礦化膠原膜浸提液對MG-63人骨肉瘤細(xì)胞分化 相關(guān)基因表達(dá)的影響

韓 雪 趙海丹 王 辰 李大偉 劉 振 許亦權(quán)

（中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心口腔科，*骨科，北京 100091）

復(fù)合納米羥基磷灰石的新型礦化膠原膜是一種無免疫原性的可吸收的膠原膜，由致密層和疏松層組成，疏松層的主要成分是羥基磷灰石和I型膠原蛋白，模擬天然骨成分，具有良好的成骨誘導(dǎo)活性。與進(jìn)口的Bio-gide膜相比較，成本降低，前期工作也證實(shí)其具有良好的體外細(xì)胞相容性。MG-63人骨肉瘤細(xì)胞系廣泛用于材料的體外生物相容性評價(jià)和機(jī)理研究，在增殖和分化期都表達(dá)成骨相關(guān)基因。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、I型 膠 原（Collagen Type I，COL I）、骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）、骨鈣素（Osteocalcin，OC）和其他因子在不同分化階段將被上調(diào)或下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)生物醫(yī)用材料的組成、結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)條件也會改變成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。因此可以通過ALP、COL I、OPG和OC等骨分化相關(guān)基因的表達(dá)來評估細(xì)胞的分化能力。

市售膠原膜（Bio-gide）是臨床中常用的比較成熟的引導(dǎo)骨再生膜材料，本研究以Bio-gide膜作為對照材料，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）測定并分析成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，來評估新型礦化膠原膜是否具有促進(jìn)人成骨樣MG-63細(xì)胞的成骨相關(guān)功能，為引導(dǎo)骨再生膜材料的臨床選擇提供可能的理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑

1.1.1

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 MG-63人骨肉瘤細(xì)胞（簡稱：MG-63細(xì)胞）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2

主要試劑和設(shè)備 礦化膠原膜（奧精醫(yī)藥科技有限公司，北京）；Bio- gide 膜 （Geistlich Pharma AG，瑞士）；MEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、雙抗（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京）；RNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega公司，美 國），RNasin（Thermo公 司，美 國），SYBR Green 熒光定量 PCR試劑盒（TOYOBO，日本）；倒置相差顯微鏡 （Leica公司，美國）；CO細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO，日本）；超凈工作臺（東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，北京）；離心機(jī)（Thermo，美國），PCR儀（Applied Biosystems，美國）；熒光定量PCR儀（BIO-RAD，美國）；平底6孔板（Corning公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1

浸提液的制備 參照 ISO10993-5：2009醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5部分 細(xì)胞毒性試驗(yàn)體外法，將Bio-gide生物膜和礦化膠原膜按6 cm/ mL的比例置于含10%FBS的MEM培養(yǎng)液中，在37℃培養(yǎng)箱中浸提24 h，浸提后0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)分3組：空白對照組（10%FBS的MEM培養(yǎng)液）、同類產(chǎn)品對照組（Bio-gide膜）及礦化膠原膜組。

1.2.2

細(xì)胞培養(yǎng) MG-63細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含有10%FBS的MEM培養(yǎng)液，置于 CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞長滿80% ～ 85%時(shí)，按1∶3傳代到新的培養(yǎng)板中。取對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞，以2×10的密度接種在培養(yǎng)板中，24 h 后更換為不同材料浸提液，并設(shè)置不加材料浸提液的空白對照組，每3天換液，培養(yǎng)7 d、14 d后收集細(xì)胞。

1.2.3

總RNA提取 按照試劑說明，利用細(xì)胞 RNA提取試劑提取細(xì)胞總 RNA。將得到的RNA用RNase-Free Water溶解， 取少量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，130 V，15 min。利用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.4

cDNA的合成 取1 μgRNA加入2 μl oligo dT、2 μl dNTP，利 用RNase-free ddHO補(bǔ) 齊14.5 μl，70℃水浴5 min，冰浴2 min后加入4 μl 5×反應(yīng)緩沖液、0.5 μl RNase抑制劑及1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶， 42℃孵育50 min；72℃孵育5 min。

1.2.5

Real-time PCR 參照Genbank cDNA序列設(shè)計(jì)ALP、COL I、OPG、OC引物序列， 合成引物，具體引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系如下：10 μlSYBR green Kit Master Mix（2×）、 0.5 μl上、下游引物 （ 10 μM） 、 1 μl cDNA，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μl。 PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 min，95℃ 10 s、 60℃ 10 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。將內(nèi)參GAPDH表達(dá)量做為基線，計(jì)算各組mRNA的相對表達(dá)量。

表1 mRNA的引物序列

基因名稱 引物序列（5’—3’）ALP ATCGCCTACCAGCTCATG GTTCAGCTCGTACTGCATGTC COL I ATGTCTAGGGTCTAGACATGTTCA CCTTGCCGTTGTCGCAGACG OPG GGGGACCACAATGAACAAGTTG AGCTTGCACCACTCCAAATCC OC CTCACACTCCTCGCCCTATT GGTCAGCCAACTCGTCCAG GAPDH TGACATCAAGAAGGTGGTGA TCCACCACCCTGTTGCTGTA

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，

P

＜0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過 RT-PCR 法檢測 3 組MG-63細(xì)胞的ALP、 COL-Ⅰ、OPG和OC mRNA （messenger ribonucleic acid）相對表達(dá)量，結(jié)果得出，在ALP、OPG基因相對表達(dá)量檢測中，3 組成骨細(xì)胞的基因表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）（圖1，圖2）；在COL I與OC基因相對表達(dá)量檢測中，14天時(shí)Bio-gide組和礦化膠原膜組表達(dá)明顯上調(diào)，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），而礦化膠原膜組與Bio-gide組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）（圖3、圖4）。

圖1 MG-63細(xì)胞經(jīng)各組培養(yǎng)基培養(yǎng)第7天、第14天后ALP表達(dá)的相對值

圖2 MG-63細(xì)胞經(jīng)各組培養(yǎng)基培養(yǎng)第7天、第14天后COL I表達(dá)的相對值

圖3 MG-63細(xì)胞經(jīng)各組培養(yǎng)基培養(yǎng)第7天、第14天后OPG表達(dá)的相對值

圖4 MG-63細(xì)胞經(jīng)各組培養(yǎng)基培養(yǎng)第7天、第14天后OC表達(dá)的相對值

3 討論

原代成骨細(xì)胞雖然適用于體外細(xì)胞學(xué)研究的各個(gè)方面，但因?yàn)椴荒芡耆刂萍?xì)胞供體的納入標(biāo)準(zhǔn)，分離得到的成骨細(xì)胞表型在一定程度上會受到受體相關(guān)因素的影響，難以做到對供體年齡、性別和取材位置標(biāo)準(zhǔn)化的控制。MG63成骨樣細(xì)胞與人原代成骨細(xì)胞的分化相關(guān)特征性蛋白的種類高度相似，取材方便，不受倫理問題的約束，通常被用作替代人原代成骨細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞模型，廣泛用于評估生物醫(yī)用材料的體外細(xì)胞學(xué)研究。

本實(shí)驗(yàn)選用的礦化膠原膜為雙層膜，疏松層以膠原分子為模板，引導(dǎo)鈣離子、磷離子在特定位點(diǎn)形成羥基磷灰石晶核，并使膠原纖維之間和表面形成周期性有序排列的羥基磷灰石晶體，從而微觀呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑 50 ～ 500 μm，孔隙率＞70%，這種類似天然松質(zhì)骨的化學(xué)成分和微觀結(jié)構(gòu)，為成骨細(xì)胞的活動提供良好的微環(huán)境和支架作用，促進(jìn)新骨形成；致密層為Ⅰ型膠原，發(fā)揮屏蔽作用。

MG-63細(xì)胞可作為良好的分化和礦化模型，堿性磷酸酶（ALP）、I型膠原（COL I）、骨保護(hù)素（OPG）和骨鈣素（OC）在MG63細(xì)胞不同的分化過程中有所表達(dá)。為研究各組材料對MG-63細(xì)胞成骨分化的影響，我們測定了ALP、COL I、OPG、OC等成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)情況。本研究將MG-63細(xì)胞與礦化膠原膜和Bio-gide生物膜浸提液共培養(yǎng)，利用熒光定量RT-PCR方法檢測兩種材料浸提液中MG-63細(xì)胞骨分化相關(guān)的基因表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者比較無顯著性差異，但在14d時(shí)，兩組細(xì)胞中COL-I和OC mRNA的表達(dá)量高于對照組，說明新型礦化膜和Bio-gide膜的浸提液可上調(diào)COL I和OC mRNA的表達(dá)水平，說明這2種膜材料本身在成骨方面所具有的生物活性，在一定程度上可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化功能，同時(shí)也證明礦化膠原膜的生物活性與Biogide生物膜相似。COL I和OC由成骨細(xì)胞分泌，是成骨細(xì)胞在骨基質(zhì)形成過程中重要的基因產(chǎn)物，其分泌異常將直接影響骨基質(zhì)的形成。其原因可能與兩種膜材料可釋放某種生物活性肽，而細(xì)胞膜表面有豐富的膜受體參與傳導(dǎo)生化信號，可與生物活性肽結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的分化水平，從而對成骨產(chǎn)生促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR檢測成骨分化相關(guān)基因（ALP、 COL-I、OPG和OC mRNA）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)礦化膠原膜可促進(jìn)成骨細(xì)胞骨向分化相關(guān)基因COL-I mRNA和OC mRNA的表達(dá)，這些基因可能參與新骨形成，在蛋白質(zhì)水平的影響還需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。礦化膠原膜為實(shí)現(xiàn)組織引導(dǎo)再生膠原膜材料的國產(chǎn)化提供了一種新型材料，值得進(jìn)一步的深入研究探索。