以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞促進(jìn)脂肪移植存活率的研究

劉超 魏計(jì)超 莫志洋 趙亞平 高慧 趙愛(ài)群 李燕 李素芬 孫鵬飛

(1 石家莊市人民醫(yī)院整形美容中心，河北 石家莊 050000； 2 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科；3 青海省人民醫(yī)院整形外科； 4 石家莊市人民醫(yī)院手術(shù)室； 5 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院整形七科)

自體脂肪作為一種理想的軟組織填充材料，其不僅可修復(fù)因先天畸形、后天創(chuàng)傷或腫瘤術(shù)后導(dǎo)致的軟組織缺損，還可對(duì)軟組織凹陷和面部年輕化患者進(jìn)行填充塑形。但自體脂肪的吸收率比較高，制約了其在臨床應(yīng)用推廣[1]。自體脂肪移植后，在毛細(xì)血管再生以前，脂肪無(wú)法獲得氧氣和營(yíng)養(yǎng)，脂肪細(xì)胞容易液化壞死，從而被機(jī)體吸收代謝，無(wú)法達(dá)到脂肪填充的理想效果[2]。因此，如何有效提高脂肪細(xì)胞移植后的存活率是整形外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。另外，在自體脂肪移植中，許多體型較瘦的患者因受到自體脂肪量少的限制，無(wú)法達(dá)到取材的目的而影響治療。因此本研究團(tuán)隊(duì)一直在尋找一種用組織工程脂肪提高自體脂肪移植存活率的方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可以分化為多種細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，在再生醫(yī)學(xué)以及組織工程學(xué)中是公認(rèn)的新型種子細(xì)胞。其中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的分化能力更強(qiáng)[3]。本實(shí)驗(yàn)將具有多向分化潛能的hUC-MSCs作為種子細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化為組織工程脂肪，探討其在脂肪移植中提高脂肪存活率的能力，為組織工程脂肪應(yīng)用于整形外科臨床奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料來(lái)源

BALB/c雄性裸鼠30只(北京華阜康生物科技有限公司)，6～8周齡，體質(zhì)量(25±2)g。SD雄性大鼠 10只(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，8～10周齡，體質(zhì)量(200±10)g。DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone 公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，青霉素-鏈霉素混合液(美國(guó)Gibco公司)。

1.2 hUC-MSCs的獲取、培養(yǎng)、鑒定及成脂誘導(dǎo)

無(wú)菌條件下獲取石家莊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科足月妊娠分娩新生兒臍帶標(biāo)本，1～3 h內(nèi)在無(wú)菌條件下處理，首先將臍帶剪成約4 cm長(zhǎng)組織段，去除臍靜脈和臍動(dòng)脈，將臍帶中華通膠組織撕裂成條索狀，剪成體積約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，向90 mL DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清10 mL及5 000 kU/L的青霉素-鏈霉素混合液1 mL，均勻混合成培養(yǎng)液。將臍帶組織塊置入培養(yǎng)液中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，7 d后首次換液，以后每3 d換液一次，待細(xì)胞融合度約80%時(shí)，以2.5 g/L的胰酶消化液消化，按1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)至第4代時(shí)hUC-MSCs表面抗原CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表達(dá)。然后應(yīng)用含有1.0×10-6mol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、0.2 mmol/L吲哚美辛的誘導(dǎo)基對(duì)第4代hUC-MSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。每3 d換液一次，24 d后進(jìn)行油紅O脂肪染色鑒定誘導(dǎo)情況。

1.3 脂肪顆粒制備

10只SD大鼠均使用脫椎方式處死，將大鼠腸系膜、腹股溝處的脂肪取出，使用PBS液沖洗3次后，將其剪成體積約為0.5 mm×1 mm ×1 mm～1 mm×1 mm×1 mm大小顆粒，用50 mL離心管裝入脂肪顆粒并混合10 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，使用離心機(jī)對(duì)脂肪顆粒進(jìn)行離心(1 200 r/min)，時(shí)間為3 min，將上層的脂肪顆粒取出備用。

1.4 動(dòng)物模型制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只裸鼠分為7 d組、14 d組和28 d組，每組10只裸鼠。每組裸鼠均采用同體對(duì)照法，左側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)，右側(cè)為對(duì)照側(cè)。使用1 mL注射器將成脂誘導(dǎo)24 d后的第4代hUC-MSCs 40 mg與大鼠脂肪顆粒360 mg均勻混合后注射至裸鼠左側(cè)(實(shí)驗(yàn)側(cè))腹部筋膜下，并將相同劑量的單純大鼠脂肪顆粒注射至裸鼠右側(cè)(對(duì)照側(cè))腹部筋膜下。

1.5 移植脂肪組織病理學(xué)觀察及質(zhì)量維持率測(cè)定

分別于第7、14、28天將3組裸鼠脫椎處死，使用眼科剪刀從裸鼠腹部筋膜下取出全部脂肪組織，使用電子天平稱質(zhì)量后進(jìn)行病理切片制備及HE染色，對(duì)3組裸鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)脂肪組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)以及微血管含量等進(jìn)行觀察比較。計(jì)算各組裸鼠移植脂肪組織質(zhì)量維持率并行比較，移植脂肪組織質(zhì)量維持率=(取出總脂肪組織質(zhì)量/400 mg)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hUC-MSCs流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)及成脂誘導(dǎo)結(jié)果

對(duì)第4代hUC-MSCs采用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示，細(xì)胞表面抗原CD29、CD44、CD105表達(dá)陽(yáng)性率均在90%以上，CD14、CD34、CD45幾乎不表達(dá)，符合間充質(zhì)細(xì)胞特性，鑒定第4代hUC-MSCs為純化的hUC-MSCs細(xì)胞。

hUC-MSCs加入成脂誘導(dǎo)基3～5 d后，hUC-MSCs細(xì)胞由梭形或多角形逐漸變得圓鈍(圖1A)。6～8 d后細(xì)胞呈圓梭形，細(xì)胞的胞漿內(nèi)形成脂滴，細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸融合變大，誘導(dǎo)23 d后鏡下觀可以明顯看到脂滴相互融合(圖1B)。誘導(dǎo)24 d經(jīng)油紅O脂肪染色，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量被染成紅色的透亮的脂滴(圖1C)。由此可以判斷hUC-MSCs轉(zhuǎn)化成了脂肪細(xì)胞。

A：hUC-MSCs加入成脂誘導(dǎo)基3 d后的形態(tài)，B：hUC-MSCs加入成脂誘導(dǎo)基23 d后的形態(tài)，C：hUC-MSCs加入成脂誘導(dǎo)基24 d后進(jìn)行油紅O染色的形態(tài)圖1 hUC-MSCs成脂誘導(dǎo)后鏡下觀(200倍)Fig.1 Morphological changes of hUC-MSCs after adipogenic induction under a microscope (200×)

2.2 3組裸鼠移植脂肪組織HE染色結(jié)果比較

7 d組對(duì)照側(cè)脂肪組織內(nèi)部有炎性細(xì)胞，可見(jiàn)組織壞死和空泡形成。另外，脂肪組織外側(cè)有纖維組織形成(圖2A)。14 d組對(duì)照側(cè)脂肪組織內(nèi)部壞死組織明確，脂肪組織切片呈網(wǎng)格狀(圖2B)。28 d組對(duì)照側(cè)脂肪組織中可見(jiàn)明顯壞死區(qū)，新生血管數(shù)目少(圖2C)；3組實(shí)驗(yàn)側(cè)脂肪組織結(jié)構(gòu)正常，新生血管明顯增多，脂肪組織炎癥不明顯(圖2D～F)。

A～C：7、14、28 d組裸鼠對(duì)照側(cè)移植脂肪組織HE染色結(jié)果，D～F：7、14、28 d組裸鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)移植脂肪組織HE染色結(jié)果

2.3 3組裸鼠移植脂肪組織質(zhì)量維持率比較

7、14、28 d組實(shí)驗(yàn)側(cè)移植脂肪組織質(zhì)量維持率分別為(99.81±1.36)%、(95.20±1.83)%、(90.64±2.37)%。 7、14、28 d組對(duì)照側(cè)則分別為(71.26±5.85)%、(59.14±2.32)%、(50.59±1.94)%。重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、側(cè)別以及時(shí)間與側(cè)別交互作用對(duì)移植脂肪組織質(zhì)量維持率有顯著的影響(F時(shí)間=126.54，F(xiàn)側(cè)別=2471.83，F(xiàn)時(shí)間*側(cè)別=30.43，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示，7、14、28 d組裸鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)移植脂肪組織質(zhì)量維持率呈逐漸降低(F=58.47，P<0.05)，對(duì)照側(cè)移植脂肪組織質(zhì)量維持率也逐漸降低(F=225.28，P<0.05)；3組裸鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)移植脂肪組織質(zhì)量維持率均顯著高于對(duì)照側(cè)(F=1 490.66～2 142.95，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)側(cè)脂肪組織外觀體積明顯大于對(duì)照側(cè)(圖3)。

A：實(shí)驗(yàn)側(cè)，B：對(duì)照側(cè)

3 討 論

脂肪顆粒來(lái)源于人體或動(dòng)物皮下脂肪，取材廣泛，且與機(jī)體相容性好、排斥性較低，是天然的生物填充材料[4]。移植自體脂肪的血管化一般發(fā)生在移植手術(shù)以后的24～48 h，脂肪血管化之前缺血缺氧的環(huán)境常導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的壞死和吸收等[5-7]，提高自體脂肪移植后的存活率是自體脂肪移植手術(shù)成敗的關(guān)鍵，也一直是整形外科醫(yī)生的研究熱點(diǎn)。另外，在脂肪移植過(guò)程中，許多患者因?yàn)轶w型瘦小，脂肪量較少而使脂肪取材困難[8-9]。因此本研究將原材料來(lái)源廣泛、取材方便、易于培養(yǎng)、純度高、免疫源性低、具有多向分化潛能的hUC-MSCs作為種子細(xì)胞誘導(dǎo)生成脂肪細(xì)胞，并探究hUC-MSCs生成的脂肪細(xì)胞與脂肪顆粒共同移植對(duì)移植后脂肪組織存活率的影響。本研究期望同時(shí)解決組織工程脂肪來(lái)源問(wèn)題和提高自體脂肪移植存活率問(wèn)題，為hUC-MSCs來(lái)源組織工程脂肪在整形外科的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究使用hUC-MSCs來(lái)源的脂肪細(xì)胞與天然的脂肪細(xì)胞顆粒混合后移植于裸鼠腹部筋膜實(shí)驗(yàn)側(cè)，并將對(duì)側(cè)設(shè)置為對(duì)照側(cè)。經(jīng)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)，移植脂肪細(xì)胞質(zhì)量維持率逐漸降低。但7、14、28 d組實(shí)驗(yàn)側(cè)脂肪細(xì)胞質(zhì)量維持率持續(xù)高于對(duì)照側(cè)。由此可知，在移植脂肪組織中添加hUC-MSCs來(lái)源的脂肪細(xì)胞可以有效提高脂肪細(xì)胞的存活率，降低脂肪細(xì)胞的吸收率。

美國(guó)整形外科協(xié)會(huì)在討論自體脂肪移植存在的問(wèn)題和面臨的挑戰(zhàn)時(shí)指出，移植脂肪1年以上的存活率僅為30%，同時(shí)也質(zhì)疑了脂肪移植后的長(zhǎng)期維持率和實(shí)際存活率[10]。有研究證實(shí)，移植后的脂肪顆粒早期處于缺血缺氧狀態(tài)，在這種環(huán)境中，脂肪組織會(huì)被液化和吸收。但缺氧對(duì)干細(xì)胞的旁分泌具有促進(jìn)作用[11]，在缺血缺氧環(huán)境中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)在hUC-MSCs的旁分泌作用下，可出現(xiàn)明顯的高表達(dá)。VEGF能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，可有效促進(jìn)脂肪移植后的血管化。bFGF是一種重要的有絲分裂刺激因子，可以促進(jìn)新生血管形成。隨著新生血管的形成，可以有效改善缺血缺氧的環(huán)境，從而提高移植脂肪組織的存活率。VEGF、bFGF等因子不僅可以加快新生血管的形成，而且具有明顯的抗炎作用，可以有效促進(jìn)脂肪組織移植后的成活[12-14]。因此本研究認(rèn)為，移植進(jìn)入裸鼠體內(nèi)的hUC-MSCs來(lái)源的脂肪細(xì)胞仍然存在hUC-MSCs特性，在脂肪移植早期極度缺血缺氧狀態(tài)下，仍然會(huì)通過(guò)旁分泌方式釋放VEGF、bFGF等，加速移植脂肪組織中新生血管的形成，使血運(yùn)快速重建，避免了脂肪細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧狀態(tài)下壞死，從而提高了移植脂肪細(xì)胞的存活率[15-16]。

綜上所述，hUC-MSCs來(lái)源的脂肪細(xì)胞與天然的脂肪細(xì)胞顆?；旌虾笠浦部梢杂行岣咭浦仓炯?xì)胞的質(zhì)量維持率。本研究為以hUC-MSCs為種子細(xì)胞的組織工程脂肪在脂肪移植中的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究的局限性在于，由于經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)條件的限制，并沒(méi)有探討hUC-MSCs來(lái)源的脂肪細(xì)胞提高移植后脂肪存活率的具體機(jī)制，以后本課題組將對(duì)這方面進(jìn)行更深入的研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)石家莊市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)201912026)。所有動(dòng)物處理和實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of Shijiazhuang People’s Hospital (Approval Letter No.201912026). All experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of The Regulations of The People’s Republic of China on The Administration of Experimental Animals.

作者貢獻(xiàn)：劉超、孫鵬飛參與了研究設(shè)計(jì)；劉超、魏計(jì)超、莫志洋、趙亞平、高慧、趙愛(ài)群、李燕、李素芬、孫鵬飛參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byLIUChao, andSUNPengfei.The manuscript was drafted and revised byLIUChao,WEIJichao,MOZhiyang,ZHAOYaping,GAOHui,ZHAOAiqun,LIYan,LISufen, andSUNPengfei. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.