多環(huán)芳烴污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展

呂瑩，胡學(xué)武，陳素素，劉興宇，陳勃偉，張明江

（1 有研科技集團(tuán)有限公司生物冶金國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 101407；2 北京科技大學(xué)冶金與生態(tài)工程學(xué)院，北京 100083；3 有研資源環(huán)境技術(shù)研究院(北京)有限公司，北京 101407；4 北京有色金屬研究總院，北京 100088；5 有研工程技術(shù)研究院有限公司，北京 101407）

多環(huán)芳烴（PAHs）是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)以稠環(huán)排列方式組成，在環(huán)境中普遍存在的一類有毒化合物，具有致癌、致畸、致突變的特征。目前，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）已將萘、苊、苊烯、菲等16 種PAHs 列為環(huán)境優(yōu)先污染物（圖1），我國(guó)也將其列入優(yōu)先控制的68 種污染物之中。并且，由于密度小、附著力強(qiáng)等原因，PAHs 進(jìn)入土壤時(shí)易與土壤形成結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的團(tuán)聚體，從而影響土壤成分、通透性、孔隙結(jié)構(gòu)及水分遷移，影響植物生長(zhǎng)。土壤中的生物也會(huì)因?yàn)镻AHs的毒性作用及土壤含氧量降低等因素，最終生物活性降低甚至死亡。進(jìn)入深層土壤的PAHs 因其“三致”（致癌、致畸、致突變）特性，對(duì)水中的各種生物都會(huì)造成很強(qiáng)的毒害作用，同時(shí)此類污染物還會(huì)通過(guò)生物鏈轉(zhuǎn)移到人體，影響人的肺部、腸道和腎臟等器官，長(zhǎng)時(shí)間接觸此類污染物將會(huì)對(duì)人的身體造成不可逆轉(zhuǎn)的致命傷害。

圖1 EPA優(yōu)先污染物清單上的16種多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)和命名[2]

20多年來(lái)，人們一直致力于將PAHs從污染土壤中去除或降解到其本底水平，從而衍生出一系列解決PAHs污染土壤的修復(fù)方法。按照修復(fù)方式的差異，PAHs 污染土壤的修復(fù)技術(shù)可分為物理修復(fù)技術(shù)、化學(xué)修復(fù)技術(shù)及生物修復(fù)技術(shù)。其中，物理修復(fù)技術(shù)主要包括加熱、超臨界萃取和蒸汽抽提等，該類修復(fù)技術(shù)成本較高，對(duì)目標(biāo)污染物也只是完成了相轉(zhuǎn)移，并未真正將其從環(huán)境中去除?；瘜W(xué)修復(fù)技術(shù)主要有化學(xué)氧化、光催化氧化、電化學(xué)、聲化學(xué)和機(jī)械化學(xué)技術(shù)等，雖然相對(duì)其他技術(shù)效果更理想，但在實(shí)際修復(fù)中存在氧化劑需求量大、能源消耗大、可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染等問(wèn)題。

生物修復(fù)又因修復(fù)作用的主體不同，進(jìn)而可分為植物修復(fù)技術(shù)、動(dòng)物修復(fù)技術(shù)、微生物修復(fù)技術(shù)及其聯(lián)合修復(fù)技術(shù)。其中，PAHs 污染土壤的微生物修復(fù)是一種得到廣泛認(rèn)可的處理技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)PAHs 類污染物的完全降解或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為毒性相對(duì)較低的化合物，而不是簡(jiǎn)單地將其轉(zhuǎn)移到另一種介質(zhì)中，同時(shí)具有成本低、環(huán)境擾動(dòng)小、無(wú)二次污染、可就地處理等優(yōu)點(diǎn)，是人們公認(rèn)的一種利用微生物降解、同化、代謝或解毒有機(jī)污染的低成本、高效技術(shù)。本文重點(diǎn)講述了國(guó)內(nèi)外PAHs 污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)研究現(xiàn)狀及其原理，這些進(jìn)展有助于系統(tǒng)了解土壤中PAHs的生物降解過(guò)程、微生物作用機(jī)理和相互作用機(jī)制，為進(jìn)一步利用微生物促進(jìn)環(huán)境生物修復(fù)提供理論依據(jù)。根據(jù)目前已取得的研究進(jìn)展，提出了該技術(shù)仍存在的挑戰(zhàn)，最終對(duì)未來(lái)PAHs污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)研究方向進(jìn)行了展望，旨在為我國(guó)PAHs污染土壤的治理提供參考。

1 土壤中PAHs污染的污染特征

1.1 PAHs污染來(lái)源

土壤中PAHs 的來(lái)源主要包括天然來(lái)源和人為活動(dòng)。天然來(lái)源包括沉積物成巖過(guò)程、化石燃料自然消耗等地質(zhì)活動(dòng)，以及細(xì)菌、藻類、植物代謝的生物合成過(guò)程。人為活動(dòng)是環(huán)境中PAHs的主要來(lái)源，包括汽車(chē)尾氣的排放、高溫?zé)峤猓ǜ鞣N礦物燃料、木材、紙以及其他含碳?xì)浠衔锏牟煌耆紵蛟谶€原條件下進(jìn)行的熱解反應(yīng)）、工廠排氣等，這些不可避免的經(jīng)濟(jì)社會(huì)活動(dòng)源源不斷地向環(huán)境中輸送著PAHs 污染。之后，這些PAHs 在大氣、水、土壤環(huán)境中循環(huán)污染（圖2），并通過(guò)干濕沉降、污泥農(nóng)用和污水灌溉等方式在土壤表面不斷累積。

圖2 環(huán)境中PAHs污染的來(lái)源

韓玲等在城市化背景下對(duì)珠江三角洲含PAHs濕地土壤進(jìn)行污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，發(fā)現(xiàn)化石燃料不完全燃燒（熱解）和石油排放是造成珠江三角洲地區(qū)農(nóng)村河流濕地土壤PAHs污染的主要原因，而城市河流濕地和人工濕地中的PAHs污染主要來(lái)源于煤和生物質(zhì)的不完全燃燒。Yang等系統(tǒng)地研究了上海道路網(wǎng)沿線農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴污染的分布特征及污染源分配，發(fā)現(xiàn)污染熱點(diǎn)的空間分布取決于鄰近地區(qū)的交通量和工業(yè)活動(dòng)的密集度?？梢?jiàn)，多環(huán)芳烴的污染源多種多樣，排放源或運(yùn)輸途徑的變化會(huì)影響多環(huán)芳烴的定性分布。因此，為實(shí)現(xiàn)場(chǎng)地PAHs污染的有效控制，須充分結(jié)合當(dāng)?shù)毓I(yè)情況、切實(shí)考察污染來(lái)源，從而針對(duì)性地解決場(chǎng)地污染問(wèn)題。

1.2 土壤中PAHs的環(huán)境歸趨

PAHs 在水、大氣、土壤等自然環(huán)境中廣泛存在，在Wild 和Jones的早期研究中，指出了全球約90%的PAHs 污染存在于土壤環(huán)境中。由于PAHs 的自然降解速率低，且具有低溶解性和疏水性，易被土壤顆粒吸附從而長(zhǎng)期滯留在土壤中，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成持續(xù)危害，一旦通過(guò)生物鏈進(jìn)入人體，將是危害人類健康的潛在因素。因此，PAHs 進(jìn)入土壤后發(fā)生的一系列物理化學(xué)過(guò)程，都是目前國(guó)內(nèi)外多環(huán)芳烴污染土壤的研究熱點(diǎn)之一。

圖3 描述了土壤中PAHs 隨時(shí)間變化遷移轉(zhuǎn)化的概念模型。即PAHs 在進(jìn)入土壤后，可能通過(guò)一系列的物理化學(xué)或生物過(guò)程逸出或降解，如揮發(fā)、光氧化至大氣中，與土壤有機(jī)質(zhì)結(jié)合形成生物可利用性極低的不可提取結(jié)合態(tài)物質(zhì)，通過(guò)滲濾作用進(jìn)入地下水，或被植物/微生物吸收等。其中，土壤中PAHs的歸趨行為首先取決于污染物自身理化性質(zhì)。例如，根據(jù)PAHs結(jié)構(gòu)中所含苯環(huán)數(shù)量的多少，PAHs 可分為低分子量PAHs（2～3 環(huán)PAHs）和高分子量PAHs（4～7 環(huán)PAHs），而低分子量萘、芴、菲和蒽，其毒性明顯低于4～7 環(huán)的高分子量PAHs，后者對(duì)人類具有顯著抵抗性和致癌性。所以針對(duì)不同污染物的環(huán)境歸趨行為應(yīng)采用適宜的微生物強(qiáng)化修復(fù)措施，如易降解PAHs可重點(diǎn)發(fā)展降解礦化技術(shù)，難降解PAHs更需關(guān)注固定穩(wěn)定化方法。

圖3 PAHs在土壤中隨時(shí)間遷移轉(zhuǎn)化的概念模型[13]

2 PAHs污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)

由于PAHs 在自然環(huán)境中普遍存在，且相對(duì)于土壤中其他有機(jī)物結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、水溶性更差、土壤附著能力更強(qiáng)，同時(shí)具有較強(qiáng)的“三致”效應(yīng)，嚴(yán)重威脅著土壤的生態(tài)安全和人類健康，因此對(duì)于土壤中PAHs 等持久性有機(jī)物污染的修復(fù)更具挑戰(zhàn)，已成為國(guó)內(nèi)外土壤和環(huán)境科學(xué)界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。諸多研究者投入大量精力進(jìn)行了多年的研究，形成了一系列系統(tǒng)的處理工藝。其中，微生物法修復(fù)PAHs 污染土壤是指在人為優(yōu)化的適宜條件下，利用天然存在的或人工培養(yǎng)的功能微生物（主要包括土著微生物、外源微生物和基因工程菌）修復(fù)受污染環(huán)境的技術(shù)，具體是通過(guò)促進(jìn)微生物代謝功能，從而降低有毒PAHs污染物的環(huán)境活性或?qū)⑵浣到獬蔁o(wú)毒或低毒物質(zhì)。目前，研究者已發(fā)現(xiàn)的對(duì)土壤中PAHs 具有降解效果的微生物主要有細(xì)菌、放線菌、真菌和藻類等，表1中列出了近些年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)的部分應(yīng)用于PAHs污染土壤修復(fù)的功能微生物。

表1 部分應(yīng)用于PAHs污染土壤修復(fù)的功能微生物

由于微生物在自然環(huán)境中的數(shù)量多、分布廣，因此各類微生物對(duì)于土壤中PAHs污染的降解機(jī)制也有所差異。但基本途徑卻大致相同：①PAHs 吸附至微生物細(xì)胞膜上；②PAHs 進(jìn)入微生物內(nèi)部；③PAHs 作為碳源和能源參與微生物生理反應(yīng)，通過(guò)微生物酶促反應(yīng)被降解為CO、HO 及無(wú)污染無(wú)毒物質(zhì)。然而，在實(shí)際修復(fù)過(guò)程中，僅依靠微生物自然凈化作用是非常緩慢的，通常采用生物刺激、生物強(qiáng)化或固定化微生物技術(shù)來(lái)增強(qiáng)微生物修復(fù)效果。

2.1 生物刺激

生物刺激法是指利用某些手段人為地對(duì)污染場(chǎng)地中的土著菌進(jìn)行刺激，從而促進(jìn)功能菌群快速繁殖與生長(zhǎng)。例如，通過(guò)向土壤中添加表面活性劑、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提供電子受體等方式，來(lái)促進(jìn)修復(fù)體系中功能微生物的生理代謝活動(dòng)，以便達(dá)到對(duì)土壤中PAHs 污染物進(jìn)行生物降解的一種手段。因此，在缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的處理地點(diǎn)，實(shí)施生物刺激是加快處理過(guò)程的最佳選擇。

Koshlaf等以澳大利亞新南威爾士州一處垃圾填埋場(chǎng)的PAHs污染土壤為研究對(duì)象，采用豌豆秸稈對(duì)土壤進(jìn)行生物刺激修復(fù)處理，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序分析了PAHs污染土壤的細(xì)菌群落組成和多樣性。結(jié)果表明，添加了3%秸稈的修復(fù)組對(duì)PAHs 的生物降解率相對(duì)自然衰減增強(qiáng)了66.6%。Taylor和Jones的研究表明，無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)室還是在現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)中，僅對(duì)含有煤焦油的土壤添加養(yǎng)分，都不能顯著提高煤焦油中PAHs組分的生物降解。然而，添加了易于生物降解且植物毒性低的生物柴油實(shí)驗(yàn)組中，觀察到多種PAHs的降解效率在反應(yīng)進(jìn)行至第55天后均顯著加強(qiáng)。這是因?yàn)樯锊裼偷奶砑釉黾恿薖AHs的生物降解性，從而促進(jìn)了煤焦油的溶解和分散，進(jìn)一步增強(qiáng)了PAHs組分的生物利用度，使其最后被土著微生物所降解。

生物刺激法操作簡(jiǎn)單、修復(fù)后無(wú)二次污染，因此應(yīng)用前景廣闊。局限性在于微生物菌群在不同修復(fù)場(chǎng)地的適用性問(wèn)題，因?yàn)椴煌寥拉h(huán)境不同，其中包含的土著菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等外部條件也不同。因此，為了取得更好的作用效果，需要在實(shí)際操作時(shí)選擇適合當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境的刺激手段。另外，土著菌種可能會(huì)因?yàn)橥庠喘h(huán)境的刺激，導(dǎo)致生長(zhǎng)速度較慢、代謝活性不高，這都會(huì)直接影響微生物對(duì)PAHs 的降解效果。并且針對(duì)深層污染土壤，生物刺激技術(shù)的主要挑戰(zhàn)是必須以某種方式添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使它們能夠被地下和所需深度的微生物所利用。

2.2 生物強(qiáng)化

生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)主要包括土著微生物的生物強(qiáng)化和外源微生物的生物強(qiáng)化。其中，在實(shí)際應(yīng)用中首選是利用土著菌株，因?yàn)檫@些菌株對(duì)于污染環(huán)境具有良好的耐受性和適應(yīng)性，能夠在生物修復(fù)過(guò)程中快速繁殖并盡快發(fā)揮代謝降解作用。外源微生物的生物強(qiáng)化中對(duì)于外源微生物的引入，主要是基于生物刺激法存在的關(guān)于環(huán)境適用性的局限，通過(guò)引入其他高效降解菌種提高生物降解過(guò)程中功能菌株的生物活性，進(jìn)一步提高土壤中PAHs污染物的降解效果。但由于引入的菌種屬于外來(lái)菌種，不適于自然環(huán)境衍生下存在的土著菌種，因此在接種初期，需要在環(huán)境中有相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間的適應(yīng)期，且在該過(guò)程中勢(shì)必會(huì)與接種環(huán)境中的土著菌種發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)關(guān)系。所以，為了保證理想的降解效果，需要在實(shí)際場(chǎng)地修復(fù)項(xiàng)目中接種大量的外源微生物來(lái)避免該問(wèn)題發(fā)生，甚至部分場(chǎng)地選擇通過(guò)定期噴灑菌液的方式來(lái)保證充足的接種菌群和足夠的作用周期。

土壤中天然存在著大量的PAHs 降解微生物，PAHs 污染發(fā)生時(shí)，土壤迅速地對(duì)PAHs 進(jìn)行物理吸附、生物降解等過(guò)程。然而，當(dāng)土壤的自凈能力明顯小于污染物的累積時(shí)，就會(huì)造成嚴(yán)重的土壤污染問(wèn)題。由于環(huán)境的適應(yīng)性，PAHs 長(zhǎng)期污染土壤中會(huì)自然衍生出一些對(duì)于PAHs具有耐受性的微生物，部分甚至對(duì)于PAHs具有降解性。但是，由于復(fù)雜的土壤環(huán)境中包含有各類微生物，功能降解菌很難在土壤中占據(jù)主導(dǎo)地位，這種情況下采用生物強(qiáng)化技術(shù)（添加實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的PAHs 高效降解菌）是最佳選擇。Ferraro等通過(guò)小麥秸稈厭氧消化過(guò)程富集得到兩種接種劑（i-24 和i-96），然后將這兩種具有特定功能作用的外源微生物應(yīng)用至萘、苯并[a]芘污染的土壤中，發(fā)現(xiàn)對(duì)萘的生物降解率最高可達(dá)84.7%，對(duì)苯并[a]芘的降解率為51.7%。Wang等通過(guò)在紅壤中引入水稻土成分，建立了混合土壤微生物群落。發(fā)現(xiàn)新的混合微生物菌群能夠有效降解土壤混合物中的高分子量PAHs——芘。其中，紅壤和水稻土對(duì)芘的初始去除率分別為19%和98%；而通過(guò)增加水稻土接種劑的用量，混合微生物群落對(duì)芘的去除率顯著提高，在質(zhì)量比1/1、3/7和1/9的水稻土/紅壤混合體系中，對(duì)芘的去除率分別為93%、58%和27%。

客觀來(lái)講，生物強(qiáng)化技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)在于可以深入極端環(huán)境進(jìn)行作用，即在不利于常規(guī)微生物存在和生長(zhǎng)的環(huán)境中引入特殊微生物菌群，例如PAHs 污染土壤。且由于該技術(shù)一般是將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的高效功能菌群引入污染場(chǎng)地，因此相對(duì)生物刺激法，具有更理想的降解效果。但該技術(shù)的應(yīng)用也有一定的局限性，因?yàn)橐氲奈⑸镌趯?shí)際應(yīng)用中很容易受到當(dāng)?shù)丨h(huán)境因素的影響，可能由于生長(zhǎng)增殖緩慢、生存競(jìng)爭(zhēng)、基因誘變等多種原因，最終導(dǎo)致土壤中的PAHs 污染物生物降解率不理想。因此，對(duì)于生物強(qiáng)化技術(shù)未來(lái)的發(fā)展方向更多的應(yīng)該集中于優(yōu)化生物強(qiáng)化體系使其具有普遍適用性。

2.3 固定化微生物技術(shù)

固定化微生物技術(shù)是指將特選的高效功能降解菌通過(guò)物理、化學(xué)等方法，固定在合適的載體上，使微生物大量集中并保持較高的生物量，在引入至環(huán)境中后能夠迅速繁殖從而處理大規(guī)模污染的一種微生物修復(fù)技術(shù)。由于該技術(shù)將功能降解菌固定在載體上，所以可以避免由于機(jī)械作用造成的生物體細(xì)胞、生物酶活性、生化反應(yīng)穩(wěn)定性的破壞。這就解決了上述生物刺激和生物強(qiáng)化中提到的由于環(huán)境適應(yīng)性造成的應(yīng)用限制，即功能微生物在PAHs污染土壤中受到外部環(huán)境條件波動(dòng)的影響更小，單位介質(zhì)中能夠保持理想的微生物數(shù)量進(jìn)行生物降解作用。因此，該技術(shù)能夠有效提高功能微生物的抗毒害能力，并減少修復(fù)體系中功能微生物的流失，從而增強(qiáng)污染場(chǎng)地中PAHs 的降解效果。土壤中PAHs 的固定化微生物修復(fù)機(jī)理示意圖如圖4所示。

圖4 固定化微生物技術(shù)對(duì)PAHs污染土壤的修復(fù)原理[91]

目前，研究者們已通過(guò)諸多實(shí)驗(yàn)篩選出了多種可用于固定功能微生物的載體材料，其中最受歡迎的是一類不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染、對(duì)環(huán)境友好且能夠自然降解的材料，包括花生殼粉末、活性炭、天然有機(jī)材料等。這些可生物降解載體的使用，在一定程度上解決了功能材料在土壤中的回收問(wèn)題，另一方面通過(guò)為微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)一步提高了土壤中PAHs的降解率。Wang等利用海藻酸鈣固定化J1-q 和進(jìn)行了菲和熒蒽的生物降解研究。掃描電鏡結(jié)果表明，固定化微球中存在蜂窩狀結(jié)構(gòu)和豐富的空隙，為微生物的附著和增殖提供了足夠的空間；在生物降解實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，固定化菌對(duì)菲和熒蒽的降解效率顯著高于游離菌，其中固定化內(nèi)生菌J1-q在42天后對(duì)菲和熒蒽的去除率分別為63.16%和56.94%，高于外源菌株strain 的降解率。Qiao等采用磁性懸浮生物炭凝膠珠固定化細(xì)菌菌團(tuán)去除高分子量PAHs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定化菌體對(duì)PAHs 的去除能力強(qiáng)，具有良好的可浮性和磁性，可被外加磁場(chǎng)吸附。其中，固定化細(xì)胞對(duì)芘（Pyr）、苯并芘（BaP）和茚并芘（InP）的降解率分別為89.8%、66.9%和78.2%，遠(yuǎn)高于類似研究中的生物降解率。

然而，這項(xiàng)技術(shù)也具有一定的局限性。例如，不可自然降解的修復(fù)載體在土壤中的回收問(wèn)題給環(huán)境帶來(lái)了一定的污染風(fēng)險(xiǎn)，另外成分復(fù)雜的載體材料、土壤微生物菌群以及污染物PAHs之間的相互作用，也對(duì)場(chǎng)地中PAHs污染降解機(jī)理的解析造成困難。因此，固定化微生物技術(shù)今后的研究方向應(yīng)當(dāng)集中于以下幾個(gè)方面：①繼續(xù)尋找合適的、環(huán)境友好的載體材料，載體同時(shí)具有足夠高的強(qiáng)度和惰性；②開(kāi)展有關(guān)固定化微生物載體、功能微生物群落、PAHs 污染物之間相互作用的研究；③簡(jiǎn)化固定化微生物載體制備流程、降低固定化微生物載體制備成本，促進(jìn)該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展；④結(jié)合生物遺傳手段構(gòu)建高效基因工程菌的固定化微生物技術(shù)，提高土壤中PAHs的生物降解效果。

2.4 微生物修復(fù)PAHs污染的影響因素

一般認(rèn)為，土壤中PAHs 污染物的降解過(guò)程受到微生物代謝能力、污染物特征、環(huán)境條件的共同影響。其中，微生物的代謝能力是進(jìn)行污染場(chǎng)地微生物修復(fù)的先決條件，污染物的特征主要包括PAHs 分子量、生物利用度、毒性和生物降解半衰期等，環(huán)境條件包括溫度、土壤水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、酸堿度等。

2.4.1 微生物代謝能力

微生物的新陳代謝是生物修復(fù)功能實(shí)現(xiàn)的生理基礎(chǔ)，在新陳代謝的過(guò)程中微生物通過(guò)對(duì)PAHs進(jìn)行降解或轉(zhuǎn)化，從而降低土壤中PAHs的含量或毒性。因此，微生物對(duì)環(huán)境污染物的生物適應(yīng)能力及降解潛力被認(rèn)為是評(píng)價(jià)微生物修復(fù)PAHs污染土壤可行性的先決條件。

梁雪濤等在從膜生物反應(yīng)器篩選菲降解菌的實(shí)驗(yàn)中，共分離得到了芽孢桿菌（）和鞘氨醇單胞菌（sp.）兩株功能菌。在相同的反應(yīng)條件下（接種量10%、溫度28℃、pH=7.2），發(fā)現(xiàn)在對(duì)含1.0 mg/L 的菲溶液體系進(jìn)行生物降解時(shí)，菌株鞘氨醇單胞菌（sp.）在反應(yīng)56h 后對(duì)菲的降解率為96.3%，而菌株芽孢桿菌（）在反應(yīng)進(jìn)行至第48h 時(shí)的降解率高達(dá)98.8%，更短的反應(yīng)周期獲得了更高的降解效率。即兩株菌在相同條件下具有不同的代謝能力，從而造成了不同的生物降解效果。袁林杰自北海潿洲終端處理廠SBR 池中選育出7株可培養(yǎng)的耐鹽菌株（Y2、Y3、YA、YB、NY1、NY2、NY3），用于處理該場(chǎng)地廢水處理系統(tǒng)采油廢水。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在萘、菲、蒽濃度分別為100mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基體系中，Y2、NY2、NY3對(duì)萘的降解效果最佳，降解率分別為88%、94%和87%，而其余菌株對(duì)萘的降解率均<85%；在以蒽為底物的降解實(shí)驗(yàn)中，NY1、NY2、NY3 的作用效果最理想，體系中蒽的去除率分別為83%、81%和88%；對(duì)菲降解效果最好的菌株為NY2（76%）和NY3（84%），菌株Y3 和NY1 次之，降解率為62%，其余菌株降解效果低于60%。因此，選育菌株對(duì)污染物的潛在降解效果決定了其修復(fù)能力，針對(duì)高毒性的PAHs污染場(chǎng)地的高效菌株篩選工作是目前該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

2.4.2 污染物特征

PAHs 污染物的特征也是影響微生物對(duì)其進(jìn)行代謝作用時(shí)降解效果差異的主要因素之一，因?yàn)镻AHs的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)、在土壤中的濃度和溶解性、毒性效應(yīng)等都會(huì)對(duì)微生物的可利用性產(chǎn)生直接影響。同時(shí)，生物降解半衰期也可以直接作為微生物降解效率評(píng)判的指標(biāo)之一，具有更長(zhǎng)半衰期的PAHs，其分子結(jié)構(gòu)在環(huán)境中更難因?yàn)槲⑸锏拇x活動(dòng)遭受破壞。

Bouchez 等在以萘、菲、蒽、芴、熒蒽和芘為目標(biāo)污染物的研究中，篩選分離出了6株能以這些PAHs 作為唯一的碳源和能量的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)測(cè)試中存在不止一種多PAHs污染時(shí)，微生物的代謝作用會(huì)產(chǎn)生顯著抑制，即生物降解效率與PAHs 的特異性抑制能力有關(guān)。劉帥等采用半靜水式實(shí)驗(yàn)方式，研究了苯并芘、三甲基菲、二甲基蒽、惹烯等PAHs對(duì)海洋生物蝦夷扇貝幼體的毒性效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)體系中PAHs的濃度會(huì)直接影響蝦夷扇貝的卵子受精率和幼體死亡率，其中暴露于PAHs 環(huán)境的實(shí)驗(yàn)組中，蝦夷扇貝的卵子受精率顯著低于對(duì)照組、幼體死亡率明顯高于對(duì)照組。此外，不同種類的PAHs對(duì)于蝦夷扇貝幼體的毒性效應(yīng)也有很大差異，其毒性大小順序?yàn)椋罕讲④牛救窍径谆欤救谆?。Zeneli 等研究了自然衰減、生物刺激和生物強(qiáng)化聯(lián)合生物刺激對(duì)煉油廠固體廢物中石油污染物[總石油烴（TPH）和PAHs]的去除效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低分子量PAHs在所有修復(fù)體系中都表現(xiàn)出更高的去除率，即它們更容易被生物降解，而高分子量PAHs的去除率較低，研究表明了土壤中PAHs 的降解程度與PAHs 分子中環(huán)的數(shù)量成反比。

2.4.3 環(huán)境條件

由于微生物個(gè)體較小，因此對(duì)于環(huán)境變化的敏感性較高。這也就導(dǎo)致了在以微生物作為修復(fù)動(dòng)力時(shí)對(duì)場(chǎng)地環(huán)境有較為嚴(yán)苛的要求。一般認(rèn)為，土壤中PAHs的微生物修復(fù)主要受到的環(huán)境影響因素為土壤水分、含氧量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、土壤酸堿度以及溫度等，這些條件對(duì)微生物的新陳代謝都有顯著的影響。

土壤水分含量較低時(shí)，微生物的代謝速率會(huì)顯著降低，從而減緩微生物的生長(zhǎng)繁殖和對(duì)有機(jī)物的代謝轉(zhuǎn)化；而當(dāng)土壤水分含量相對(duì)較高時(shí)，多余的水分會(huì)在土壤結(jié)構(gòu)中游離從而充滿土壤的毛細(xì)通道，阻礙外界氧氣的進(jìn)入，對(duì)微生物的生長(zhǎng)造成阻礙作用。土壤中含氧量的多少?zèng)Q定了好氧層、缺氧層和厭氧層的分布，直接影響特定區(qū)域內(nèi)微生物的種群和種類。由于充足的氧氣環(huán)境能夠有效地促進(jìn)好氧微生物加速細(xì)胞內(nèi)的各種酶促反應(yīng)，而低氧含量的環(huán)境則會(huì)抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行，因此目前研究中有關(guān)PAHs降解菌的篩選主要針對(duì)的是好氧菌。土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的多少直接決定了功能微生物對(duì)土壤中PAHs污染進(jìn)行高效修復(fù)的啟動(dòng)期時(shí)間。因?yàn)楹芯鉅I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的土壤體系，能夠迅速促進(jìn)微生物的大量生長(zhǎng)繁殖、有效刺激微生物細(xì)胞酶促反應(yīng)的進(jìn)行，從而加速微生物對(duì)有機(jī)物進(jìn)行攝取和降解。在實(shí)際應(yīng)用中，需考慮到PAHs污染土壤環(huán)境惡劣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低等問(wèn)題，在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行微生物修復(fù)時(shí)，需根據(jù)實(shí)地土壤特性進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均衡補(bǔ)充。土壤的酸堿度會(huì)顯著影響微生物的生物活性，酸堿度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物活性降低或者死亡。此外，溫度也是微生物修復(fù)過(guò)程中影響主要因素之一，直接影響微生物的生長(zhǎng)繁殖及其代謝活動(dòng)。針對(duì)環(huán)境條件對(duì)微生物修復(fù)PAHs污染土壤的影響也有諸多學(xué)者進(jìn)行了大量研究，表2中列出了部分研究結(jié)果。

表2 影響微生物修復(fù)PAHs污染土壤的環(huán)境條件

3 微生物降解PAHs的作用機(jī)制

微生物降解PAHs 的作用機(jī)制根據(jù)該過(guò)程是否需要氧氣可分為好氧降解、厭氧降解兩種。其中，在表層土壤進(jìn)行的需氧型生物降解是主要的降解途徑，依賴于雙加氧酶以及單加氧酶基因。這些基因被稱為環(huán)羥基化雙加氧酶α 亞基（RHDα），包括Ac、Ac、Ac（革蘭氏陰性菌）以及A、A（革蘭氏陽(yáng)性菌）。它們已被用作PAHs 降解細(xì)菌篩選的目標(biāo)基因，且被用于評(píng)估土壤、水和沉積物中PAHs 的降解潛力。例如，與芘（PYR） 的生物降解顯著相關(guān)，Ac與萘（NAP）和菲（PHE）的代謝相關(guān)。

細(xì)菌、真菌、藻類等微生物降解PAHs 的作用機(jī)制已有學(xué)者提出，具體代謝途徑如圖5 所示。細(xì)菌降解PAHs首先通過(guò)雙加氧酶的作用使芳香環(huán)分解形成順式二氫二醇，然后在脫氫酶的作用下，將電子轉(zhuǎn)移給NAD，同時(shí)代謝生成重要的中間產(chǎn)物鄰苯二酚。之后在脫水作用下，鄰苯二酚再通過(guò)鄰位開(kāi)環(huán)形成順，順-黏康酸，或經(jīng)過(guò)變換開(kāi)環(huán)形成2-羥基黏康半醛。真菌作用于PAHs利用的兩個(gè)主要酶基是細(xì)胞色素P-450單加氧酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。這兩種酶對(duì)于它們代謝的PAHs都是非特異性的。首先，細(xì)胞色素P-450將一個(gè)氧原子合并到PAHs分子中，形成氧化芳烴，然后自發(fā)異構(gòu)化形成酚類，之后與硫酸鹽、葡萄糖或木糖綴合，或與環(huán)氧化物酶水合形成反式二氫二醇。藻類降解PAHs的代謝途徑包含了上述兩種過(guò)程，一般來(lái)講，低環(huán)PAHs主要是采用單加氧酶系統(tǒng)進(jìn)行代謝，即藻類細(xì)胞通過(guò)單加氧酶，使一個(gè)氧原子加至苯環(huán)上形成氧化芳烴，之后進(jìn)一步發(fā)生礦化；高環(huán)PAHs則主要采用雙加氧酶系統(tǒng)進(jìn)行代謝，即藻類細(xì)胞先通過(guò)雙加氧酶的作用使苯環(huán)形成順式二氫二醇，再進(jìn)一步裂解為順,順-黏康酸或2-羥基黏康半醛。

圖5 微生物降解PAHs的作用機(jī)制

在缺氧或厭氧條件下，微生物對(duì)PAHs 的降解主要是通過(guò)利用硝酸鹽、硫酸鹽、三價(jià)鐵及高價(jià)錳等無(wú)機(jī)鹽離子或化合物作為電子受體進(jìn)行呼吸作用，從而將PAHs氧化為低分子量物質(zhì)，該過(guò)程所涉及的微生物包括光養(yǎng)細(xì)菌、發(fā)酵菌、錳還原菌、鐵還原菌、硝酸鹽還原菌、硫酸鹽還原菌以及產(chǎn)甲烷菌群等。雖然好氧和厭氧生物降解對(duì)去除土壤環(huán)境中的PAHs都有顯著的作用，但好氧機(jī)制受到更多關(guān)注。因?yàn)榕c厭氧轉(zhuǎn)化相比，好氧環(huán)境的中微生物的呼吸作用會(huì)促使對(duì)PAHs進(jìn)行更有效的的代謝降解，整體處理速度更快、降解效果更徹底。而在厭氧過(guò)程中，氧氣會(huì)通過(guò)水合作用進(jìn)入PAHs，這在熱力學(xué)上是非常不利的。因此，土壤中PAHs的需氧分解代謝在生物圈中更為普遍。

4 問(wèn)題與展望

PAHs 污染土壤的修復(fù)及治理已成為世界性的環(huán)境問(wèn)題，因此針對(duì)性地開(kāi)展PAHs污染的修復(fù)及治理方法的研究將對(duì)我國(guó)PAHs污染土壤改良、土地利用率提高、生態(tài)環(huán)境質(zhì)量改善具有重要意義，并為促進(jìn)我國(guó)土壤修復(fù)技術(shù)體系的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供重要的技術(shù)支撐。不可否認(rèn)的是，微生物修復(fù)技術(shù)是目前PAHs污染土壤治理最具應(yīng)用和發(fā)展前景的環(huán)保型修復(fù)技術(shù)。但由于微生物技術(shù)固有的限制特點(diǎn)，使得該項(xiàng)技術(shù)在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面仍存在一定的挑戰(zhàn)，現(xiàn)階段仍普遍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，限制其大規(guī)模工程應(yīng)用。

4.1 存在的挑戰(zhàn)

首先，修復(fù)過(guò)程受污染物種類和濃度的限制。微生物篩選工作中往往針對(duì)研究的目標(biāo)污染物，這就導(dǎo)致一些PAHs 降解微生物只能對(duì)特定的PAHs發(fā)揮作用，而一旦不同場(chǎng)地土壤中PAHs種類、濃度等污染物特征發(fā)生變化，則不能保證微生物菌群在修復(fù)體系中正常發(fā)揮作用。而到目前為止，許多從污染區(qū)域分離篩選出的微生物的降解實(shí)驗(yàn)，多數(shù)集中于在實(shí)驗(yàn)室中（培養(yǎng)基體系中或人工模擬土壤體系）研究單一菌或混合菌對(duì)PAHs的降解性。然而，當(dāng)應(yīng)用至實(shí)際土壤環(huán)境中時(shí)，往往發(fā)現(xiàn)對(duì)PAHs 的降解效果有限。這是因?yàn)檫@些分離出來(lái)的細(xì)菌不能完全適應(yīng)土壤環(huán)境，包括碳源、氮源、PAHs 的類型和生物有效性，以及細(xì)菌之間的競(jìng)爭(zhēng)和協(xié)同作用，諸多原因最終導(dǎo)致其降解效率較低。

微生物對(duì)PAHs 污染土壤的修復(fù)過(guò)程還受到環(huán)境條件的制約。例如，溫度、土壤含水率、營(yíng)養(yǎng)狀況、酸堿度等均會(huì)影響微生物的生物活性，從而影響降解效率。且由于環(huán)境因子是對(duì)微生物活性直接產(chǎn)生影響，因此對(duì)生物降解效果的影響很大，這也正是當(dāng)前微生物修復(fù)技術(shù)在大規(guī)模PAHs污染土壤中應(yīng)用較少的原因之一。

此外，微生物作用過(guò)程也可能會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境起到負(fù)面影響。微生物作為獨(dú)立的生命個(gè)體，在引入土壤環(huán)境中后，在適宜的條件下可能大量繁殖從而對(duì)當(dāng)?shù)厝郝浣Y(jié)構(gòu)造成影響，同時(shí)造成土壤孔隙結(jié)構(gòu)變化、含水率降低等不利結(jié)果；也可能會(huì)在代謝過(guò)程中產(chǎn)生有毒的中間代謝產(chǎn)物，這些代謝物可能會(huì)通過(guò)滲濾作用進(jìn)入地下水從而造成污染，進(jìn)一步對(duì)土壤環(huán)境中生物的生存造成影響。因此在采用微生物技術(shù)對(duì)PAHs污染土壤進(jìn)行修復(fù)時(shí)，需要避免有毒中間代謝產(chǎn)物的積累。

4.2 展望

開(kāi)發(fā)新型的綠色、可持續(xù)生物修復(fù)系統(tǒng)，以克服現(xiàn)有的土壤污染物和微生物相關(guān)技術(shù)在處理土壤PAHs 污染方面的限制是今后一段時(shí)間內(nèi)研究的難點(diǎn)。本研究在對(duì)微生物法治理PAHs污染土壤的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜合的基礎(chǔ)上，對(duì)其未來(lái)大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并提出了特定技術(shù)的適用范圍和可能存在的挑戰(zhàn)?；谏鲜鯬AHs污染土壤修復(fù)技術(shù)特點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題的詳細(xì)闡述，今后針對(duì)PAHs污染土壤修復(fù)技術(shù)的研究方向可從以下幾個(gè)方面展開(kāi)。

（1）針對(duì)PAHs 污染場(chǎng)地的污染特征，構(gòu)建混合菌群。微生物菌群的彈性、穩(wěn)定性、抗逆性和多功能等特性使其比單一菌株更能抵抗環(huán)境擾動(dòng)，因此，混合菌群的構(gòu)建將有利于解決在不同污染體系中的適應(yīng)性問(wèn)題。

（2）建立PAHs 污染環(huán)境高效降解菌的篩選、分離、馴化的方法體系，促進(jìn)微生物在PAHs污染修復(fù)中的高效利用。功能菌株的選育優(yōu)先從污染場(chǎng)地篩選，因?yàn)閺腜AHs污染的土壤中分離出的大多數(shù)降解微生物來(lái)自受污染的環(huán)境基質(zhì)，因此對(duì)場(chǎng)地中的PAHs組分顯示出優(yōu)先利用性。

（3）加強(qiáng)對(duì)微生物作用過(guò)程中間代謝產(chǎn)物及酶的研究。代謝產(chǎn)物信息對(duì)于評(píng)估轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的毒性和遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律極其重要，有關(guān)酶的研究有助于闡明參與PAHs降解的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程。

（4）運(yùn)用土壤代謝組學(xué)輔助監(jiān)測(cè)微生物作用過(guò)程，分析降解機(jī)制。將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于菌群研究，有助于識(shí)別環(huán)境波動(dòng)中的生物降解效率、微生物種群行為及相互作用。

（5）運(yùn)用現(xiàn)代生物工程技術(shù)構(gòu)建高效降解PAHs 的基因工程菌，并將多種細(xì)菌、真菌及混合菌群與物理化學(xué)修復(fù)手段靈活組合，形成聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，針對(duì)性開(kāi)展土壤多環(huán)芳烴污染的修復(fù)治理。