尿酸性腎病小鼠模型的構建

胡淑慧 李長貴 路杰

(山東省代謝性疾病重點實驗室，青島市痛風病重點實驗室，青島大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，山東 青島 266003)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是由于尿酸生成過多和(或)排泄不足引起的代謝異常綜合征。近年來，我國HUA的發(fā)病人群呈現(xiàn)出年輕化的趨勢[1-2]，總體患病率約達13.3%[3]。國內(nèi)外大量的研究資料顯示，HUA是慢性腎臟病發(fā)生和發(fā)展的獨立危險因素[4-6]，血尿酸濃度長期呈過飽和狀態(tài)，會加重腎臟負擔，使尿酸結晶沉積于腎臟，導致不同程度的腎損害，稱為尿酸性腎病(或痛風性腎病)[7-8]。隨著病情的進展，尿酸性腎病最終可發(fā)展為腎衰竭，尿酸性腎病儼然成為威脅人類生命健康的重要疾病之一。然而，目前國內(nèi)外對尿酸性腎病動物模型的開發(fā)仍處于早期階段，主要通過增加尿酸攝入和(或)減少尿酸排泄兩方面來實現(xiàn)，缺乏可靠的尿酸性腎病特征表型，這極大地阻礙了對其后續(xù)致病機制和新藥開發(fā)的研究。本研究旨在探討尿酸氧化酶(Uox)基因敲除小鼠的腎臟表型，明確其作為尿酸性腎病模型小鼠的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組 選取Uox基因敲除小鼠(以C57BL/6J為遺傳背景[9])16只，設為A組；同窩野生型小鼠16只，設為B組。兩組小鼠均為雄性，8周齡，體質量(20±2)g，飼養(yǎng)于青島大學附屬醫(yī)院SPF級動物房。

1.1.2試劑和儀器 CD3抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，CD68抗體(美國BioLegend公司)，非布司他(江蘇恒瑞制藥公司)。低溫離心機(德國Eppendorf公司)，TBA-40FR型全自動血液生化儀(日本TOSHIBA公司)，自動脫水機(日本Sakura公司)，RM2235切片機購自于德國Leica公司，SMZ800解剖鏡以及偏正光顯微鏡購自于日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1生化指標檢測 A、B兩組小鼠各16只禁食過夜，次日8：00用異氟烷對小鼠進行氣體麻醉，經(jīng)內(nèi)眥靜脈采集500 μL靜脈血至離心管中，室溫下靜置1 h，然后4 ℃下3 500 r/min離心20 min，分離出160 μL血清至潔凈生化杯中。應用全自動血液生化儀測定兩組小鼠血尿酸、血肌酐水平，每組測2次，計算平均值。

1.2.2腎臟病理標本制作 隨機取A、B兩組小鼠各4只。腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉小鼠，待小鼠無結膜反應及觸痛反應后，開腹取出雙側腎臟。將取出的一側腎臟迅速置于40 g/L多聚甲醛中，固定24 h后，用PBS沖洗3次，置于自動脫水機中進行脫水，石蠟包埋及切片。通過蘇木精-伊紅染色、Masson染色、抗CD3和抗CD68免疫組化染色，對比兩組小鼠腎臟病理改變、纖維化程度及炎癥狀態(tài)。將取出的另一側腎臟迅速置于無水乙醇中，固定24 h后石蠟包埋及切片，在偏振光顯微鏡下觀察尿酸鹽晶體沉積情況。

1.2.3降尿酸治療 隨機取A組小鼠6只，生理鹽水溶解非布司他(0.8 g/L)后灌胃給藥(8 mg/kg)；隨機取B組小鼠6只及剩余A組小鼠6只，用生理鹽水灌胃(10 mL/kg)作為對照。維持小鼠正常飼養(yǎng)，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃4周后，比較不同處理的兩組小鼠灌胃前后血尿酸、血肌酐的差值，每組測2次，計算平均值。觀察非布司他給藥后A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況的變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 兩組小鼠生化指標檢測結果

A、B兩組小鼠的血尿酸水平分別為(507.44±38.43)、(166.13±15.98)μmol/L，A組小鼠血尿酸水平顯著高于B組(t=32.80，P<0.01)。A、B組小鼠血肌酐水平分別為(39.56±5.67)、(13.88±2.00)μmol/L，A組小鼠血肌酐水平顯著高于B組(t=17.10，P<0.01)。

2.2 兩組小鼠腎臟病理檢測結果

肉眼下A組小鼠腎臟體積膨大，呈灰白色，被膜下散布乳白色顆粒，表面不平并見多個囊腔，皮髓質充血水腫，交界清晰；B組小鼠腎臟表面光滑，呈淺褐色，皮髓質交界清晰。

光鏡下，蘇木精-伊紅染色顯示，A組小鼠腎臟腎盂明顯積水，腎臟結構異常，呈空洞狀，腎皮質變薄，伴腎臟部分萎縮；B組小鼠腎臟結構正常。高倍鏡下顯示，A組小鼠腎單位結構異常，腎小球聚集伴輕度萎縮，鮑曼氏囊擴張，腎小管空泡變性伴刷狀緣脫落，部分腎小管呈不同程度擴張，腎間質輕度水腫；B組小鼠腎單位結構完整，未見明顯病理改變。Masson以及抗CD3、抗CD68免疫組織化學染色結果顯示，A組小鼠腎臟間質大量藍綠色膠原纖維沉積，纖維化損傷嚴重，并且伴有包括CD3+中性粒細胞、CD68+巨噬細胞在內(nèi)的大量炎性細胞浸潤；B組小鼠腎臟間質結構正常，沒有明顯炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 兩組小鼠腎臟病理學檢查結果(200倍)Fig.1 Renal pathological results of the two groups (×200)

2.3 各組降尿酸治療效果

經(jīng)非布司他灌胃后的A組小鼠與生理鹽水灌胃的A組、B組小鼠相比，治療前后血尿酸水平差值和血肌酐水平差值均有顯著性差異(F=195.54、42.20，P<0.01)。見表1。

表1 不同處理的兩組小鼠血尿酸、血肌酐水平的變化Tab.1 Changes in the levels of serum uric acid and serum creatinine in two groups after different treatments

同時，非布司他治療前A組小鼠腎臟可見明顯的尿酸鹽晶體(棕色晶體)沉積(圖2A)，B組小鼠腎臟無明顯的尿酸鹽晶體沉積(圖2B)；但經(jīng)非布司他治療4周后，A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積明顯減少(圖2C)。

A：非布司他治療前A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況，B：非布司他治療前B組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況，C：非布司他治療后A組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況圖2 兩組小鼠腎臟尿酸鹽晶體沉積情況(400倍)Fig.2 Deposition of urate crystals in the kidney of the two groups (×400)

3 討 論

腎臟是尿酸最常損害的靶器官之一，高水平的尿酸通過直接或間接作用導致腎臟損傷，引發(fā)尿酸性腎病。據(jù)統(tǒng)計，在79%～99%的痛風患者尸檢中可觀察到尿酸性腎病典型的病理改變，即腎間質和腎小管內(nèi)大量雙折光的針狀尿酸鹽結晶沉積，周圍伴有炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞壞死，腎小管萎縮，間質纖維化，嚴重者腎單位毀損[10]。

Uox是參與嘌呤代謝的重要酶，在大多數(shù)哺乳動物中，能夠將尿酸氧化為更易于溶解的尿囊素，并排出體外[11]。然而，由于Uox基因在人類和類人猿進化過程中經(jīng)歷了沉默突變，人體缺乏功能性尿酸氧化酶，尿酸成為人體內(nèi)嘌呤的代謝終末產(chǎn)物，導致人類尿酸水平是嚙齒動物的5～10倍[12]。在尿酸生成過多和(或)排泄不足的情況下，血清尿酸濃度將會升高，隨著病情的發(fā)展，最終引起尿酸性腎病。

本研究結果顯示，Uox基因敲除小鼠血尿酸水平>420 μmol/L，達到人類HUA的診斷標準。Uox基因敲除小鼠血肌酐水平顯著高于同窩野生型小鼠，并且存在明顯的尿酸性腎病的特征，腎間質和腎小管有大量尿酸鹽結晶沉積，腎臟結構異常，存在明顯腎盂積水、鮑曼氏囊和腎小管擴張、腎間質纖維化和大量炎性細胞浸潤。未經(jīng)治療的Uox基因敲除小鼠血尿酸持續(xù)處于高水平，隨著時間的延長，腎功能損害加重；而經(jīng)非布司他治療4周后的Uox基因敲除小鼠，血尿酸、血肌酐水平顯著改善，腎臟尿酸鹽晶體沉積明顯減少，表明降尿酸治療不僅可以有效降低Uox基因敲除小鼠血尿酸水平，并可進一步緩解其腎功能損傷，減少腎臟沉積的尿酸鹽晶體。以上結果支持尿酸性腎病小鼠模型構建成功。

目前，國內(nèi)外尿酸性腎病的造模方式主要有兩種：藥物誘導和基因修飾。傳統(tǒng)的尿酸性腎病模型多采用藥物誘導方式[13]，但藥物誘導的小鼠模型存在藥物劑量不準確、血尿酸水平波動大、腎臟損傷輕重不一、有的藥物本身就具有腎毒性等缺點，不適宜進行長期實驗。WU等[14]構建了第一個Uox基因定點突變的小鼠模型，但該突變小鼠血尿酸水平極高，約為野生型小鼠的10倍，腎臟損害嚴重，嚴重的HUA和腎病導致半數(shù)以上的小鼠存活期不超過4周，因此無法實施長期的實驗。此外，PREITNER等[15-16]構建了肝臟特異性Glut9基因敲除的小鼠模型，但此小鼠血尿酸輕度升高，明顯低于人類病理水平，補充肌酐后使血尿酸升高，腎臟表現(xiàn)出尿酸鹽結晶沉積、炎癥和間質纖維化，但額外干預會干擾尿酸本身的作用，影響對其機制的研究。而本研究應用的Uox基因敲除小鼠，不僅與人類尿酸性腎病發(fā)病機制更接近，而且成模時間短、高尿酸水平穩(wěn)定、尿酸性腎病表型典型，是更為理想的尿酸性腎病模型。

既往普遍認為尿酸性腎病的發(fā)病機制主要是由于尿酸鹽沉積于腎臟的直接作用[17]，但現(xiàn)在越來越多的臨床前數(shù)據(jù)表明，尿酸還可通過多種非晶體機制誘發(fā)尿酸性腎病[18-19]。研究表明，尿酸除了可以直接刺激血管平滑肌細胞增殖外，還可以激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)和血管緊張素Ⅱ/環(huán)氧酶2/血栓素A2通路，引起腎小球入球小動脈管腔狹窄、腎小球及球后循環(huán)缺血[20-21]。此外，尿酸可通過降低致密斑一氧化氮合酶的表達，減少一氧化氮的合成，從而導致內(nèi)皮細胞的功能異常，進一步加重尿酸性腎病[22]。長期的HUA可刺激血管內(nèi)皮細胞等合成活性氧，進而引起DNA的損傷、酶的氧化和失活、炎性細胞因子的產(chǎn)生和細胞凋亡[23-25]。另有研究證實，輕度HUA即可造成腎損害和腎功能障礙，其機制可能與促炎途徑有關[26]。腎小管間質纖維化是尿酸性腎病的典型特征，尿酸主要通過激活腫瘤壞死因子-β/Smad3、表皮生長因子受體和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2通路促進腎臟纖維化[27]，內(nèi)質網(wǎng)應激也與腎臟纖維化密切相關[28-29]?？傊?，尿酸可以通過直接和間接作用導致尿酸性腎病，而穩(wěn)定可靠的動物模型是其進一步研究的前提。

綜上所述，該Uox基因敲除小鼠表型可作為尿酸性腎病的應用模型，為日后尿酸性腎病的深入研究奠定基礎。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL-25983)。所有實驗過程均遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》的條例進行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL25983), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of The People’s Republic of China on the Administration of Experimental Animals.

作者貢獻：路杰、李長貴參與了研究設計；胡淑慧、路杰參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byLUJieandLIChanggui. The manuscript was drafted and revised byHUShuhuiandLUJie. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.