慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)乙型腦炎病毒感染的抑制作用

馮曉娟，鄭倩，馮亞嵐，黃榮，楊健，袁磊

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，1.機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，2.病原生物學(xué)教研室，四川 南充 637000)

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一種經(jīng)蚊蟲(chóng)叮咬傳播的人獸共患病，可導(dǎo)致人中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷[1]。JEV主要流行于亞洲地區(qū)，全球每年報(bào)告67 900例臨床病例，其中約75%發(fā)生于0～14歲的兒童，病死亡率20%～30%，約有50%的治愈者會(huì)留下持續(xù)性后遺癥[2]。目前尚無(wú)特異性療法，只能對(duì)癥治療。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的使靶mRNA發(fā)生特異性降解，以阻斷翻譯，即轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，在高等生物基因表達(dá)調(diào)控和抵御病原體過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。目前人工合成的siRNA可以直接轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中介導(dǎo)RNAi，但時(shí)效較短。使用含有短發(fā)夾RNA (shRNA)表達(dá)盒的質(zhì)?；虿《据d體在細(xì)胞中生成siRNA，可以顯著提高RNAi的效率和持續(xù)性。慢病毒對(duì)多種細(xì)胞有較強(qiáng)親和力與低毒性，是目前較為理想的RNAi傳導(dǎo)工具[4]。RNAi分子治療有可能成為一種新的抗病毒策略。多項(xiàng)研究[5-7]表明，運(yùn)用RNAi可以有效抑制蜱傳腦炎病毒、登革熱病毒和丙型肝炎病毒等黃病毒在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的增殖。本研究以同為黃病毒屬的JEV為對(duì)象，選取4個(gè)病毒基因作為靶點(diǎn)，使用慢病毒載體分別在BHK21細(xì)胞和小鼠體內(nèi)介導(dǎo)RNAi，研究其抗病毒效果，為探索RNAi用于抗病毒治療的可能性及潛在靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK21)購(gòu)自美國(guó)ATCC保藏中心，由川北醫(yī)學(xué)院病原中心實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃ 5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。JEV毒株SCYA201201(基因組序列，GenBank登錄號(hào)為KU508409)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供，于川北醫(yī)學(xué)院病原中心實(shí)驗(yàn)室保存，熒光定量PCR預(yù)混液購(gòu)至寶生物工程有限公司?？笿EV E蛋白鼠源單克隆抗體，熒光素Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG多克隆抗體購(gòu)至Abcam生物技術(shù)有限公司。清潔級(jí)昆明雌鼠與昆明乳鼠由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列設(shè)計(jì)與重組慢病毒的構(gòu)建 通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外23株具代表性的JEV毒株，進(jìn)行全基因組序列比對(duì)，選定JEV的C、NS3、NS4A與NS5基因?yàn)榘悬c(diǎn)。運(yùn)用線設(shè)計(jì)軟件DSIR(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)，設(shè)計(jì)出4條shRNA序列并合成。見(jiàn)表1。將shRNA序列與載體pGLVU6/RFP連接構(gòu)建重組載體，并將重組載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入人腎上皮細(xì)胞(293T)包裝出攜帶shRNA序列的重組慢病毒，滴度>108TU/mL，此步驟由上海吉瑪基因科技有限公司完成。陰性對(duì)照慢病毒LV-NC購(gòu)自上海吉瑪基因。

表1 靶基因與shRNA序列

1.2.2 慢病毒感染 待BHK21細(xì)胞在6孔板中鋪滿70%，用PBS洗滌兩次后，將重組慢病毒按感染復(fù)數(shù)MOI=10接種細(xì)胞，每孔加入2 mL含10% FBS和5 μg/mL polybrene的DMEM培養(yǎng)液。置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h后，用熒光顯微鏡觀察紅色熒光。

1.2.3 抑制JEV感染細(xì)胞 分別在感染重組慢病毒48 h、96 h后，按照感染復(fù)數(shù)MOI=0.1接種乙腦病毒SCYA201201株。病毒吸附1.5 h后，棄上清，每孔加入2 mL DMEM維持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)72 h后，收毒做熒光定量RT-PCR與病毒滴度檢測(cè)。另設(shè)實(shí)驗(yàn)組，接種JEV 48 h后，做間接免疫熒光檢測(cè)。設(shè)陰性慢病毒LV-NC對(duì)照組、無(wú)慢病毒JEV攻毒組(Non-RNAi)與空白對(duì)照組(Mock)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 待接種JEV 72 h后，收集細(xì)胞與上清，反復(fù)凍融3次，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用25 μL熒光定量PCR體系：2 μL cDNA模板、12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTMII、8.5 μL ddH2O、上游和下游引物各1 μL。定量PCR結(jié)果采用相對(duì)定量計(jì)算方法：以JEV E基因作為目標(biāo)基因，BHK21細(xì)胞的GAPDH基因作為內(nèi)參基因，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算JEV RNA的相對(duì)含量。見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.5 病毒滴度檢測(cè) 待接種JEV 72 h后，反復(fù)凍融3次后，離心收集上清，作10倍梯度稀釋后，加入鋪滿BHK21細(xì)胞的6孔板中，500 μL/孔。病毒吸附1.5 h后,棄上清，每孔加入2 mL含1%甲基纖維素的DMEM維持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)5 d。去上清，用含2%甲醛的結(jié)晶紫染液染色15 min后，做蝕斑計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒滴度。

1.2.6 間接免疫熒光檢測(cè) 待接種JEV 48 h后，用PBS洗滌3次，依次進(jìn)行固定、通透及封閉。加入500倍稀釋的JEV E蛋白鼠源單克隆抗體，4 ℃孵育12 h。棄一抗，洗滌3次后，加入1 000倍稀釋的熒光二抗，避光室溫孵育45 min。避光洗滌3次后，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光。

1.2.7 抑制JEV感染小鼠 (1)抑制乳鼠腦內(nèi)的JEV增殖：將7 d齡乳鼠分為7組，每組5只。分別在攻毒前3 d和1 d，顱內(nèi)注射2.5×105TU重組慢病毒。按5×LD50的劑量攻毒，顱內(nèi)注射JEV SCYA201201株(LD50=1.02 log10 PFU)，5 d后處死，取腦組織制成10%組織懸液,反復(fù)凍融3次，離心收集上清，用0.22 μM濾膜過(guò)濾后，測(cè)定病毒滴度。(2)攻毒保護(hù)試驗(yàn)：將3周齡雌性昆明鼠分為7組，每組10只。分別在攻毒前3 d和1 d，顱內(nèi)注射5×105TU重組慢病毒。按50×LD50的劑量攻毒，顱內(nèi)注射JEV SCYA201201株(LD50=1.87 log10 PFU)，連續(xù)觀察21 d，記錄發(fā)病與死亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒的構(gòu)建與感染效率

感染重組慢病毒48～96 h后，6孔板中絕大多數(shù)細(xì)胞均呈現(xiàn)紅色熒光，且各組間熒光強(qiáng)度與數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。慢病毒感染組與空白對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)和增殖數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明各重組慢病毒均能高效感染BHK21細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)細(xì)胞中JEV增殖的抑制效果

熒光定量PCR結(jié)果顯示，在48 h組中，相較于LV-NC(JEV RNA載量相對(duì)值=1)，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5分別使細(xì)胞中的JEV RNA載量降低89.7%、87.7%、74.6%和72.4%。96 h組與48 h相比，對(duì)JEV的抑制效果略有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，證明重組慢病毒LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5均能顯著抑制JEV在BHK21細(xì)胞中的增殖，且具有一定持續(xù)性，其中LV-C和LV-NS3的抑制效果強(qiáng)于LV-NS4A和LV-NS5(P<0.05)。病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)顯示，在48 h組中，相較于LV-NC對(duì)照組(107.51PFU/mL)，LV-C(104.43PFU/mL)、LV-NS3(104.79PFU/mL)、LV-NS4A(105.42PFU/mL)和LV-NS5(105.33PFU/mL)均使細(xì)胞中的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C與LV-NS3使病毒滴度分別降低了約1 200倍與525倍，96 h組的降低程度與48 h組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)，證明重組慢病毒能顯著且持續(xù)抑制JEV在BHK21細(xì)胞中的增殖。間接免疫熒光檢測(cè)顯示，在熒光顯微鏡下，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5組的綠色熒光數(shù)量少于LV-NC對(duì)照組(P<0.05)，空白對(duì)照組無(wú)熒光出現(xiàn)，證明重組慢病毒顯著抑制了細(xì)胞中的JEV增殖。見(jiàn)圖2-圖4。

2.3 對(duì)乳鼠腦內(nèi)JEV增殖的抑制效果

乳鼠腦組織懸液中的病毒滴度檢測(cè)顯示，相較于LV-NC對(duì)照組(108.21PFU/mL)，LV-C(104.96PFU/mL)、LV-NS3(105.29PFU/mL)、LV-NS4A(105.82PFU/mL)和LV-NS5(105.68PFU/mL)均使乳鼠腦內(nèi)的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C使病毒滴度降低了約1 700倍，證明重組慢病毒能顯著抑制JEV在乳鼠腦內(nèi)的增殖。見(jiàn)圖5。

2.4 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)

3周齡小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A與LV-NS5組的存活率分別為70%、50%、60%、50%。LV-NC對(duì)照組全部死亡，空白對(duì)照組全部存活，證明重組慢病毒對(duì)3周齡小鼠具有較好保護(hù)作用。見(jiàn)圖6。

3 討論

JEV的基因組為單股正鏈RNA，其基因組即是復(fù)制模板，也行使mRNA功能。因此RNAi能同時(shí)抑制JEV基因組的復(fù)制和病毒蛋白的合成，具有機(jī)制上的優(yōu)勢(shì)。C基因具有較高的保守性，編碼的C蛋白主要參與病毒的包裝與核衣殼的形成[8]。NS3蛋白是具有絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的多功能蛋白，參與病毒蛋白的剪切與RNA復(fù)制。JEV復(fù)制時(shí)，細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上會(huì)形成病毒RNA復(fù)制復(fù)合體，NS3蛋白和病毒RNA聚合酶NS5蛋白，作為復(fù)合體的核心組分，在JEV復(fù)制周期中起關(guān)鍵作用[9]。NS4A蛋白是NS3發(fā)揮蛋白酶活性的輔助因子，其還能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來(lái)促進(jìn)病毒增殖[10-11]。

有研究[12-13]表明，靶向JEV的C、E和NS5基因的RNAi可有效抑制病毒感染細(xì)胞和小鼠，其中靶向E基因的RNAi表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗病毒效果。為了探索新的抗病毒RNAi靶點(diǎn)及更系統(tǒng)地評(píng)估RNAi對(duì)JEV的抑制作用，本次選取C、NS3、NS4A與NS5基因，設(shè)計(jì)新的RNAi位點(diǎn)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，4個(gè)RNAi組均能明顯抑制JEV對(duì)細(xì)胞和小鼠的感染(P<0.05)。其中LV-C組表現(xiàn)出最佳的抗病毒效果，使細(xì)胞中的病毒滴度降低約1 200倍，對(duì)3周齡小鼠的保護(hù)率達(dá)到70%。本研究分別在慢病毒感染細(xì)胞48 h和96 h后進(jìn)行JEV接毒，結(jié)果顯示96 h組與48 h組相比，抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，仍保持高抗病毒活性。與之前采用質(zhì)粒載體的研究相比[14]，其抗病毒的持續(xù)性有明顯提升。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，慢病毒沒(méi)有出現(xiàn)致毒性，但觀察期僅為21 d，因此要對(duì)安全性做出準(zhǔn)確判斷，還需更長(zhǎng)期系統(tǒng)的研究。目前脫靶效應(yīng)是RNAi技術(shù)面臨的一個(gè)主要問(wèn)題。為降低脫靶效應(yīng)，可針對(duì)靶基因采用多位點(diǎn)聯(lián)合沉默的方式來(lái)降低脫靶率[15]。因此本研究認(rèn)為針對(duì)JEV多基因位點(diǎn)的聯(lián)合RNAi可能會(huì)具有更佳的抗病毒效果，這有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，以JEV的C、NS3、NS4A與NS5基因?yàn)榘悬c(diǎn)，由慢病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)病毒感染細(xì)胞和小鼠有顯著抑制作用，其中靶向C基因的RNAi的抗病毒效果最強(qiáng)，其可能成為一種感染前的預(yù)防性治療手段。由于本研究均在JEV感染前進(jìn)行RNAi，因此其感染后的抗病毒效果還有待進(jìn)一步研究。