bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物抗非生物脅迫基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展

李君霞 樊永強 代書桃 秦娜 宋迎輝 朱燦燦 王春義 翁鴻燕

摘要：植物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)常會遭遇干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫的傷害，從而影響其生長發(fā)育和地理分布，對于作物而言會降低產(chǎn)量和品質(zhì)，危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展，因此植物抗逆育種研究已經(jīng)成為保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個重要內(nèi)容。利用基因工程技術(shù)提高植物的抗逆性是一條優(yōu)于傳統(tǒng)育種途徑的快捷有效的途徑。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育及抵御多種非生物脅迫反應(yīng)（干旱、高鹽、低溫、缺鐵等）中具有重要的調(diào)控作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，很多bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以提高植物的抗逆性。本文全面系統(tǒng)闡述了植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基本結(jié)構(gòu)特征及其在植物抗旱、耐鹽、耐冷、耐缺鐵基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的利用及植物抗旱遺傳改良和育種提供參考。

關(guān)鍵詞：植物;bHLH轉(zhuǎn)錄因子;抗旱;耐鹽;耐冷;耐缺鐵;基因工程

中圖分類號： S332.1;S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0001-09

收稿日期：2021-08-06

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：nycytx-CARS-06）;河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團隊項目（編號：2021KJCXTD30）;河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)性科研項目（編號：2021JCKY006）。

作者簡介：李君霞（1973—），女，河南禹州人，碩士，副研究員，主要從事雜糧遺傳育種及栽培研究。E-mail：lijunxia@126.com。

通信作者：翁鴻燕，高級農(nóng)藝師，主要從事丘陵旱地作物研究。E-mail：77069205@qq.com。

植物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)常遭遇非生物脅迫（如干旱、高鹽、低溫等），從而影響其生長發(fā)育、地理分布，甚至降低產(chǎn)量、品質(zhì)[1]。為了生存，植物在長期進(jìn)化過程中逐漸建立了復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制以應(yīng)對環(huán)境脅迫[2]。一旦遭遇非生物脅迫，植物體內(nèi)各種各樣的基因被誘導(dǎo)表達(dá)以抵御脅迫傷害。這些基因主要分為2類：調(diào)節(jié)基因和功能基因，它們的功能主要包括脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)和抗逆[1，3]。其中轉(zhuǎn)錄因子是重要調(diào)節(jié)基因，在脅迫響應(yīng)過程中調(diào)控靶基因表達(dá)以抵御逆境脅迫。目前，在抵御非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有MYB （v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）、AP2/ERF（APETALA2/ethylene response factor）、NAC [無頂端分生組織（no apical meristem，NAM）、擬南芥轉(zhuǎn)錄激活因子1（Arabidopsis transcription activation factor 1，ATAF1）、ATAF2、杯狀子葉2（cup-shaped cotyledon 2，CUC2）]、堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）、WRKY、堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）家族等[4-9]。其中，bHLH家族是植物中較大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，家族成員眾多，亞族非常豐富[10]。擬南芥（A. thaliana）中的bHLH家族成員有162個[11]，水稻（Oryza sativa）中的bHLH家族成員有167個，分為22個亞族，水稻、擬南芥中所有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為25個亞族[12];辣椒（Capsicum annuum）中的bHLH家族成員有122個，分為21個亞族[13];黃瓜（Cucumis sativus）中的bHLH家族成員有142個，分為32個亞族[14];菜豆（Phaseolus vulgaris）中的bHLH家族成員有155個，分為21個亞族[15]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及抵御干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫方面具有重要調(diào)控作用[9]。本文全面系統(tǒng)闡述了植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)及在植物抗旱、鹽、冷、缺鐵基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的利用及植物抗旱遺傳改良和育種提供參考。

1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基本結(jié)構(gòu)特征

bHLH轉(zhuǎn)錄因子因含有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域而得名[16]。bHLH結(jié)構(gòu)域由60個左右的氨基酸組成，包含2個功能不同的保守區(qū)域，分別是位于N末端的通常由13～17個氨基酸組成的堿性區(qū)、位于C末端的由近40個氨基酸組成的HLH區(qū)[17-19]。堿性區(qū)域是DNA結(jié)合域，能特異性識別靶基因啟動子區(qū)中的E-box（5′-CANNTG-3′）[20]，E-box中間的2個核苷酸可變，最常見的是回文G-box （5′-CACGTG-3′）[12]。HLH區(qū)參與同源或異源二聚體的形成，通過堿性區(qū)與DNA結(jié)合，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[21]。

2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物抗非生物脅迫基因工程中的應(yīng)用進(jìn)展

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，且不同成員對非生物脅迫逆境的反應(yīng)程度不同，有的成員能夠提高植物對干旱、高鹽、低溫、缺鐵等單一環(huán)境脅迫的抗性，有的成員可以同時提高植物對2種及以上環(huán)境脅迫的抗性，甚至提高籽粒產(chǎn)量。

2.1 單一抗性

2.1.1 抗旱 擬南芥脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子編碼基因（ABA-inducible bHLH-type transcription factor，AtAIB） 受ABA和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）誘導(dǎo)表達(dá)。敲除AtAIB基因的擬南芥植株對ABA的敏感性降低;超表達(dá)AtAIB基因的擬南芥植株對ABA的敏感性增強，且在土培干旱條件下，其存活率是野生型對照的2倍、敲除AtAIB基因植株的2.7倍，表現(xiàn)出一定的抗旱性[22]。由此可見，AtAIB可以調(diào)控ABA信號傳遞，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。AtbHLH68基因受干旱誘導(dǎo)表達(dá)，與野生型對照相比，超表達(dá)該基因的擬南芥植株生長緩慢且植株矮小，主根長顯著變短且呈淡黃色，側(cè)生根數(shù)顯著減少，ABA含量顯著增加;在干旱條件下，超表達(dá)AtbHLH68基因的植株綠葉率高，生長狀態(tài)好，抗旱性提高。分析表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)AtbHLH68基因的植株中ABA代謝基因[擬南芥醛氧化酶3基因（Arabidopsis aldehyde oxidase 3，AAO3）]、ABA相關(guān)的干旱脅迫響應(yīng)基因 [v-myc禽髓細(xì)胞瘤病病毒癌基因同源物2基因 （v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog 2，MYC2）、bHLH122基因、脫水響應(yīng)29A基因 （responsive to dehydration 29A，RD29A）]的表達(dá)量顯著提高，側(cè)根發(fā)育基因[ABA敏感3基因（ABA insentive 3，ABI3）]的表達(dá)量顯著降低[23]。說明AtbHLH68可以調(diào)控側(cè)根伸長，并通過ABA依賴途徑調(diào)控ABA信號傳遞，進(jìn)而提高植物的抗旱性。

除了從模式植物擬南芥中分離獲得可以提高植物抗旱性的bHLH基因外，研究者還陸續(xù)從胡楊（Populus euphratica）、苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）、蘋果（Malus domestica）中分離獲得可以提高植株抗旱性的bHLH基因。PebHLH35基因受干旱和ABA誘導(dǎo)表達(dá)，例如，在擬南芥中超表達(dá)胡楊PebHLH35基因后，在正常條件下，轉(zhuǎn)基因植株主根長較空載體對照變長，且葉片增多、葉面積增加;在干旱條件下，超表達(dá)PebHLH35基因的植株萎蔫率較空載體對照降低55%，復(fù)水后存活率高達(dá)60%，而空載體對照全部死亡，表現(xiàn)出很強的抗旱性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)PebHLH35基因的植株氣孔密度、氣孔開度、蒸騰速率、失水率均顯著降低，葉綠素含量和光合速率均顯著提高，且氣孔調(diào)控相關(guān)基因[磷脂酶C1（phospholipase C1，PLC1）]的表達(dá)量顯著提高[24]。說明PebHLH35基因通過調(diào)控氣孔密度、開度及光合作用來積極響應(yīng)干旱脅迫。FtbHLH3基因主要受聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、ABA誘導(dǎo)表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)苦蕎麥FtbHLH3基因顯著提高了擬南芥植株在干旱條件下的存活率，這主要歸因于轉(zhuǎn)基因植株中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、離子滲漏率、活性氧 （reactive oxygen species，ROS）（如H2O2、O-2·） 積累量減少，脯氨酸含量、抗氧化酶[過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）]活性、光合效率提高。表達(dá)分析結(jié)果顯示，在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株中多個脅迫響應(yīng)基因[單脫水抗壞血酸還原酶基因（monodehydroascorbate reductase，MDAR）、乙醛脫氫酶3家族H基因 （Aldehyde dehydrogenase 3 family，member H，ALDH3H）、MYC2基因、早期脫水響應(yīng)4基因（early responsive to dehydration 4，ERD4）、CAT基因、SOD基因、九順式環(huán)氧蛋白質(zhì)雙加氧酶基因 （nine-cis epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）、Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶 5基因（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS）]的表達(dá)量均較野生型對照顯著提高，其中NCED是ABA合成的限速酶基因[25]，說明FtbHLH3通過ABA依賴途徑提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。蘋果MdbHLH130基因受脫水脅迫影響而強烈誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)MdbHLH130基因的蘋果愈傷組織對PEG脅迫表現(xiàn)出很強的抗性，且超表達(dá)MdbHLH130基因的煙草（Nicotiana tabacum）植株在干旱條件下的發(fā)芽率、根長均顯著增加，存活率較野生對照提高3.0～4.7倍。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)MdbHLH130基因的煙草植株由ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉度、葉片失水率、電解質(zhì)滲漏、MDA含量、ROS積累量均顯著降低，抗氧化酶（CAT、POD、SOD）活性顯著增加，而ROS清除基因（SOD、POD、CAT）和脅迫響應(yīng)基因[脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白3基因（dehydration-responsive-element-binding protein，DREB3）、ERD10C基因、ERD10D基因、NCED1基因、晚期胚胎豐富蛋白5基因 （late-embryogenesis-abundant protein 5，LEA5）、脂轉(zhuǎn)移蛋白1基因 （lipid-transfer protein 1，LTP1）]的表達(dá)量顯著提高[26]。說明MdbHLH130可以通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉和ROS清除來提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。

2.1.2 耐鹽 目前，關(guān)于bHLH基因僅僅響應(yīng)植物高鹽脅迫的報道較少。Zhou等從野生稻（Oryza rufipogon）中分離了OrbHLH2基因，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中超表達(dá)該基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。在高鹽條件下，超表達(dá)OrbHLH2基因植株的種子萌發(fā)率較野生型對照提高了54.5%～69.7%，且脅迫響應(yīng)基因[C重復(fù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3基因 （C-repeat binding transcription factor 3，CBF3）、RD29A、冷調(diào)控15A基因 （cold regulated 15A，COR15A）、激酶1基因 （kinase 1，KIN1）]的表達(dá)量提高[27]。對野生型對照和超表達(dá)OrbHLH2基因的植株進(jìn)行ABA處理后發(fā)現(xiàn)，兩者在種子萌發(fā)和脅迫響應(yīng)基因表達(dá)方面的表現(xiàn)均相似，說明OrbHLH2基因?qū)}脅迫的響應(yīng)不依賴于ABA。Zheng等發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族多效唑抗性基因 （paclobutrazol resistances，PREs）在ABA處理下的表達(dá)量降低，在高鹽脅迫條件下的表達(dá)量提高[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中超表達(dá)PREs基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，而pre6突變體的耐鹽性與野生型對照相比無明顯變化;超表達(dá)PREs基因的擬南芥植株對ABA的敏感性提供，而pre6突變體對ABA的敏感性降低，說明PREs在調(diào)控高鹽脅迫方面是功能性冗余的。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，功能也不盡相同，有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控植物的耐鹽性，有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控植物的耐鹽性。Verma發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中超表達(dá)bHLH轉(zhuǎn)錄因子編碼基因AtMYC2后，轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的耐受性降低，脯氨酸含量與野生型對照相比無顯著差異;而myc2突變體對高鹽脅迫的耐受性增強，且脯氨酸含量顯著增加[29]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在高鹽條件下，myc2突變體中P5CS1基因表達(dá)量顯著提高，在超表達(dá)MYC2基因植株中，P5CS1基因表達(dá)量無顯著變化，這是因為MYC2轉(zhuǎn)錄因子可與P5CS1基因的5′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控P5CS1基因的表達(dá)。綜上，MYC2轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控P5CS1基因的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控脯氨酸的合成，可以通過沉默MYC2基因表達(dá)來提高植株的耐鹽性。

2.1.3 耐冷 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中響應(yīng)低溫脅迫的成員以CBF表達(dá)誘導(dǎo)因子 （inducer of CBF expression 1，ICE1）為主，ICE1是類似MYC的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，直接結(jié)合并激活DREB1/CBF基因的表達(dá)，以調(diào)控低溫響應(yīng)。在擬南芥中超表達(dá)水稻OsICE1、OsICE2基因（與AtICE1序列高度相似）后，會提高轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性和冷響應(yīng)基因（RD29A、COR15A、COR47）的表達(dá)量。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，OsICE1和OsICE2轉(zhuǎn)錄因子與冷適應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OsMYBS3互作[30]，表明OsICE1、OsICE2轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控冷響應(yīng)基因的表達(dá)來調(diào)控植物的耐冷性。類似的，龍眼（Dimocarpus longan Lour.） DlICE1基因、茄子（Solanum melongena）SmICE1a基因均受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中分別超表達(dá)這2個基因均會提高轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，這主要得益于轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量提高，離子滲漏量、MDA含量和ROS積累量降低，且一些ICE1-CBF冷信號途徑基因（AtCBF1/2/3）、冷響應(yīng)基因（AtRD29A、AtCOR15A、AtCOR47、AtKIN1）表達(dá)量顯著提高[31-32]。另外，枸橘（Poncirus trifoliata）PtrICE1基因受冷、脫水、高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是冷條件;PtrICE1可與精氨酸脫氫酶（arginine decarboxylase，PtADC）互作。在煙草或者檸檬（Citrus limon）中超表達(dá)PtrICE1基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷、耐凍性。在低溫脅迫條件下，超表達(dá)PtrICE1基因的植株ADC基因表達(dá)量、多胺含量、葉綠素含量及抗氧化酶SOD、CAT活性提高，離子滲漏、活性氧積累量降低[33]。說明PtrICE1轉(zhuǎn)錄因子通過與ADC基因結(jié)合來調(diào)控多胺水平，進(jìn)而調(diào)控植物的耐冷性。

除了ICE1基因外，還有些bHLH基因也能提高植物的耐冷性。例如，PtrbHLH基因受多種非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是冷，可與POD基因的E-box元件結(jié)合。在煙草、檸檬、柚子（C. grandis）中分別超表達(dá)PtrbHLH基因后，均提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)下調(diào)該基因在枸橘中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，枸橘對冷的敏感性增強。與野生型對照相比，超表達(dá)PtrbHLH基因的植株離子滲漏量、MDA含量、ROS積累量降低，抗氧化酶（CAT、POD、SOD）活性及抗氧化酶（CAT、POD、SOD）編碼基因表達(dá)量升高，RNAi植株相反。且外施POD抑制劑提高了超表達(dá)PtrbHLH基因植株的H2O2含量，降低了其耐冷性，外施POD抑制劑提高了RNAi植株的耐冷性[34-35]。由此可見，超表達(dá)PtrbHLH基因植株耐冷性的提高在一定程度上歸因于其對ROS清除能力的提高。類似的，甜橙（C. sinensis）CsbHLH18基因也可與CsPOD基因啟動子區(qū)特異性結(jié)合。在煙草中超表達(dá)CsbHLH18基因也提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性。在冷脅迫條件下，與野生型對照相比，超表達(dá)CsbHLH18基因植株的ROS積累量降低，SOD、POD、CAT活性及SOD、POD、CAT基因表達(dá)水平提高。相反的，敲除bHLH18基因的植株對冷的敏感性增強，SOD、POD、CAT活性及SOD、POD、CAT基因表達(dá)水平降低，ROS積累量提高[36]。由此可見，CsbHLH18對植物耐冷性的提高在一定程度上是通過直接調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控ROS平衡來實現(xiàn)的。另外，NtbHLH123基因受冷脅迫誘導(dǎo)，在煙草中超表達(dá)NtbHLH123基因后，在冷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的存活率為39.3%～59.6%，而野生型對照的存活率僅為10.0%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NtbHLH123轉(zhuǎn)錄因子與 NtCBF 基因啟動子區(qū)的 G-box/E-box元件結(jié)合，直接正調(diào)控其表達(dá);在冷脅迫條件下，與野生型對照相比，超表達(dá)NtbHLH123基因植株的離子滲漏量、MDA含量、ROS積累量降低，一些ROS清除基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）及其他脅迫響應(yīng)基因（NtLEA5、NtERD10C、NtERD10D）的表達(dá)量提高[37]。由此可見，NtbHLH123轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控NtCBF、ROS清除相關(guān)基因、脅迫響應(yīng)基因來提高植物的耐冷性。

2.1.4 耐缺鐵性 Zhang等發(fā)現(xiàn)，敲除AtbHLH104基因的擬南芥植株耐缺鐵性大大降低，幼嫩葉片中的鐵含量較野生型對照降低了15.5%，成熟葉片中鐵含量沒有差異;相反的，超表達(dá)AtbHLH104基因擬南芥植株耐缺鐵性增強，幼嫩葉片、成熟葉片、花、籽粒中的鐵含量均較野生型對照顯著增加，同時鐵蛋白1基因 （ferritin1，F(xiàn)ER1）表達(dá)量提高[38]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AtbHLH104可與IVc亞組bHLH轉(zhuǎn)錄因子吲哚乙酸-亮氨酸抗性3（IAA-Leucine resistant 3，ILR3）互作，且超表達(dá)AtILR3基因的擬南芥植株耐缺鐵性也增強。另外，AtbHLH104和AtILR3均可與鐵脅迫響應(yīng)調(diào)控基因Ib亞組bHLH基因和PYE（POPEYE）基因啟動子區(qū)的E-Box元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控這2條轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑。由此可見，AtbHLH104和AtILR3均可通過調(diào)控Ib亞組bHLH基因和AtPYE基因來調(diào)控植物的鐵脅迫響應(yīng)。

除了在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)提高植物耐缺鐵性的bHLH基因外，研究者已經(jīng)陸續(xù)從山楊（Populus tremula）、蘋果、大豆（Glycine max）、水稻中也發(fā)現(xiàn)了提高植物耐缺鐵性的bHLH基因。山楊FER 類鐵缺乏誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1基因 （FER-like iron deficiency-induced transcription factor 1，F(xiàn)IT）受缺鐵脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)PtFIT基因提高了轉(zhuǎn)基因山楊植株的耐缺鐵性。在缺鐵脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量及葉綠素a/b較野生型對照顯著提高[39]。蘋果MdbHLH104受缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)MdbHLH104基因提高了缺鐵條件下蘋果植株質(zhì)膜H+-ATPase活性和耐缺鐵性，這是因為MdbHLH104轉(zhuǎn)錄因子可與MdAHA8（autoinhibited H+-ATPases 8）基因啟動子區(qū)結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控缺鐵條件下質(zhì)膜H+-ATPase活性和鐵吸收[40]。另外，同時超表達(dá)大豆GmbHLH57和GmbHLH300基因也提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐缺鐵性，轉(zhuǎn)基因植株中鐵吸收基因[鐵還原酶氧化酶基因（ferric reductase oxidase 2，F(xiàn)RO2）、鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運基因（iron-regulated transporter，IRT1）]表達(dá)量和鐵含量均提高[41]。眾所周知，水稻OsHRZ1（haemerythrin motif-containing really interesting new gene （RING）-and zinc-finger protein 1）和 OsHRZ2轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控缺鐵響應(yīng)。Kobayashi等發(fā)現(xiàn)，OsbHLH058轉(zhuǎn)錄因子可與 OsHRZ1、OsHRZ2蛋白互作，超表達(dá)OsbHLH058基因水稻植株耐缺鐵性增強，且缺鐵條件下轉(zhuǎn)基因植株種子中鐵含量升高，缺鐵誘導(dǎo)基因[煙酰胺合成酶1基因（niacinamide synthetase 1，NAS1）、麥根酸家族植物鐵載體轉(zhuǎn)運1基因 （transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1，TOM1） 、類黃色條紋蛋白15基因（yellow stripe-like protein 15，YSL15）]、OsIRT1的表達(dá)量提高[42]。相反的，敲除OsbHLH058基因的水稻植株對缺鐵敏感性增強，鐵誘導(dǎo)基因的表達(dá)量降低[42]，說明OsbHLH058轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控缺鐵響應(yīng)，在一定程度上受到OsHRZ控制。

2.2 復(fù)合抗性

2.2.1 抗旱+耐鹽 擬南芥AtbHLH92基因受鹽、脫水、甘露醇、冷誘導(dǎo)表達(dá)。超表達(dá)AtbHLH92基因增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的根長、側(cè)根數(shù)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的生長，提高了脅迫響應(yīng)基因[COR47、Ⅲ類過氧化物酶10基因（class Ⅲ peroxidases，PER10）、PER52基因、PER59基因]的表達(dá)量，增強了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性、抗旱性，而Atbhlh92突變體對高鹽、干旱的敏感性增強[43]。類似的，AtbHLH112基因受干旱、高鹽、ABA誘導(dǎo)表達(dá)，AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子可與脅迫響應(yīng)基因啟動子區(qū)的E-box元件、GCG元件結(jié)合，超表達(dá)該基因提高了擬南芥植株的抗旱性和耐鹽性，反之，沉默該基因增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱、高鹽的敏感性。與野生型對照相比，超表達(dá)AtbHLH112基因提高了轉(zhuǎn)基因植株中P5CS基因的表達(dá)量，降低了Δ1-吡咯啉-5羧酸鹽脫氫酶基因（Δ1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase，P5CDH）和脯氨酸脫氫酶基因（proline dehydrogenase，ProDH）的表達(dá)量，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量;同時，超表達(dá)AtbHLH112基因提高了轉(zhuǎn)基因植株P(guān)OD、SOD基因表達(dá)量及POD、SOD活性，最終提高了轉(zhuǎn)基因植株對ROS的清除能力[44]。由此可見，AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子通過與E-box元件、GCG元件結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控脯氨酸合成和ROS清除，最終調(diào)控植物的抗逆性。

除了在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)能夠同時提高植物抗旱、耐鹽性的bHLH基因外，研究者還從剛毛檉柳（Tamarix hispida）、金魚草（Antirrhinum majus）、密羅木（Myrothamnus flabellifolia）、龍爪稷（Eleusine coracana L.）中發(fā)現(xiàn)了可以同時提高植物抗旱性、耐鹽性的bHLH基因。例如，剛毛檉柳ThbHLH1基因受高鹽、ABA、甘露醇誘導(dǎo)表達(dá)，與G-box特異性結(jié)合以響應(yīng)高鹽、甘露醇脅迫，在擬南芥中超表達(dá)該基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性。與野生型對照相比，在高鹽和干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株中的甜菜堿、脯氨酸含量與Ca2+濃度、POD活性、SOD活性均提高，MDA含量、ROS積累量及細(xì)胞死亡率降低。究其原因，ThbHLH1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控P5CS基因、甜菜堿醛脫氫酶基因（betaine-aldehyde dehydrogenase，BADH）、POD基因、SOD基因、LEA基因、熱激蛋白基因（heat shock protein，HSP）等抗逆基因的表達(dá)[45]。由此可見，ThbHLH1轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控抗逆相關(guān)基因的表達(dá)來提高轉(zhuǎn)基因植株的滲透壓、ROS清除能力，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性。另外，超表達(dá)金魚草bHLH轉(zhuǎn)錄因子編碼基因AmDEL（Delila）提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株類黃酮積累量及抗旱、耐鹽性。與野生型對照相比，在干旱和高鹽條件下，超表達(dá)AmDEL基因顯著增加了轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量、相對含水量，降低了MDA、H2O2含量，且提高了類黃酮合成基因[苯丙基氨酸解氨酶基因 （phenylalanine ammonialyase，PAL）、查爾酮合成酶基因（chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶基因（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮-3-羥化酶基因（flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、 黃酮醇合成酶基因（flavonol synthase，F(xiàn)LS）、黃烷酮醇還原酶基因（dihydroflavonol reductase，DFR）]、P5CS基因、ROS清除基因（SOD、POD）的表達(dá)量，提高了PAL、CHI、DFR、P5CS、SOD、POD活性[46-47]。說明AmDEL基因通過調(diào)控類黃酮合成基因、抗氧化酶基因的表達(dá)來調(diào)控植株的抗逆性。此外，密羅木 bHLH家族成員光敏色素互作因子1基因（phytochrome-interacting factor 1，PIF1）和MfbHLH38基因均受脫水誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中分別超表達(dá)這2個基因后，均提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性，這主要歸因于轉(zhuǎn)基因植株葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的提高以及葉片失水率、MDA含量、ROS積累量的降低。另外，超表達(dá)MfPIF1 基因降低了干旱和高鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的氣孔開度，提高了ABA含量及ABA合成與響應(yīng)基因（NCED3、P5CS、RD29A）的表達(dá)量[48-49]。由此可見，MfPIF1和MfbHLH38轉(zhuǎn)錄因子通過提高植物保水、滲透調(diào)節(jié)能力，降低了脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害，通過參與依賴于ABA的脅迫響應(yīng)途徑來提高植株的抗旱性和耐鹽性。

有些bHLH基因不僅能提高植物的抗逆性，還能提高產(chǎn)量，這些bHLH基因在作物抗逆遺傳改良中具有更重要的作用。例如，龍爪稷EcbHLH57基因受ABA、高鹽、干旱誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因促進(jìn)了煙草植株根系發(fā)育（根長顯著變長），提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性。在干旱條件下，超表達(dá)EcbHLH57基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的光合速率和氣孔導(dǎo)度，進(jìn)而增加了生物量;在長期高鹽脅迫條件下，超表達(dá)EcbHLH57基因提高了轉(zhuǎn)基因植株單果莢種子質(zhì)量和果莢數(shù)。通過對表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)cbHLH57基因提高了轉(zhuǎn)基因植株中脅迫相關(guān)基因[LEA14基因、rd29A基因、rd29B基因、SOD基因、APX基因、乙醛脫氫酶基因（alcohol dehydrogenase 1，ADH1）、HSP70基因 、磷酸酶2C基因（phosphatases 2C，PP2C）]的表達(dá)量，進(jìn)而提高了LE轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性[50]。

2.2.2 耐鹽+耐冷 野生稻OrbHLH001基因是類ICE1基因，受高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中超表達(dá)該基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和耐冷性。與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因植株中冷脅迫誘導(dǎo)基因（ICE1、 CBF1、CBF2、CBF3、RD29A、COR47）的表達(dá)量無差異[51]，說明OrbHLH001基因與ICE1基因有所不同，不依賴于CBF/DREB1冷響應(yīng)途徑。類似的，番茄（Solanum lycopersicum） SlICE1a基因受冷、高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，在煙草中超表達(dá)SlICE1a基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性和耐鹽性。與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸、可溶性糖、LEA含量增加，離子滲漏、MDA含量降低，脅迫響應(yīng)基因（NtDREB2、NtERD10B、NtERD10C、NtERD10D、NtLEA5、NtP5CS）的表達(dá)量提高[52]，說明SlICE1a轉(zhuǎn)錄因子通過上調(diào)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量來提高植物的耐冷性和耐鹽性。

2.2.3 抗旱+耐鹽+耐冷 有些bHLH基因可以同時提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐冷性，甚至提高產(chǎn)量。例如，小麥TabHLH39基因受干旱、高鹽、冷誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中超表達(dá)該基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性、耐鹽性與耐冷性。與野生型對照相比，超表達(dá)TabHLH39基因植株在干旱、高鹽、冷脅迫條件下的存活率提高，可溶性糖、脯氨酸含量增加，離子滲漏降低，且脅迫響應(yīng)基因[滲透響應(yīng)高表達(dá)1基因（high expression of osmotically responsive 1，HOS1）、DRIP2、ERD6、AtICE1、RD29A、RD22、ERD1]的表達(dá)量提高[53]。結(jié)縷草（Zoysia japonica）ZjICE2基因也受冷、高鹽、干旱誘導(dǎo)表達(dá)，可與ZjDREB1基因啟動子區(qū)的MYC順式元件結(jié)合，超表達(dá)該基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥、結(jié)縷草植株耐冷、抗旱、耐鹽性。與野生型對照相比，在冷脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化酶（POD、SOD）活性和脯氨酸含量提高，MDA含量降低，冷脅迫響應(yīng)基因（CBF1、CBF2、CBF3、COR47A、KIN1、RD29A）表達(dá)量提高;在干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量提高，氣孔開度和MDA含量降低;在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉面積指數(shù)和葉綠素含量提高[54]。類似的，超表達(dá)油菜（Brassica campestris）BcICE1基因也可提高煙草植株的耐冷性、耐鹽性與抗旱性。在冷、高鹽、干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株的SOD、CAT、POD、APX活性及脯氨酸、可溶性糖、葉綠素含量增加，相對電導(dǎo)率和MDA含量降低，抗氧化酶基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）及脅迫響應(yīng)基因（NtCBF1、NtCBF3、NtDREB2B、NtERD10B、NtERD10C）的表達(dá)量提高[55]。另外，超表達(dá)菊花（Chrysanthemum dichrum）CdICE1基因也提高了菊花植株的耐冷性、抗旱性、耐鹽性，與野生型對照相比，超表達(dá)CdICE1基因植株在冷、干旱、高鹽條件下的存活率分別提高了69.6%、123.3%、56.7%;CgDREBa、CgDREBb基因表達(dá)量提高，SOD、POD活性及脯氨酸含量增加[56]。

值得注意的是，在水稻中超表達(dá)AtICE1基因不僅提高了轉(zhuǎn)基因植株耐冷、抗旱、耐鹽性，還提高了水稻產(chǎn)量。在冷、高鹽、干旱條件下，轉(zhuǎn)基因植株小穗育性增強，籽粒產(chǎn)量分別較野生型對照顯著提高了58%～214%、110%～220%、44%～66%。與野生型對照相比，在冷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的MDA、H2O2含量降低，膜穩(wěn)定性增強，脅迫響應(yīng)基因[OsDREB1A、OsMYB3R2、OsTPP1（trehalose-6-phosphate phosphatase ）]的表達(dá)量提高。在干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株光合速率、氣孔導(dǎo)度、水分利用效率提高，說明AtICE1通過提高脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量、ROS清除能力、膜穩(wěn)定性、水分利用效率等來提高植物的抗逆性[57]。

2.2.4 其他 bHLH基因除了可以綜合提高植物的抗旱、耐鹽、耐冷性，還可以綜合提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐缺磷性與耐缺氮性。玉米（Zea mays）bHLH家族磷饑餓誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1（Pi starvation induced transcription factor 1，PTF1）受低磷、ABA、PEG誘導(dǎo)表達(dá)，尤其在根部。Li等首先發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)ZmPTF1基因可以提高轉(zhuǎn)玉米植株的耐缺磷性。表型表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)育健壯，籽粒變大，穗長、行粒數(shù)、籽粒百粒質(zhì)量增加[58]。與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因植株根系可溶性糖含量提高，葉片可溶性糖含量降低，參與蔗糖合成的果糖-1，6-二磷酸酶、蔗糖磷酸合成（SPS1）基因表達(dá)量在葉片中提高，在根系中降低;參與蔗糖分解代謝的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)量在根中降低。后來，Li等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)ZmPTF1基因還可以提高玉米植株的抗旱性，表型表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因玉米植株根數(shù)、根長增加，尤其是側(cè)根，更值得注意的是，籽粒產(chǎn)量較野生型對照提高了147%。這在一定程度上是因為ZmPTF1轉(zhuǎn)錄因子可與NCED、CBF4、ATAF2/NAC081、NAC30基因啟動子區(qū)的G-box元件結(jié)合，并且正調(diào)控這些基因的表達(dá)[59]。其中，NCED基因是ABA合成限速酶基因，ZmPTF1轉(zhuǎn)錄因子通過上調(diào)NCED基因表達(dá)量來促進(jìn)ABA合成，激活A(yù)BA信號通路，轉(zhuǎn)基因植株中依賴于ABA的脅迫響應(yīng)被激活。綜上，ZmPTF1轉(zhuǎn)錄因子通過促進(jìn)根系發(fā)育、ABA積累與激活A(yù)BA、CBF4、ATAF2/NAC081、NAC30介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)來提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性。

TabHLH1基因受干旱、高鹽、缺磷、缺氮脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。Yang等首先發(fā)現(xiàn)，在煙草中超表達(dá)TabHLH1基因可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性和耐鹽性[60]。在干旱、高鹽條件下，與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因植株的生物量增加，葉片失水率降低，氣孔關(guān)閉快，脯氨酸和可溶性糖含量提高，H2O2含量減少，且轉(zhuǎn)基因植株中ABA受體類吡喃巴丁抗性12基因（Pyrabatin riesistance like 12，PYL12）及蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶2（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2，SnRK2）家族應(yīng)急激活蛋白激酶2;1基因（stress-activated protein kinase 2;1，SAPK2;1）的表達(dá)量提高。超表達(dá)NtPYL12、NtSAPK2;1基因促進(jìn)了干旱和高鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株氣孔關(guān)閉，降低了葉片失水率，進(jìn)而促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株生長。在缺磷、缺氮條件下，與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因植株株型大，生物量及磷、氮濃度增加，磷酸鹽轉(zhuǎn)運1基因（phosphate transporter 1，PT1）、硝酸鹽轉(zhuǎn)運2.2基因（nitrate transporter 2.2，NRT2.2）的表達(dá)量提高。另外，轉(zhuǎn)基因植株的ROS積累量降低，抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性及NtSOD1、NtCAT1、NtPOD1;6基因的表達(dá)量提高[61]。綜上，TabHLH1通過ABA依賴途徑調(diào)控植物的抗旱性和耐鹽性，通過調(diào)控磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因、硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因、抗氧化酶基因來調(diào)控植物的耐缺磷性和耐缺氮性。

3 展望

植物在生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭遇非生物脅迫危害，其中干旱、高鹽、低溫是主要的非生物脅迫，會嚴(yán)重影響植物生長、地理分布，甚至是作物產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐冷性對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)意義重大。然而，植物的抗逆性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制，易受環(huán)境影響，因此通過常規(guī)育種技術(shù)有效選育抗逆品種較難。基因工程技術(shù)是培育抗逆品種的有效途徑，相比傳統(tǒng)的常規(guī)育種，基因工程育種有其獨特的優(yōu)勢，不僅基因來源廣泛，而且能夠?qū)崿F(xiàn)對特定性狀精確高效的改良，有廣闊的應(yīng)用前景。bHLH家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物抵御干旱、高鹽、低溫、缺鐵脅迫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。目前，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、煙草及水稻、玉米、大豆等植物抗逆基因工程中的應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展，研究者已經(jīng)成功獲得了一些轉(zhuǎn)基因抗逆材料和抗逆候選bHLH基因，尤其是可以提高籽粒產(chǎn)量的bHLH基因，例如提高煙草種子產(chǎn)量的EcbHLH57基因、提高水稻籽粒產(chǎn)量的AtICE1基因，為作物抗逆遺傳改良及育種奠定了堅實的基礎(chǔ)。但是該領(lǐng)域目前還存在一些問題亟須解決：第一，轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性大部分是在室內(nèi)、苗期鑒定的，但是室內(nèi)模擬環(huán)境與大田環(huán)境不同，大田環(huán)境受影響的因素較多，另外，苗期抗逆生殖生長期不一定抗逆，因此應(yīng)在大田、生殖生長期進(jìn)行二次抗逆性鑒定。第二，抗逆性是復(fù)雜的多基因控制的數(shù)量性狀，一般轉(zhuǎn)單個抗逆基因植株的抗逆性提高幅度有限，甚至不能提高抗逆性，因此應(yīng)加速多基因（尤其是調(diào)節(jié)基因）共同導(dǎo)入植物的系統(tǒng)研究，以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。第三，轉(zhuǎn)基因植株中大多數(shù)bHLH基因是組成型超表達(dá)的，在提高轉(zhuǎn)基因植株抗逆性的同時可能會造成生長緩慢、開花推遲等，故建議對bHLH基因進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)超表達(dá)，在提高轉(zhuǎn)基因植株抗逆性的同時也不會影響生長發(fā)育。

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