褐藻膠寡糖對D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

陳茗 馮文靜 胡松 劉佳 王珊 毛擁軍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266071)

肝臟衰老可使肝臟損傷的風(fēng)險(xiǎn)增加，導(dǎo)致肝臟功能受損，促進(jìn)多種慢性肝病的進(jìn)程[1-2]。作為促進(jìn)肝臟衰老的主要機(jī)制之一，氧化應(yīng)激可以顯著上調(diào)肝臟組織中p53以及p21的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，影響肝臟的正常功能[3-5]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)作為調(diào)節(jié)組織細(xì)胞抗氧化功能的關(guān)鍵信號(hào)分子，通過調(diào)節(jié)下游血紅素氧化酶-1 (HO-1)的水平，從而達(dá)到抑制氧化應(yīng)激的目的[6]。研究表明，D-半乳糖(D-gal)通過增強(qiáng)組織細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生衰老[7]。D-gal誘導(dǎo)的衰老動(dòng)物模型已被廣泛用于天然化合物對氧化應(yīng)激損傷的治療作用和機(jī)制的研究[8-10]。

褐藻酸鹽是一種從海藻中提取的天然多糖。褐藻膠寡糖(AOS)由褐藻酸鹽解聚而成，具有水溶性、無毒、無免疫原性和可生物降解等多種特性，而且具有較高的生物活性和藥理活性，具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等作用[11-13]。目前關(guān)于衰老對促進(jìn)肝臟損傷的影響及機(jī)制研究有限，明確衰老驅(qū)動(dòng)的肝臟損傷的潛在機(jī)制并尋找有效的治療策略是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本研究探討了AOS對D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟損傷的保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制，為年齡相關(guān)性肝臟損傷的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6J小鼠32只，6～8周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度(21±2)℃，相對濕度(50±10)%，12-12 h晝夜循環(huán)環(huán)境。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 D-gal購自美國Sigma公司，AOS于青島博智匯力生物技術(shù)有限公司獲得。ALT、AST試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)相關(guān)引物購自北京睿博興科生物技術(shù)有限公司，p21抗體購買于愛必信(上海)生物科技有限公司，gp91 phox和p67 phox抗體購自美國Santa Cruz公司，SOD1抗體購自英國abcam公司，GAPDH、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗購自武漢Elabscience公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及處理C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組(A組)、AOS組(B組)、D-gal組(C組)以及D-gal+AOS組(D組)，每組各8只小鼠。C組和D組小鼠連續(xù)每天頸背部皮下注射D-gal 200 mg/kg，連續(xù)8周從而建立小鼠肝臟衰老模型，A組和B組小鼠相同部位注射等劑量的生理鹽水；B組和D組小鼠于第5周開始每天以AOS(200 mg/kg)灌胃處理，連續(xù)4周，其余各組以等量生理鹽水灌胃處理。

1.2.2肝臟功能測定 干預(yù)結(jié)束后使用吸入性麻醉劑異氟烷麻醉小鼠，通過眼眶靜脈收集小鼠血液， 4 ℃下以2 500 r/min離心20 min后，收集血清于-80 ℃保存?zhèn)溆?，根?jù)試劑盒說明書要求的步驟分別檢測小鼠血清中ALT、AST的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.3Western blot方法檢測小鼠肝臟組織之中衰老蛋白p21、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的氧化酶亞基gp91 phox、p67 phox和超氧化物歧化酶1(SOD1)蛋白水平 收集血液后處死小鼠，取各組小鼠肝臟組織并加入含有蛋白酶抑制劑RIPA裂解液，勻漿后4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，收集含有總蛋白的上清液。蛋白樣品通過凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳完成后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，并使用脫脂牛奶于室溫下封閉1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入相應(yīng)的一抗，4 ℃下孵育過夜，TBST再次洗膜3次，室溫下使用二抗孵育1.5 h，TBST洗膜后通過ECL顯影液進(jìn)行曝光。蛋白條帶成像后使用Image J軟件分析灰度值，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照，計(jì)算各蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取3次實(shí)驗(yàn)的均值。

1.2.4RT-qPCR方法檢測小鼠肝臟組織中Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá) 取適量的各組小鼠肝臟組織并加入Trizol提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別取各組的cDNA樣本和Nrf2、HO-1的上、下游引物按照RT-qPCR試劑盒說明書要求的步驟進(jìn)行RT-qPCR檢測。結(jié)果通過2-△△CT法計(jì)算各目的基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。引物序列見表1。

表1 引物名稱及其序列Tab.1 Primer names and sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 AOS對D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠血清中ALT和AST表達(dá)水平的影響

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，AOS干預(yù)、D-gal誘導(dǎo)以及AOS和D-gal交互作用均對小鼠血清中ALT和AST的水平具有明顯影響(FAOS=13.06、13.12，F(xiàn)D-gal=136.82、93.40，F(xiàn)AOS*D-gal=8.03、7.56,P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，AOS干預(yù)和不干預(yù)時(shí)，D-gal對小鼠血清中ALT和AST的水平均有影響(F=23.92～105.58,P<0.05)。D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)顯著(F=20.29、20.78,P<0.05)；無D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)不顯著(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.2 AOS對D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟組織中衰老相關(guān)蛋白p21、NADPH氧化酶亞基gp91 phox、p67 phox表達(dá)的影響

析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，AOS干預(yù)對小鼠肝臟組織中p21和gp91 phox的表達(dá)均有影響(FAOS=67.34、41.85,P<0.05)，對于p67 phox表達(dá)則無明顯影響(P>0.05)。D-gal誘導(dǎo)及AOS和D-gal交互作用對小鼠肝臟組織中p21、gp91 phox和p67 phox的表達(dá)有明顯的影響(FD-gal=60.22～1 053.16,FAOS*D-gal=14.35～85.13，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，AOS干預(yù)和不干預(yù)時(shí)，D-gal對小鼠肝臟組織中p21、gp91 phox和p67 phox的表達(dá)均有影響(F=174.80～836.38,P<0.05)。D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)顯著(F=12.28～138.67,P<0.05)；無D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)不顯著(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.3 AOS對D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟組織中Nrf2、HO-1 mRNA和SOD1蛋白表達(dá)的影響

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，AOS干預(yù)、D-gal誘導(dǎo)及AOS和D-gal交互作用對小鼠肝臟組織中SOD1及Nrf2、HO-1 mRNA的水平均有明顯影響(FAOS=8.82～19.78，F(xiàn)D-gal=12.25～435.92，F(xiàn)AOS*D-gal=12.60～44.78，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，AOS干預(yù)和不干預(yù)時(shí)，D-gal對小鼠肝臟組織中Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)水平均有明顯影響(F=70.00～380.07，P>0.05)；D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)較顯著(F=62.04、253.34,P<0.05)；無D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)不顯著(P>0.05)。小鼠肝臟組織中抗氧化酶SOD1結(jié)果單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，AOS干預(yù)時(shí)，D-gal的單獨(dú)效應(yīng)不顯著(P>0.05)；無AOS干預(yù)時(shí)，D-gal的單獨(dú)效應(yīng)顯著(F=24.85，P<0.05)；D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)顯著(F=21.26,P<0.05)，無D-gal干預(yù)時(shí)，AOS的單獨(dú)效應(yīng)不顯著(P>0.05)。結(jié)果詳見表2。

表2 AOS對D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠血清中ALT和AST水平及肝臟功能的影響Tab.2 Effect of AOS on the serum levels of ALT and AST and liver function in a mouse model of D-gal-induced senescence

3 討 論

衰老是機(jī)體正常的生理過程，也是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，機(jī)體衰老伴隨著維持氧化平衡穩(wěn)態(tài)能力的降低[14]。氧化應(yīng)激是肝臟損傷的主要危險(xiǎn)因素之一。正常情況下，機(jī)體通過各種抗氧化酶清除細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧簇(ROS)，維持氧化還原平衡，使組織免受氧化應(yīng)激的損傷，但衰老機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)ROS的能力明顯降低，機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡會(huì)損害組織器官功能，促進(jìn)衰老和疾病的發(fā)生與發(fā)展[15-17]。

研究發(fā)現(xiàn)，長期注射D-gal會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此被廣泛用于動(dòng)物衰老模型的制備[18-19]。D-gal通過破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生壞死裂解。本研究結(jié)果顯示，D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠血清中ALT、AST的水平明顯升高，表明D-gal嚴(yán)重?fù)p害了小鼠肝功能；而AOS干預(yù)顯著降低了小鼠血清中ALT和AST的水平，據(jù)此我們推斷AOS對D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟損傷具有保護(hù)作用，可以改善衰老模型小鼠的肝功能。

研究顯示，NADPH氧化酶亞基gp91 phox參與調(diào)節(jié)細(xì)胞中ROS的生成、肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化過程，gp91 phox特異性缺失小鼠可以免受肥胖引起的葡萄糖代謝異常和肝細(xì)胞損傷[20]。AOS可通過降低細(xì)胞內(nèi)gp91 phox、p67 phox的表達(dá)，減輕細(xì)胞中ROS累積，降低組織氧化應(yīng)激水平，顯示出較強(qiáng)的抗衰老活性[8,21]。為了明確AOS對衰老相關(guān)性肝臟損傷的潛在保護(hù)機(jī)制，本研究檢測了小鼠肝臟組織中相應(yīng)指標(biāo)的變化，結(jié)果顯示，D-gal干預(yù)可顯著提高小鼠肝臟組織中衰老相關(guān)蛋白p21及NADPH氧化酶亞基gp91 phox、p67 phox的表達(dá)；而AOS干預(yù)顯著抑制了衰老模型小鼠肝臟組織中p21、gp91及p67 phox的表達(dá)，減輕了D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟組織中的氧化應(yīng)激水平，表明AOS抗氧化應(yīng)激的特性可能在保護(hù)D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟損傷中起重要作用。

衰老與細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生增加和抗氧化能力降低引起的組織氧化損傷有關(guān)。隨著年齡的增長，肝臟的抗氧化能力降低，且易受氧化應(yīng)激的影響。以往研究表明，Nrf2/HO-1是機(jī)體抗氧化損傷的重要信號(hào)通路。在正常情況下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)結(jié)合，并被泛素蛋白酶體迅速降解[22-23]。當(dāng)組織遭受氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2/Keap1復(fù)合物解離，Nrf2經(jīng)Keap1介導(dǎo)的蛋白酶體降解減少并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，并誘導(dǎo)HO-1基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)下游抗氧化酶SOD1的產(chǎn)生，增強(qiáng)組織的抗氧化能力[24-26]。因此，本研究檢測了小鼠肝臟細(xì)胞中Nrf2/HO-1通路的相關(guān)指標(biāo)，并探討了AOS是否通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路增強(qiáng)肝臟組織的抗氧化能力。結(jié)果表明，D-gal顯著降低了小鼠肝臟組織中Nrf2、HO-1 mRNA及SOD1蛋白的表達(dá)水平；AOS的干預(yù)顯著上調(diào)了小鼠肝臟組織中Nrf2、HO-1 mRNA和SOD1蛋白表達(dá)，使肝臟組織的抗氧化能力顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，AOS可能通過激活肝臟細(xì)胞中Nrf2/HO-1信號(hào)通路上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，抑制肝臟組織中的氧化應(yīng)激水平，減輕D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟損傷。

綜上所述，本研究證實(shí)了D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟組織中氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力降低。AOS可以顯著改善D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟損傷，其機(jī)制可能與AOS激活肝臟細(xì)胞中Nrf2/HO-1信號(hào)通路，從而增強(qiáng)肝臟組織的抗氧化能力并抑制氧化應(yīng)激水平有關(guān)。然而，本研究僅在動(dòng)物水平探討了AOS通過抑制肝臟組織中的氧化應(yīng)激和增強(qiáng)肝臟組織的抗氧化能力起到改善D-gal誘導(dǎo)的衰老模型小鼠肝臟損傷的作用，AOS延緩肝臟衰老、抑制肝臟損傷的具體機(jī)制還有待在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)QYFYWZLL-26710)。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL26710), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of Regulations for The Administration of Experimental Animals.

作者貢獻(xiàn)：毛擁軍、陳茗、馮文靜參與了研究設(shè)計(jì)；陳茗、胡松、劉佳、王珊參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byMAOYongjun,CHENMing, andFENGWenjing. The manuscript was drafted and revised byCHENMing,HUSong,LIUJia, andWANGShan. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.