)藥和防治方法難以達(dá)到理想的效果，生產(chǎn)上一般利用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行灌根或者土壤處理，長期使用容易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全等問題[5-6]。生物防治是植物病害綜合防治的重要措施之一，可通過有益微生物及其代謝產(chǎn)物調(diào)控植物微生態(tài)環(huán)境，直接或間接抑制植物病原菌生長繁殖等途徑以達(dá)到控制植物病害的目的，具有自然資源豐富、環(huán)境兼容性良好和改善土壤微生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點[7-8]。近年來，利用拮抗細(xì)菌來防治植物枯萎病的研究越來越多。孫正祥等[9]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)YZU-S149處理后，可顯著降低西瓜枯萎病的病情指數(shù)，防治效果為75.87%。許帥等[10]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)ZF128可以顯著促進(jìn)馬鈴薯植株生長，控制馬鈴薯枯萎病的流行，防治效果為82.46%。郭康迪[11]從河南省土壤樣品中分離獲得一株綠針假單孢菌(Pseudomonascholoeaphtis)，對苦瓜枯萎病具有良好的防治效果。本研究從河南省南陽桐柏山景區(qū)土壤樣品中分離獲得一株可用于苦瓜枯萎病菌生物防治的生防細(xì)菌，并對其分類鑒定、抑菌活性、促生和生防效果進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以期為苦瓜枯萎病的生物防治提供更多優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 2019年9月，從河南省南陽桐柏山景區(qū)采集土壤樣品，并將所得樣品用自封袋封存于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試病原菌 試驗所需的植物病原真菌包括苦瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.momordicae)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)、小麥全蝕病菌(Gaeumannnomycesgraminisvar.tritici)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)和小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治實驗室分離保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 試驗所需培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.1.4 供試苦瓜 試驗所需苦瓜品種為“如玉33號”，購置于福建農(nóng)科農(nóng)業(yè)良種開發(fā)有限公司。

1.2 土壤細(xì)菌的分離、純化

試驗參考郭康迪[11]所述的方法對采集的土壤樣品進(jìn)行處理，利用無菌水對土壤樣品進(jìn)行梯度稀釋后，分別吸取100 μL稀釋度為10-4和10-5的土壤懸浮液涂布平板，各處理重復(fù)3次，將涂布后的平板置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2 d后，觀察菌落生長情況，用接種環(huán)挑取形狀、大小、顏色相異的單菌落在LB平板上劃線分離、純化，將純化后的細(xì)菌分離物用25%甘油在-20 ℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.3 拮抗菌株的篩選

1.3.1 拮抗菌株的初篩 試驗選擇苦瓜枯萎病菌為靶標(biāo)菌進(jìn)行拮抗菌篩選，將靶標(biāo)菌菌餅(d=5 mm)置于PDA平板中央，在距離菌餅約3 cm處劃線接種不同的土壤細(xì)菌分離物，將接種后的培養(yǎng)皿在28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，以僅接種靶標(biāo)菌為空白對照。培養(yǎng)5～7 d后，觀察并記錄不同細(xì)菌分離物的抑菌效果。

1.3.2 拮抗菌株的復(fù)篩 將靶標(biāo)菌菌餅(d=5 mm)接種于平板中央，在距離菌餅兩邊約3 cm處劃線接種相同菌株，以僅接種靶標(biāo)菌為空白對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。7 d后，觀察并記錄不同細(xì)菌分離物的抑菌效果，從中挑出拮抗效果最佳的菌株進(jìn)行下一步研究。

菌絲生長抑制率=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100%

1.3.3 菌株TB17發(fā)酵濾液活性測定 菌株TB17的無菌發(fā)酵液制備參考習(xí)慧君等[12]的方法，振蕩培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵液在12 000 r·min-1條件下離心，上清液過濾后即為無菌發(fā)酵液。將無菌發(fā)酵液分別按1∶4和1∶9的體積比與PDA混合制作平板培養(yǎng)基，在平板培養(yǎng)基的中央接種苦瓜枯萎病菌菌餅(d=5 mm)，以未添加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)5～7 d后，觀察并記錄不同處理的苦瓜枯萎病菌菌落生長情況，菌絲生長抑制率計算公式同1.3.2所述。

1.3.4 菌株TB17拮抗譜測定 試驗方法同1.3.2，分別以玉米大斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌和小麥根腐病菌為靶標(biāo)菌進(jìn)行菌株TB17拮抗譜的測定。

1.4 拮抗菌株TB17對苦瓜促生效果測定

將菌株TB17接種于LB培養(yǎng)液中，在28 ℃、180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)24 h后得到TB17發(fā)酵液(107cfu·mL-1)。待苦瓜幼苗長出2片真葉時，將制備好的TB17發(fā)酵液按每株10 mL進(jìn)行灌根接種，以接種LB液體培養(yǎng)基為對照，處理后的苦瓜苗在28～30 ℃溫室中培養(yǎng)，25 d后調(diào)查統(tǒng)計苦瓜株高、地上部分鮮質(zhì)量、根長和根鮮質(zhì)量等生理指標(biāo)。

1.5 拮抗菌株TB17室內(nèi)盆栽防效測定

將苦瓜種子催芽后在室溫內(nèi)播種，待苦瓜幼苗長出兩片真葉時進(jìn)行生防效果測定。菌株TB17發(fā)酵液的制備按1.4所述。試驗設(shè)置處理組和對照組。處理組：將苦瓜幼苗置于濃度為107cfu·mL-1的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液中浸根處理30 min，定植后在苦瓜根部灌根接種60 mL的TB17發(fā)酵液；對照組：用相同濃度的苦瓜枯萎病菌孢子懸浮液浸根處理30 min，定植后以未接菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行灌根。所有處理后的苦瓜幼苗在28～30 ℃的溫室中培養(yǎng)，試驗重復(fù)3次，每次各處理5株。根據(jù)苦瓜枯萎病發(fā)病等級分級標(biāo)準(zhǔn)，計算并統(tǒng)計病情指數(shù)和防治效果[13]。

病情指數(shù)=Σ(病株數(shù)×相應(yīng)級數(shù))/總株數(shù)×最高級數(shù)×100%。

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

1.6 菌株TB17的分類鑒定

1.6.1 形態(tài)特征觀察 將菌株TB17在LB平板上劃線培養(yǎng)，待培養(yǎng)1～2 d后，觀察記錄菌落形態(tài)特征，然后挑取少許菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.6.2 生理生化特征測定 試驗參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中描述的方法[14]，測定菌株TB17的碳源、氮源利用情況、硝酸鹽還原能力、分解淀粉、纖維素、有機磷和無機磷的能力、明膠液化和產(chǎn)嗜鐵素的情況等。

1.6.3 16S rRNA基因序列分析 菌株TB17發(fā)酵液制備同1.4所述，試驗利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行菌株TB17 DNA提取，該試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR擴增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)；反應(yīng)體系(25 μL)：2×Easy Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，27F和1492R各1 μL，ddH2O補足25 μL；擴增程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。PCR擴增結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行特異性檢測，切膠回收后送往北京擎科生物科技有限公司測序。將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，挑選與其親緣關(guān)系較近的序列構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

結(jié)果表明，試驗從南陽桐柏山景區(qū)采集的樣品中共分離獲得34株細(xì)菌分離物，經(jīng)初篩和復(fù)篩后獲得一株對苦瓜枯萎病菌具有較強抑菌活性的拮抗菌株，編號為TB17，其對苦瓜枯萎病菌的菌絲生長抑制率為59.03%(圖1)。

A：對照；B：菌株TB17和病原菌對峙培養(yǎng)。A:CK;B:Dual culture of strain TB17 and F.oxysporum f.sp.momordicae on PDA plate.圖1 菌株TB17對苦瓜枯萎病菌的抑菌作用Fig.1 Inhibition effect of strain TB17 to F.oxysporum f.sp.momordicae

2.2 菌株TB17發(fā)酵液的抑菌活性

試驗結(jié)果如圖2所示，菌株TB17發(fā)酵濾液對苦瓜枯萎病菌的生長具有明顯的抑制作用，其稀釋5倍和10倍的發(fā)酵濾液對苦瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制率分別為63.96%和54.95%。

A：對照；B：稀釋5倍的發(fā)酵濾液；C：稀釋10倍的發(fā)酵濾液。A:CK;B:Diluted fermentation filtrate by five-fold;C:Diluted fermentation filtrate by ten-fold.圖2 菌株TB17發(fā)酵濾液對尖孢鐮孢菌生長的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of fermentation filtrate of strain TB17 on the growth of F.oxysporum f.sp.momordicae

2.3 菌株TB17的抑菌譜

試驗結(jié)果如圖3所示，菌株TB17不僅對苦瓜枯萎病菌具有較強的拮抗效果，對供試的玉米大斑病菌、蘋果輪紋病菌、小麥全蝕病菌等6株靶標(biāo)病原真菌也具有一定的拮抗效果，表明該菌株具有廣譜的抗植物病原真菌活性。

1：玉米大斑病菌；2：蘋果輪紋病菌；3：小麥全蝕病菌；4：小麥紋枯病菌；5：小麥赤霉病菌；6：小麥根腐病菌。1:S.turcica;2:B.dothidea;3:G.graminis var.tritici;4:R.cerealis;5:F.graminearum;6:B.sorokiniana.圖3 菌株TB17的拮抗譜Fig.3 Antagonistic spectrum of strain TB17

2.4 菌株TB17對苦瓜的促生作用

試驗結(jié)果如表1所示，菌株TB17對苦瓜具有顯著的促生作用。菌株TB17處理后，其株高和根長與對照組相比分別增加了32.33%和24.39%，地上部分鮮質(zhì)量和根鮮質(zhì)量分別增加了61.54%和122.76%。

表1 菌株TB17對苦瓜的促生作用Table 1 Plant growth promoting effect of strain TB17 on bitter gourd

2.5 菌株TB17對苦瓜枯萎病的盆栽生防效果

試驗結(jié)果如圖4所示，在苦瓜接種處理第14 d時，僅接種苦瓜枯萎病菌的對照組苦瓜出現(xiàn)葉脈發(fā)黃、整株萎蔫莖基部縊縮變褐、整株萎蔫甚至枯死等癥狀，平均病情指數(shù)高達(dá)86.67；經(jīng)菌株TB17處理后，苦瓜的平均病情指數(shù)為20，顯著降于對照組，防治效果為76.92%。

圖4 菌株TB17的盆栽生防效果Fig.4 Biocontrol effect of strainTB17 in pot experiments

2.6 菌株TB17的分類鑒定結(jié)果

2.6.1 菌株TB17形態(tài)學(xué)特征 在LB培養(yǎng)基上觀察到的菌株TB17形態(tài)特征如圖5-a所示，菌落形態(tài)呈不規(guī)則狀，淡黃色，不透明，有光澤；試驗對菌株TB17進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如圖5-b(放大400倍)，菌株TB17革蘭氏染色后呈陽性，在顯微鏡下呈桿狀。

a：菌株TB17的菌落形態(tài)；b：菌株TB17的革蘭氏染色。a:Colony morphology of strain TB17;b:Gram staining of strain TB17.圖5 菌株TB17的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of strain TB17

2.6.2 菌株TB17的生理生化特征 生防菌株TB17的生理生化測定結(jié)果如表2所示，菌株TB17可以利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和甘露醇為碳源，可利用精氨酸為氮源，分解有機磷、無機磷，還原硝酸鹽以及產(chǎn)H2S等。

表2 菌株TB17的生理特征測定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain TB17

2.6.3 菌株TB17的分子生物學(xué)鑒定 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖6所示，菌株TB17的16S rRNA基因序列長度為1 430 bp(GenBank登錄號：MZ950653)，NCBI比對分析結(jié)果表明，菌株TB17與短短芽孢桿菌B.brevis(HQ317191)的親緣關(guān)系最近，其同源性達(dá)到99.79%。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征，將菌株TB17鑒定為短短芽孢桿菌(如圖7)。

泳道1：16S rRNA基因片段；泳道2：陰性對照；泳道M：DL2000 Marker。 Lane 1:16S rRNA gene fragment;Lane 2:Negative control;Lane M:DNA marker DL2000.圖6 菌株TB17的16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果 Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene from strain TB17

圖7 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Neighbor-joining phylogenetic tree of strain TB17 based on 16S rRNA gene sequences

3 討論

近年來，生防微生物及其制劑因具有安全、無污染和環(huán)境兼容性良好等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于植物病害生物防治[15-16]。目前研究并應(yīng)用較多的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)[17]，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[18]、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)[19]和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)[20]等。雖然土壤是生防細(xì)菌分離的主要來源，但隨著大量生防菌資源的不斷挖掘，從一般的土壤生境中篩選獲得微生物新物種越來越困難。因此，越來越多的學(xué)者開始從濕地[21]、赤泥地[22]和高寒草地[23]

等特殊土壤生境進(jìn)行微生物資源挖掘。河南省南陽桐柏山地處暖溫帶向亞熱帶過渡的地區(qū)，擁有完整的過渡帶森林生態(tài)系統(tǒng)和良好的自然生態(tài)[24]，是發(fā)掘新型微生物資源的適宜生境。我們從河南省南陽桐柏山景區(qū)的山地土壤樣品分離出34株具有拮抗活性的細(xì)菌純培養(yǎng)，經(jīng)初篩和復(fù)篩后，獲得1株對苦瓜枯萎病菌具有穩(wěn)定拮抗活性的生防菌株TB17，并將其鑒定為短短芽孢桿菌。該菌株對苦瓜枯萎病的盆栽防治效果達(dá)76.92%，同時可以有效促進(jìn)苦瓜的生長，具有研發(fā)防治苦瓜枯萎病微生物菌劑的潛力。

研究表明，短短芽孢桿菌作為一種具有廣譜抗真菌活性的生防微生物，在其生長代謝過程中能夠產(chǎn)生不同的抗菌活性物質(zhì)來抑制病原菌的正常生長，進(jìn)而達(dá)到控制病害的目的[25-28]。王潔等[29]從短短芽孢桿菌發(fā)酵液中分離純化獲得一種相對分子量為32 kD的鞭毛蛋白，對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌等具有顯著抑菌效果；WAFAAG[30]從草莓植株葉際分離得到一株抗草莓灰霉病的短短芽孢桿菌，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)短桿菌肽S(gramicidin S)可顯著降低草莓灰霉病的發(fā)生。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)菌株TB17的發(fā)酵液對苦瓜枯萎病菌的菌絲生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，表明菌株TB17可以產(chǎn)生抗植物病原真菌的抑菌活性物質(zhì)，有關(guān)拮抗活性物質(zhì)的分離純化以及活性物質(zhì)對苦瓜枯萎病菌的抑制作用機制等問題尚有待于進(jìn)一步深入研究。此外，在測定短短芽孢桿菌TB17的生防效果的同時，發(fā)現(xiàn)該菌株對苦瓜植株的促生效果顯著，該試驗結(jié)果是否與菌株TB17具有解磷作用和產(chǎn)嗜鐵素的功能有直接關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。