STC1、TWEAK、miR-183在COPD患者中的表達(dá)及相關(guān)性研究

蔣麗萍，李文珍，韋江妹

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤外科，海南 ?？?570311)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限和相應(yīng)呼吸系統(tǒng)癥狀為臨床特征的呼吸疾病，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、氣促、喘息等[1]。COPD隨著病情加重可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病、呼吸衰竭，嚴(yán)重影響患者生命安全，世界衛(wèi)生組織報(bào)道，隨著發(fā)達(dá)國(guó)家人口老齡化加劇和發(fā)展中國(guó)家吸煙率提升，未來(lái)40年COPD患病率會(huì)持續(xù)上升，預(yù)計(jì)到2060年COPD及相關(guān)疾病死亡病例將超過(guò)540萬(wàn)[2]。盡早評(píng)估COPD嚴(yán)重程度對(duì)臨床制定個(gè)體化方案和防治病情惡化意義重大。COPD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前研究認(rèn)為是吸入有害氣體或顆?？梢饸獾姥装Y反應(yīng)和氧化應(yīng)激及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等多種途徑參與COPD發(fā)生發(fā)展[3-4]。斯鈣素1(stanniocalcin 1，STC1)是一種糖蛋白激素，研究報(bào)道STC1能通過(guò)抑制氧化損傷和細(xì)胞凋亡保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[5]。腫瘤壞死因子相關(guān)弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是一種多功能細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞增殖、分化、黏附等功能[6]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)基因調(diào)控分子，能影響靶基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路參與COPD發(fā)生發(fā)展[7]。研究報(bào)道m(xù)iR-183與炎癥疾病狼瘡腎炎的疾病活動(dòng)程度相關(guān)[8]。探討STC1、TWEAK、miRNA-183在COPD患者中的表達(dá)及相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年12月我院收治的COPD患者114例為COPD組，其中男性68例，女性46例；年齡38～78歲，平均(62.54±5.87)歲；體重指數(shù)18～25，平均22.54±1.52；病程2～15年，平均(5.36±1.78)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性阻塞性肺疾病診治中國(guó)指南(2013年修訂版)》[9]COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥18歲；③臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肺部手術(shù)史或合并肺間質(zhì)纖維化、肺結(jié)核、哮喘、支氣管肺炎等其他肺部疾病者；②合并急慢性炎癥性疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器損害者；④惡性腫瘤患者；⑤合并免疫、血液系統(tǒng)疾病者；⑥近3個(gè)月接受免疫抑制劑、激素藥物治療者。另選取同期體檢健康者63例為對(duì)照組，其中男性38例，女性25例；年齡24～78歲，平均(62.11±5.72)歲；體重指數(shù)18～25，平均22.42±1.48。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情研究且簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1肺功能檢查 所有受試者入院后2 h內(nèi)使用麥邦MAS-99肺功能檢測(cè)儀檢查第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)和用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)，計(jì)算FEV1/FVC。

1.2.2血清指標(biāo)測(cè)定 采集COPD組入院時(shí)和對(duì)照組體檢時(shí)靜脈血，3 000 r/min離心10 min，半徑8 cm，取上清液，-80 ℃保存待檢。部分使用Trizol試劑盒提取血清總RNA，驗(yàn)證RNA濃度和純度后，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。miR-183正向引物：5′-ACATCACATCGGTAGTTGCCAT-3′，反向引物：5′-AAACAAAGAGGTAAAGGTGCA-3′。反應(yīng)體系：1 μL cDNA、0.3 μL引物、5 μL SYBRPremix Ex Taq II Mix、3.4 μL ddH2O；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。內(nèi)參U6正向引物：5′-CCACGAGTCTCTTT-CGAGC-3′，反向引物：5′- TTGACGTTTCACGA-TACAT -3′。2-△△Ct法計(jì)算血清miR-183相對(duì)表達(dá)量。其余部分酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定血清STC1、TWEAK、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)6、IL-8水平，硫代比色法測(cè)定血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，黃嘌呤氧化法測(cè)定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，試劑盒均由上海梵態(tài)生物科技有限公司提供，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3病情嚴(yán)重程度和預(yù)后分組 COPD患者入院吸入支氣管舒張劑后參考《慢性阻塞性肺疾病診治中國(guó)指南(2013年修訂版)》[9]根據(jù)氣流受限程度分級(jí)，極重度：FEV1<30%；重度：FEV130～49%；中度：FEV150%～79%；輕度：FEV1≥80%；根據(jù)氣流受限程度將患者分為重度組(極重度和重度)23例、中度組48例、輕度組43例。并根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治中國(guó)指南(2013年修訂版)》[9]接受常規(guī)平喘、化痰、抗感染、無(wú)創(chuàng)通氣等治療，以患者痊愈出院或死亡的研究終點(diǎn)，分為病死組22例和存活組92例。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用Z檢驗(yàn)；計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、SNK-q檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析；ROC曲線分析血清STC1、TWEAK、miR-183水平對(duì)COPD患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值，并計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1COPD組和對(duì)照組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較 COPD組血清STC1水平低于對(duì)照組，TWEAK、miR-183水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 COPD組和對(duì)照組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較Table 1 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels between the COPD and control groups

2.2COPD組和對(duì)照組肺功能、氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)比較 COPD組FEV1、FEV1/FVC和血清MDA、IL-6、IL-8水平高于對(duì)照組，SOD水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 COPD組和對(duì)照組肺功能、氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)比較Table 2 Comparison of lung function, oxidative stress and inflammation indicators between the COPD and control groups

2.3不同COPD嚴(yán)重程度患者血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較 輕、中、重度組血清STC1水平依次降低，TWEAK、miR-183水平依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同COPD嚴(yán)重程度患者血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較Table 3 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in patients with different COPD severity

2.4不同COPD嚴(yán)重程度患者血清氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)比較 輕、中、重度組血清MDA、IL-6、IL-8水平依次升高，SOD水平依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同COPD嚴(yán)重程度患者血清氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)比較Table 4 Comparison of serum oxidative stress and inflammation indicators in patients with different COPD severity

2.5COPD組血清STC1、TWEAK、miR-183水平與肺功能、氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，COPD組血清STC1水平與FEV1、FEV1/FVC、SOD呈正相關(guān)，與MDA、IL-6、IL-8呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TWEAK、miR-183水平與FEV1、FEV1/FVC、SOD呈負(fù)相關(guān)，與MDA、IL-6、IL-8呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 COPD組血清STC1、TWEAK、miR-183水平與肺功能、氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)的相關(guān)性Table 5 Correlation of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels with lung function, oxidative stress and inflammation indicators in the COPD group

2.6病死組與存活組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較 病死組血清STC1水平明顯低于存活組，TWEAK、miR-183水平明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 病死組與存活組血清STC1、TWEAK、miR-183水平比較Table 6 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels between the death and survival groups

2.7血清STC1、TWEAK、miR-183水平對(duì)COPD患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線顯示，STC1+TWEAK+miR-183預(yù)測(cè)COPD患者預(yù)后不良的AUC明顯大于各指標(biāo)單獨(dú)預(yù)測(cè)(Z=2.632、2.680、3.189，P=0.009、0.007、0.001)。見(jiàn)表7，圖1。

表7 血清STC1、TWEAK、miR-183水平對(duì)COPD患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值Table 7 Predictive value of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in poor prognosis in COPD patients

圖1 血清STC1、TWEAK、miR-183水平預(yù)測(cè)COPD患者預(yù)后不良的ROC曲線Figure 1 ROC curves of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in predicting poor prognosis in COPD patients

3 討 論

COPD中央氣道壁存在T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，增加黏液分泌物阻塞氣道管腔導(dǎo)致氣道阻塞，也可促進(jìn)成纖維細(xì)胞和平滑肌增生導(dǎo)致氣道重塑[10]。同時(shí)吸入有害氣體或顆粒后，可增加肺部活性氧含量，引起體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，導(dǎo)致氣道和肺組織損傷，破壞肺實(shí)質(zhì)，也是COPD進(jìn)展機(jī)制之一[11]。本研究中COPD組血清氧化損傷標(biāo)志物SOD水平和炎癥因子IL-6、IL-8水平明顯升高，抗氧化酶SOD水平明顯降低，同時(shí)輕、中、重度組血清SOD水平依次降低，MDA、IL-6、IL-8水平依次升高，符合上述報(bào)道機(jī)制。盡管目前已明確氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在COPD中的作用，并已開(kāi)發(fā)相關(guān)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)治療方法，但COPD仍然是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的重要病因，因此還需探索相關(guān)生物標(biāo)記物，以闡述COPD發(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療。

STC1是一種內(nèi)分泌因子，在所有組織中均有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)鈣離子和磷酸鹽穩(wěn)態(tài)，既往研究多報(bào)道其在各種腫瘤中的作用，參與腫瘤細(xì)胞分化和血管生成等過(guò)程[12-13]。近年研究報(bào)道，STC1還參與細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等過(guò)程。一項(xiàng)肺癌研究顯示，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞能通過(guò)分泌STC1降低肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，增加肺癌細(xì)胞存活率[14]。同時(shí)研究報(bào)道，齊墩果酸能通過(guò)STC1調(diào)節(jié)解偶聯(lián)蛋白2表達(dá)，減輕阿爾茨海默病細(xì)胞氧化應(yīng)激[15]。但是否通過(guò)氧化應(yīng)激參與COPD尚不明確。本研究結(jié)果顯示，COPD組血清STC1水平明顯低于對(duì)照組，輕、中、重度組血清STC1水平依次降低，并與FEV1、FEV1/FVC呈正相關(guān)，說(shuō)明STC1參與COPD發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析，COPD組血清STC1水平與SOD呈正相關(guān)，與MDA、IL-6、IL-8呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明STC1與COPD病情進(jìn)展中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。Tang等[16]通過(guò)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷顯示，肺部存在明顯氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，注射重組STC1后肺部氧化應(yīng)激和炎癥明顯改善?？紤]是STC1參與抗氧化應(yīng)激過(guò)程，STC1水平降低反映機(jī)體氧化應(yīng)激增加，過(guò)度氧化也會(huì)刺激肺部炎癥反應(yīng)，且隨著炎癥反應(yīng)加重，又可加劇氧化與抗氧化失衡，因此STC1能通過(guò)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)途徑參與COPD進(jìn)展，相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步證實(shí)。

TWEAK是TNF家族一個(gè)新成員，在炎癥、氧化應(yīng)激、機(jī)械、組織損傷過(guò)程中可大量分泌，并結(jié)合細(xì)胞表面受體Fn14激活核因子κB信號(hào)通路，參與炎癥反應(yīng)[6]。近年多項(xiàng)研究也報(bào)道TWEAK與急性ST段抬高型心肌梗死、心腎綜合征等炎癥疾病密切相關(guān)[17-18]。而同樣作為一種炎癥疾病，關(guān)于TWEAK與COPD病情進(jìn)展的關(guān)系卻無(wú)研究報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，COPD組血清TWEAK水平明顯高于對(duì)照組，輕、中、重度組血清TWEAK水平依次升高低，并與FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明TWEAK參與COPD發(fā)生發(fā)展，分析與COPD患者炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激下刺激TWEAK大量分泌有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，COPD組血清TWEAK水平與SOD呈負(fù)相關(guān)，與MDA、IL-6、IL-8呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明TWEAK與COPD病情進(jìn)展中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。Fn14是目前唯一確認(rèn)的TWEAK受體，一旦Fn14表達(dá)上調(diào)，TWEAK就能結(jié)合Fn14胞外配體，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6]。體外實(shí)驗(yàn)顯示，敲除Fn14能減少肺微血管胞間黏附分子1和單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，修復(fù)膿毒癥引起的急性肺損傷[19]。本研究驗(yàn)證了該研究結(jié)果，但關(guān)于TWEAK在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用尚缺乏證據(jù)。

miRNA是內(nèi)源性非編碼長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的小分子RNA，持續(xù)慢性炎癥和氧化應(yīng)激能引起某些miRNA異常表達(dá)，參與COPD的發(fā)生[7]。如miR-195-5p可靶向唾液酸結(jié)合Ig樣凝集素1抑制COPD的炎癥反應(yīng)[20]。miR-183定位于人染色體7q32.2，為視網(wǎng)膜高度表達(dá)特異性miRNA，既往研究多報(bào)道其在眼科疾病中的作用，近年研究顯示，多種炎癥疾病中也能出現(xiàn)miR-183異常表達(dá)。如狼瘡腎炎患兒血清miR-183呈低表達(dá)[8]。同時(shí)上調(diào)miR-183能抑制缺血性卒中核因子κB活化，減輕炎癥[21]。曾宗鼎等[22]通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)COPD患者外周血miRNAs，結(jié)果顯示，外周血miR-183表達(dá)顯著上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，COPD組血清miR-183水平明顯高于對(duì)照組，輕、中、重度組血清miR-183水平依次升高，并與FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-183參與COPD發(fā)生發(fā)展。同時(shí)COPD組血清miR-183水平與SOD呈負(fù)相關(guān)，與MDA、IL-6、IL-8呈正相關(guān)，說(shuō)明miR-183與COPD病情進(jìn)展中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，這與林烈桔等[8]研究報(bào)道的miR-183在狼瘡腎炎患兒血清表達(dá)降低不符，推測(cè)與miR-183在不同組織和疾病中的表達(dá)不同有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還顯示，病死組血清STC1水平明顯降低，TWEAK、miR-183水平明顯升高，提示STC1、TWEAK、miR-183還可能與COPD患者預(yù)后不良有關(guān)，ROC曲線也證實(shí)，三者均對(duì)COPD患者預(yù)后不良具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)通過(guò)聯(lián)合3個(gè)指標(biāo)能顯著增加AUC，說(shuō)明聯(lián)合預(yù)測(cè)能提升COPD患者預(yù)后不良預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，COPD患者血清STC1水平降低，TWEAK、miR-183水平升高，可能通過(guò)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與COPD病情進(jìn)展，可作為患者預(yù)后不良預(yù)測(cè)指標(biāo)。但關(guān)于三者與COPD的具體關(guān)系還需進(jìn)一步證實(shí)。