綠色木霉菌株發(fā)酵液及分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲活性的影響

談韞 樊航 張紫瑤 李玉平 周曉馥

摘要：為研究綠色木霉（Trichoderma viride）菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）二齡幼蟲（J2）活性的影響，采用不同濃度綠色木霉菌株發(fā)酵液（簡(jiǎn)稱發(fā)酵液）和綠色木霉分生孢子懸浮液（簡(jiǎn)稱孢子液）觸殺二齡幼蟲（J2），分別在24、36、48 h測(cè)定發(fā)酵液和孢子液對(duì)二齡幼蟲（J2）致死效果。以5%阿維菌素乳油5 000倍液和無菌水為對(duì)照，同時(shí)對(duì)幼蟲形態(tài)特征變化進(jìn)行顯微觀察，探究發(fā)酵液和孢子液觸殺二齡幼蟲（J2）的原因，并通過盆栽試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液、孢子液預(yù)防和防治南方根結(jié)線蟲的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，孢子液殺線過程主要依靠分生孢子的寄生作用，孢子寄生于幼蟲體腔和體壁，幼蟲活力隨著孢子生長而降低;發(fā)酵液殺線過程主要依靠綠色木霉真菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)。48 h內(nèi)發(fā)酵液處理和孢子液處理中幼蟲校正死亡率最高達(dá)86%和71%，均對(duì)幼蟲具有較強(qiáng)致死效果，高于阿維菌素對(duì)照（51%），發(fā)酵液殺線效果和作用時(shí)效均優(yōu)于孢子液。在盆栽試驗(yàn)中，綠色木霉發(fā)酵液和孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲的預(yù)防效果分別為60.00%和49.99%，防治效果分別為66.67%和47.62%，生防作用顯著。綠色木霉菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲的生防效果研究具有很高應(yīng)用價(jià)值，為生物防治植物根結(jié)線蟲病提供了良好的理論基礎(chǔ)和研究依據(jù)。

關(guān)鍵詞：南方根結(jié)線蟲;綠色木霉;致死效果

中圖分類號(hào)： S432.4+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）12-0114-07

收稿日期：2021-09-07

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：20190301059NY）;中央指導(dǎo)地方科技發(fā)展資金吉林省基礎(chǔ)研究專項(xiàng)（編號(hào)：202002016JC）。

作者簡(jiǎn)介：談 韞（1996—），男，甘肅蘭州人，碩士研究生，主要從事植物遺傳學(xué)研究。E-mail：554979397@qq.com。

通信作者：周曉馥，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：zhouxiaofu@ jlnu.edu.cn。

根結(jié)線蟲（Meloidogyne）是一種雜食性植物病原線蟲，被列為全球十大植物寄生線蟲之首[1]。其寄主范圍廣，致病性強(qiáng)，在二齡幼蟲（J2）時(shí)期可寄生于植物根部通過口針吸取植物根部營養(yǎng)，導(dǎo)致植物的根部形成不均等的球狀根瘤，使植物地上部吸收營養(yǎng)困難，出現(xiàn)葉片發(fā)黃、植株矮化等問題[2-3]。根結(jié)線蟲入侵造成的傷口，使土壤中其他病原物的侵入更加容易，形成復(fù)合性病害，每年對(duì)我國農(nóng)副產(chǎn)品造成大量減產(chǎn)等嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）是墊刃目（Tylenchida）異皮科（Heteroderidae）根結(jié)線蟲屬（Meloidogyne）植物寄生線蟲，是我國分布最廣的根結(jié)線蟲之一。由于根結(jié)線蟲極難防治，目前對(duì)于南方根結(jié)線蟲的防治仍以化學(xué)手段為主，因其高毒、高污染、殘留藥物難降解等特性，部分化學(xué)藥劑被禁用或限制使用[6-7]。即使是市面最常使用的生物類殺蟲劑阿維菌素乳油，雖然能有效殺死線蟲，但過多稀釋會(huì)導(dǎo)致殺線效果減退，濃度過高會(huì)對(duì)人體健康和生態(tài)壞境造成影響，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求[8-9]。隨著綠色環(huán)保的農(nóng)業(yè)發(fā)展需要，運(yùn)用安全高效的生物防治手段就愈發(fā)重要，多方生物防治技術(shù)也成為將來主要防治研究方向。

木霉屬真菌（Trichodema spp.）是絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Moniliales）叢梗孢科（Moniliales）木霉屬（Trichoderma）在自然界廣泛分布的一種生防真菌，通常存在于土壤環(huán)境和植物根系[ 10]。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌對(duì)根結(jié)線蟲具有拮抗作用，可產(chǎn)生拮抗物質(zhì)或通過寄生作用達(dá)到防治根結(jié)線蟲的效果[10-12]。綠色木霉（Trichoderma aviride）作為應(yīng)用最廣的木霉菌之一，具有促進(jìn)植物生長、使用安全、價(jià)格低廉等多種優(yōu)點(diǎn)[13-14]。目前，木霉菌在對(duì)根結(jié)線蟲的生防研究方面已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展，但綠色木霉對(duì)植物根結(jié)線蟲病的防治效果相關(guān)研究還不完善，本研究將對(duì)綠色木霉菌株發(fā)酵液及分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響進(jìn)行探究，進(jìn)一步為綠色木霉在植物根結(jié)線蟲病防治方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

綠色木霉菌株（Trichoderma viride）由吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存，南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）卵塊由農(nóng)業(yè)應(yīng)用技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，北京農(nóng)學(xué)院王紹輝教授惠贈(zèng)。

1.1.1 綠色木霉分生孢子懸浮液的制備

在培養(yǎng)7 d綠色木霉的PDA平板上中加入5 mL無菌水充分振蕩，使綠色木霉分生孢子脫落在無菌水中，即得到綠色木霉分生孢子懸浮液（簡(jiǎn)稱Tvs），采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子液的濃度（濃度為1.6×107 CFU/mL），并稀釋成1.6×106 CFU/mL;3.2×105 CFU/mL;1.6×105 CFU/mL（簡(jiǎn)稱Tvs10;Tvs50;Tvs100）3個(gè)梯度的濃度備用。

1.1.2 綠色木霉發(fā)酵液的制備

取配制好的綠色木霉孢子懸浮液2 mL加入含有100 mL PDB培養(yǎng)基250 mL三角瓶中，黑暗振蕩培養(yǎng)7 d（28 ℃，180 r/min），后采用滅菌的濾紙濾去發(fā)酵液中的菌絲團(tuán)、孢子等即得到綠色木霉發(fā)酵液（簡(jiǎn)稱：Tv），并稀釋10、50、100倍得到3個(gè)濃度（簡(jiǎn)稱：Tv10，Tv50，Tv100）放入4 ℃冰箱，保存?zhèn)溆谩DB培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值為7。

1.1.3 南方根結(jié)線蟲的活體培養(yǎng)

將番茄種子（番茄品種為常豐中蔬四號(hào)）浸泡在50 ℃溫水中3～5 h，采用1% NaClO溶液消毒，洗凈后放入裝有少量溫水的培養(yǎng)皿中（下墊1層濾紙防止種子淹死），在28 ℃培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。將露白番茄種子播種至裝有滅菌的草炭土和蛭石1 ∶1塑料缽中，待番茄發(fā)育到4～5真葉時(shí)在距離植株根部約1.5 cm處用1 mL移液器槍頭打4個(gè)約2 cm深的小孔，每孔接種1 000條南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲。

1.1.4 南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）懸浮液的制備

挑取接種南方根結(jié)線蟲植株根系的淡黃色卵塊浸泡在1% NaClO溶液中5 min，洗凈后置于滅菌的培養(yǎng)皿中，加入少量無菌水，26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，逐天收集孵化的二齡幼蟲，計(jì)數(shù)，加無菌水配制成10 000 條/mL的二齡幼蟲（J2）懸浮液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 綠色木霉發(fā)酵液和分生孢子懸浮液直接殺線作用

向滅菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入100 μL南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）懸浮液（1 000條）、不同濃度的綠色木霉孢子懸浮液和綠色木霉發(fā)酵液100 μL，同時(shí)設(shè)置加100 μL無菌水的空白對(duì)照和加100 μL 5%阿維菌素乳油5 000倍液對(duì)照，共10個(gè)樣本，3次生物學(xué)重復(fù)，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，分別在24、36、48 h采用體態(tài)法（活動(dòng)彎曲的線蟲代表存活，僵直的線蟲代表死亡）統(tǒng)計(jì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲死亡情況，并校正其死亡率。

線蟲死亡率=（死亡線蟲數(shù)/供試總線蟲數(shù)）×100%;

校正死亡率=（處理線蟲死亡率-空白對(duì)照線蟲死亡率）/（1-空白對(duì)照線蟲死亡率）×100%。

1.3 盆栽試驗(yàn)

1.3.1 綠色木霉發(fā)酵液和分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲的預(yù)防作用

將黃瓜種子（黃瓜品種為津研四號(hào)）播種在營養(yǎng)土中，待出苗后移栽至填裝無菌土的盆中，每盆無菌土2 kg，2株苗。移苗 7 d 后在黃瓜植株根系周圍施入綠色木霉發(fā)酵液（Tv）和孢子懸浮液（Tvs）15 mL，同時(shí)設(shè)置施加清水和5%阿維菌素乳油5 000倍液作為對(duì)照，共4組處理，3次生物學(xué)重復(fù)。施入綠色木霉15 d后在距離每棵黃瓜植株根部約1.5 cm處采用1 mL移液器槍頭打2個(gè)約2 cm深小孔，每孔接種1 000條南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）。接種線蟲30 d后統(tǒng)計(jì)根結(jié)數(shù)，計(jì)算根結(jié)減退率，評(píng)價(jià)發(fā)酵液和孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲的預(yù)防效果，種植期間適量補(bǔ)充水分。

1.3.2 綠色木霉發(fā)酵液和分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲的防治作用

移苗前處理同“1.3.1”節(jié)。移苗7 d后在距離每棵黃瓜植株根部約1.5 cm處采用1 mL移液器槍頭打2個(gè)約2 cm深的小孔，每孔接種1 000條南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）;接種線蟲15 d后在黃瓜植株根系周圍施入綠色木霉發(fā)酵液（Tv）和孢子懸浮液（Tvs）15 mL，同時(shí)設(shè)置施加清水和5%阿維菌素乳油5 000倍液作為對(duì)照，共4組處理，3次生物學(xué)重復(fù)。施入綠色木霉30 d后統(tǒng)計(jì)根結(jié)數(shù)，計(jì)算根結(jié)減退率，評(píng)價(jià)發(fā)酵液和孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲的防治效果，種植期間適量補(bǔ)充水分。

參考Bridge等的方法[3]對(duì)根結(jié)進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，無根結(jié)，根系健康;1級(jí)，有不明顯的小根結(jié)，且根結(jié)之間不連接，占總根系1%～10%;2級(jí)，有明顯的小根結(jié)，有些根結(jié)之間相互連接，占總根系的11%～30%;3級(jí)，有明顯的大根結(jié)，部分側(cè)根發(fā)生畸變，占總根系31%～50%;4級(jí)，主側(cè)根出現(xiàn)大量根結(jié)，部分主側(cè)根發(fā)生畸變，占總根系51%～75%;5級(jí)：根結(jié)大且密集，大部分根結(jié)相互連接，多數(shù)主測(cè)根發(fā)生畸變，占總根系76%以上。

盆栽試驗(yàn)時(shí)間：2021年5月6日至6月28日;試驗(yàn)地點(diǎn)：吉林師范大學(xué)吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

根結(jié)指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)應(yīng)根結(jié)分級(jí)）/（該處理組調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別數(shù)）×100;

預(yù)防效果（防治效果）=（對(duì)照根結(jié)指數(shù)-處理根結(jié)指數(shù)）/對(duì)照根結(jié)指數(shù)×100%;

根結(jié)減退率=（對(duì)照組根結(jié)數(shù)-處理組根結(jié)數(shù)）/對(duì)照組根結(jié)數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS 5.0軟件分析處理，鄧肯氏（Duncans）法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）在綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液中形態(tài)特征變化的分析與比較

綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液中南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）形態(tài)變化的鏡檢顯示，初期不同處理加入新孵化的幼蟲時(shí)，幼蟲活性較高，行動(dòng)不受影響。由圖1可知，0～24 h分生孢子及菌液發(fā)酵物逐漸發(fā)揮作用，部分幼蟲身體逐漸僵直、行動(dòng)遲緩、頭部口器和身體中發(fā)現(xiàn)少量孢子，身軀周圍也被少量孢子團(tuán)所包圍。與孢子液處理不同，發(fā)酵液處理組中還出現(xiàn)大量被菌絲纏繞的幼蟲，由于菌絲纏繞致使幼蟲無法脫離，限制其活動(dòng)能力。24～48 h鏡檢發(fā)現(xiàn)，孢子液處理中出現(xiàn)許多僵直死亡的幼蟲，幼蟲口器和身體內(nèi)可以清晰發(fā)現(xiàn)大量的孢子，并且軀干中部被大量孢子包圍，一些孢子寄生于幼蟲體內(nèi)和體壁上，整個(gè)蟲體還被大量孢子團(tuán)和菌絲團(tuán)所包裹，幼蟲身軀麻痹，生命力極低，一些寄生在幼蟲體內(nèi)的孢子萌發(fā)出少量菌絲穿透體壁。發(fā)酵液處理中死亡幼蟲尾部出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，軀干并無孢子寄生和纏繞，體內(nèi)流出大量孢子和器官，蟲體相對(duì)完整。接下來72 h觀察中，孢子液處理中被孢子寄生的蟲體在寄生部位發(fā)生溶解現(xiàn)象，蟲體分解成斷裂的幾部分，無法保持完整形態(tài)。

綜上，綠色木霉孢子懸浮液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）的作用主要依靠分生孢子的寄生作用，孢子從幼蟲口器進(jìn)入蟲體內(nèi)部，寄生于體腔，外部孢子寄生于幼蟲體壁，幼蟲活力隨著孢子生長而降低，蟲體最終也被溶解成分裂的幾段。相較于孢子懸浮液處理，發(fā)酵液處理組由于孢子和菌絲被濾除，孢子較少，死亡的幼蟲大多蟲體完整，寄生現(xiàn)象少，證明綠色木霉真菌在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生使二齡幼蟲（J2）致死的拮抗物質(zhì)，其作用發(fā)生過程中使幼蟲尾部溶解，從體腔內(nèi)流出組織和體液，導(dǎo)致幼蟲死亡。

2.2 綠色木霉發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

2.2.1 4 h不同濃度發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

24 h二齡幼蟲（J2）在5%阿維菌素乳油5 000倍液對(duì)照與發(fā)酵液處理中校正死亡率分別高達(dá)36.78%和58.03%，與無菌水對(duì)照相比幼蟲死亡數(shù)顯著增大（P<0.05），證明發(fā)酵液能夠?qū)τ紫x起到良好的致死效果，由表1可知，24 h殺線效果優(yōu)于阿維菌素。

2.2.2 36 h不同濃度發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

由圖2-A可知，36 h 4個(gè)濃度發(fā)酵液處理，二齡幼蟲（J2）死亡數(shù)均顯著大于無菌水處理，殺線效果顯著。幼蟲在發(fā)酵液（Tv）中校正死亡率（73.32%）顯著大于阿維菌素處理（44.84%）（P<0.05）。此時(shí)，發(fā)酵液（Tv）殺線效果遠(yuǎn)好于5%阿維菌素乳油5 000倍液。10倍稀釋液殺線效果（45.36%）和阿維菌素對(duì)照不顯著，提示在36 h，10倍稀釋液殺線效果已和阿維菌素相近，4個(gè)濃度發(fā)酵液處理幼蟲校正死亡率Tv>Tv10>Tv50>Tv100。

2.2.3 48 h不同濃度發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

由圖2-B可知，在48 h發(fā)酵液（Tv）殺線效果（86.21%）和10倍發(fā)酵液稀釋液殺線效果（73.74%）無顯著差異，提示發(fā)酵液殺線效果接近峰值。50倍和100倍稀釋液對(duì)幼蟲致死率與阿維菌素對(duì)照（50.66%）無顯著差異，二齡幼蟲（J2）校正死亡率Tv>Tv10>Tv50>CK2>Tv100，呈現(xiàn)明顯梯度關(guān)系，在0～100倍稀釋濃度范圍內(nèi)，濃度越高殺線效果越好。

綜上，由圖3-A可知，綠色木霉發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）有良好的致死作用， 校正死亡率在48 h內(nèi)最高可達(dá)86%，效果要好于阿維菌素處理的51%，不同濃度的發(fā)酵液對(duì)應(yīng)二齡幼蟲（J2）死亡率呈明顯的線性關(guān)系，在0～100倍稀釋濃度范圍內(nèi)，幼蟲死亡率隨濃度升高而上升。

2.3 綠色木霉孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

2.3.1 4 h不同濃度孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

由表2可知，24 h南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）在5%阿維菌素乳油5 000倍液對(duì)照與Tvs處理（1.6×107 CFU/mL）中校正死亡率分別為36.78%和27.98%，Tvs<CK2，阿維菌素殺線效果優(yōu)于孢子液。不同濃度孢子液處理中幼蟲死亡數(shù)與無菌水對(duì)照相比無顯著差異，提示在24 h不同濃度孢子液對(duì)幼蟲活性影響不顯著。

2.3.2 36 h不同濃度孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

由圖4-A可知，在36 h，Tvs處理（1.6×107 CFU/mL）和Tvs10處理（1.6×106 CFU/mL）的幼蟲死亡數(shù)顯著大于無菌水對(duì)照，Tvs50 和Tvs100處理（3.2×105、1.6×105 CFU/mL）的幼蟲死亡數(shù)殺線效果顯著（P<0.05），提示在36 h不同濃度孢子液開始對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性有影響。

2.3.3 48 h不同濃度孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性的影響

由4-B可知，在48 h，Tvs（1.6×107 CFU/mL）的殺線效果（70.56%）和Tvs10（1.6×107 CFU/mL）的殺線效果（70.11%）無顯著差異，顯著大于幼蟲在Tvs50（3.2×105 CFU/mL）和Tvs100（1.6×105 CFU/mL）的校正死亡率（45.09%、38.20%）（P<0.05）。幼蟲在4個(gè)濃度孢子液的校正死亡率Tvs>Tvs10>Tvs50>Tvs100，提示48 h幼蟲校正死亡率在孢子液濃度3.2×105～1.6×107 CFU/mL范圍內(nèi)呈梯度關(guān)系，孢子濃度越高殺線效果越好。孢子濃度低于3.2×105 CFU/mL時(shí)對(duì)線蟲活性影響不大。

綜上，綠色木霉分生孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）有良好的致死作用，校正死亡率在48 h內(nèi)最高可達(dá)71%，效果要好于阿維菌素處理的51%。0～24 h幼蟲活性與孢子液濃度無關(guān)，24～48 h 幼蟲死亡率在孢子濃度 3.2×105～1.6×107 CFU/mL 范圍內(nèi)呈梯度關(guān)系，隨著濃度升高，對(duì)線蟲致死率越高。

2.4 綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液觸殺南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）作用時(shí)效分析

2.4.1 發(fā)酵液觸殺南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）作用時(shí)效分析

由圖5-A可知，在0～48 h相同濃度發(fā)酵液處理下，二齡幼蟲（J2）校正死亡率隨時(shí)間增長呈明顯上升趨勢(shì)，在48 h達(dá)到各個(gè)處理最高值。0～24 h內(nèi)二齡幼蟲（J2）在綠色木霉發(fā)酵液（Tv）處理中校正死亡率增長最高，致死效果最強(qiáng);24～48 h內(nèi)校正死亡率增長平穩(wěn)上升，趨于平緩。10、50、100倍稀釋液在0～24 h 對(duì)二齡線蟲（J2）致死效率增長低于24～48 h，發(fā)酵液濃度越低在 0～48 h內(nèi)對(duì)二齡幼蟲（J2）致死效率增長越緩慢，可能是由于發(fā)酵液濃度越低導(dǎo)致對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）活性產(chǎn)生影響的拮抗物質(zhì)越少，對(duì)二齡幼蟲（J2）致死作用發(fā)揮時(shí)間越長。在 48 h 發(fā)酵液（Tv）和10倍稀釋液對(duì)二齡幼蟲（J2）活性影響無顯著差異，提示在48 h綠色木霉發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）的活性影響已接近峰值（86.21%）。

2.4.2 孢子液觸殺南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）作用時(shí)效分析

由圖5可知，在0～24 h，相同濃度孢子液處理下二齡幼蟲（J2）校正死亡率隨時(shí)間的增長呈緩慢上升趨勢(shì)，24～36 h內(nèi)二齡幼蟲（J2）在Tvs（1.6×107 CFU/mL）和Tvs10（1.6×106 CFU/mL）中校正死亡率增長最高，孢子液在此時(shí)段對(duì)幼蟲觸殺效果最好。36～48 h二齡幼蟲（J2）在Tvs10（1.6×106 CFU/mL）和Tvs（1.6×107 CFU/mL）中校正死亡率無顯著差異，且在Tvs（1.6×107 CFU/mL）中校正死亡率保持較高水平，提示48 h孢子液對(duì)二齡幼蟲（J2）觸殺效果達(dá)到頂峰（70.56%）。可能是由于綠色木霉孢子對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）寄生作用主要是發(fā)生在24～36 h，在此時(shí)段，效果最好。

2.5 綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲盆栽試驗(yàn)的預(yù)防效果

由表3可知，在盆栽預(yù)防試驗(yàn)中，清水對(duì)照處理的黃瓜植株根結(jié)大、數(shù)量多，密集分布于整個(gè)根系，根系粗糙，平均根結(jié)數(shù)為153.67個(gè)，顯著高于其他處理組，綠色木霉發(fā)酵液和孢子液處理的黃瓜植株根系潔白，較光滑，根結(jié)小且數(shù)量少，平均根結(jié)數(shù)量為30.00個(gè)和34.00個(gè)，兩者的根結(jié)指數(shù)（33.33和41.67）相較于清水對(duì)照顯著降低。發(fā)酵液和孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲的預(yù)防作用明顯，預(yù)防效果分別達(dá)60.00%和49.99%，均高于阿維菌素對(duì)照處理的45.00%，且2個(gè)處理中根結(jié)減退率分別為79.38%和77.48%，高于阿維菌素對(duì)照（66.13%），提示綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液能夠?qū)ΩY(jié)線蟲起到良好的預(yù)防作用，且效果略優(yōu)于阿維菌素。

2.6 綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲盆栽試驗(yàn)的防治效果

由表4可知，在盆栽防治試驗(yàn)中，清水對(duì)照處理的黃瓜植株根系根結(jié)大而密，遍布整個(gè)根系，占整體根系約70%，平均根結(jié)數(shù)為167.67個(gè)，顯著高于其他處理組（P<0.05），被嚴(yán)重侵染，綠色木霉發(fā)酵液處理的黃瓜植株根系光滑潔白，根結(jié)小且數(shù)量少，僅占整個(gè)根系的10%，平均根結(jié)數(shù)量為29.00個(gè)，顯著少于清水對(duì)照和阿維菌素對(duì)照（73.67）（P<0.05），根結(jié)指數(shù)為29.16，提示受線蟲侵染程度較輕。發(fā)酵液和孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲的防治作用顯著，防治效果分別達(dá)66.67%和47.62%，高于阿維菌素對(duì)照處理的38.09%，且2個(gè)處理中根結(jié)減退率分別為66.21%和60.02%，高于阿維菌素對(duì)照（54.97%），提示綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液能夠?qū)ΩY(jié)線蟲起到良好的防治作用，發(fā)酵液顯著優(yōu)于阿維菌素，而孢子液和阿維菌素防效相當(dāng)。阿維菌素防治效果偏低原因可能是稀釋倍數(shù)過大，導(dǎo)致防效不理想。

3 結(jié)論與討論

木霉屬真菌作為自然界廣泛存在具有生防作用的真菌，在農(nóng)業(yè)、植物病蟲害防治和環(huán)境治理領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景[12]。研究表明，木霉菌對(duì)根結(jié)線蟲具有多方面生防機(jī)制，Sahebani等研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌可產(chǎn)生可揮發(fā)抗生物質(zhì)從而起到生防作用[15];Sharon等發(fā)現(xiàn)，綠色木霉可產(chǎn)生拮抗物質(zhì)殺死根結(jié)線蟲[16];Mallikharjuna等和Smith等研究表明，綠色木霉通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶等細(xì)胞壁降解酶從而寄生于根結(jié)線蟲蟲卵或幼蟲體內(nèi)[17-18]。本研究中，綠色木霉菌株發(fā)酵液和孢子懸浮液均可快速高效地殺死南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2），48 h內(nèi)線蟲減退率分別達(dá)到86%和71%，進(jìn)一步證明綠色木霉菌株具有穩(wěn)定的防治效果。同時(shí)，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，綠色木霉菌株發(fā)酵液和孢子懸浮液與5%阿維菌素乳油 5 000 倍液的防治效果存在顯著差異，可能原因是阿維菌素稀釋倍數(shù)過大，導(dǎo)致對(duì)線蟲的致死效果未達(dá)到預(yù)期效果。在試驗(yàn)過程中還通過鏡檢觀察了綠色木霉分生孢子對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲（J2）的寄生作用和綠色木霉菌液發(fā)酵物對(duì)二齡幼蟲（J2）的拮抗作用，對(duì)二齡幼蟲（J2）不同時(shí)間段不同處理顯微鏡下形態(tài)特征變化進(jìn)行觀察分析，為綠色木霉對(duì)根結(jié)線蟲的寄生作用和拮抗作用提供佐證。通過綠色木霉發(fā)酵液和孢子懸浮液對(duì)南方根結(jié)線蟲的預(yù)防和防治盆栽試驗(yàn)，進(jìn)一步證明了綠色木霉在植物生長過程中對(duì)南方根結(jié)線蟲的生防作用十分顯著，綠色木霉發(fā)酵液和孢子液對(duì)南方根結(jié)線蟲的預(yù)防效果分別為60.00%和49.99%，防治效果分別為66.67%和47.62%，具有穩(wěn)定的防治效果。

綠色木霉大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用尚存在許多難題，如綠色木霉生長和繁殖受環(huán)境因素影響較大，產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)濃度較低、純化困難等。因此，利用基因工程提高綠色木霉對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性成為研究熱點(diǎn)，可為大規(guī)模應(yīng)用綠色木霉提供保障。針對(duì)綠色木霉生物功能的開發(fā)尚不全面，未來仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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