樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定性及抗氧化性研究

邢 爽， 梁啟茹， 方頌平， 吳文睿，董書甲， 劉 露， 萬春環(huán)， 蒲順昌*

(1. 亳州學院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800； 2. 亳州學院 配制酒工程技術研究中心，安徽 亳州 236800)

以樹莓為原料,以食用酒精為酒基研制的樹莓養(yǎng)生配制酒,是一款色澤誘人、口感清爽的酒類飲品。研究表明構成果酒色澤的主要物質是來源于果實并在釀造過程中發(fā)生復雜衍化反應的花青素及其衍生物[1-2],樹莓配制酒的色澤則主要由于樹莓漿果中花青素溶出導致,但花青素不穩(wěn)定,對酒的色澤穩(wěn)定性影響較大,自然狀態(tài)下,花青素常與各種單糖形成糖苷,以花色苷的形式存在。在溶液體系中,花色苷存在著4種平衡結構:黃烊陽離子(紅色)、醌式堿(藍色)、查爾酮和甲醇式假堿(無色),這4種結構隨著溶液 pH等條件的變化而相互轉化,從而使溶液呈現出不同的顏色[3-4],同時色澤的穩(wěn)定性容易受到溫度、氧氣、pH等因素的影響,導致帶有色澤的酒在銷售過程中顏色不容易保持,且色澤的不穩(wěn)定會極大限制花色苷等物質的營養(yǎng)價值[5-7],影響酒的保值性,因此研究酒的色澤穩(wěn)定條件及護色工藝對酒的保值具有重要意義。

樹莓配制酒中含有大量的多酚類物質,這些物質具有強抗氧化性,當向酒中加入氧化物質自由基時,酒中具有強抗氧化性的物質發(fā)揮作用,通過測自由基的清除率,可以得到樹莓配制酒的抗氧化性能力,據有關研究,抗氧化性與物質抗腫瘤、抗炎、抗衰老等其他功效密切相關[8-9],因此研究樹莓配制酒的抗氧化性可為后續(xù)深入研究酒的其他功效機理提供理論依據。

本研究通過pH示差法研究了溫度、光照、氧氣以及有機酸對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響,樹莓配制酒中含有豐富的抗氧化性物質,通過測定其對DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基的清除能力對其抗氧化性進行了研究,進行樹莓配制酒的穩(wěn)定性研究進而確定其儲存條件,有助于產品的銷售,研究其抗氧化性有助于明確產品的營養(yǎng)價值,為后續(xù)對樹莓配制酒營養(yǎng)價值的深入開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室自主研制的樹莓配制酒;氯化鉀、醋酸鈉、乙酸(分析純,天津市津東天正精細化學試劑廠);七水合硫酸亞鐵、水楊酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);無水乙醇(分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司);蘋果酸、DPPH、Tris-HCl緩沖液、檸檬酸(分析純,博美生物科技有限責任公司);鄰苯三酚(分析純,倍緣化工有限責任公司)。

1.2 儀器與設備

HH.S21-8-S型數顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);FiveEasy Plus型pH計(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司);ME204E型電子天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司);SPX-400-III型生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);UV-9000S型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定性研究

1.3.1.1 溫度對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 分別取100 mL澄清的樹莓配制酒于5組錐形瓶中,分別置于-10、10、20、40、50、60 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中,每天取樣1次,用pH示差法測定酒樣在最大吸收波長513 nm處的吸光度,利用矢車菊素葡萄糖苷的經驗公式計算花青素的含量[10],研究溫度對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響。

1.3.1.2 光照對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 分別取100 mL的樹莓配制酒于4組錐形瓶中,并分別放置于紫外燈、白熾燈、自然光以及避光條件下;為了避免因紫外燈和白熾燈輻照產熱而引起花青素降解[9],酒樣放置于20 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中。每2 h取樣一次,用pH示差法測在最大吸收波長處的吸光度,利用矢車菊素葡萄糖苷的經驗公式計算花色苷的含量,研究光照對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響。

1.3.1.3 氧氣對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 分別取100 mL樹莓配制酒于4組錐形瓶中,一組敞口保存,其中兩組分別用紗布、脫脂棉覆蓋錐形瓶口,一組用封口膜密封瓶口(利用樣品的封口形式近似表示樣品貯存的氧濃度狀態(tài)),將4組錐形瓶均置于20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,每天取樣一次,利用矢車菊素葡萄糖苷的經驗公式計算花色苷的含量,研究氧氣對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響。

1.3.1.4 有機酸對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 取100 mL樹莓配制酒于錐形瓶中,分別添加 0、0.5、1.0、1.5(g/L)的蘋果酸、檸檬酸和乙酸的單一酸溶液,置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中密封保存,每天取樣一次,用pH示差法測酒樣在最佳吸收波長處的吸光度,利用矢車菊素葡萄糖苷的經驗公式計算花色苷的含量,研究有機酸對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響。

1.3.2 樹莓配制酒的抗氧化性研究

1.3.2.1 樹莓配制酒對DPPH自由基清除能力的測定方法 精確稱取19.7 mg的DPPH,用無水乙醇定容至250 mL,充分混勻。將樹莓配制酒配制成不同梯度濃度的待測樣品溶液,并將樣品溶液與DPPH溶液按1∶1混合,避光反應30 min,517 nm下測定吸光度[11-14],并做空白對照,同時以100 mg/L的抗壞血酸進行比較研究,分別計算樹莓配制酒和抗壞血酸對DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基清除率計算公式為:DPPH自由基清除率(%)=[(Ao-Ax)/Ao]×100%,式中:Ao為空白對照的吸光度;Ax為樣品的吸光度。

1.3.2.2 樹莓配制酒對羥基自由基清除能力的測定方法 分別取1 mL不同濃度的樹莓配制酒,加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液 1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液 1 mL,經37 ℃水浴反應0.5 h后,于510 nm下測定吸光度,并做空白對照。同時以100 mg/L的抗壞血酸進行比較研究,分別計算樹莓配制酒和抗壞血酸對羥基自由基的清除率。

羥基清除率計算公式為:羥基清除率(%)=[1-(Ax-Axo)/Ao]×100,式中:Ao為空白對照不加待測溶液的吸光度;Ax為加入待測溶液后的吸光度:Axo為不加H2O2待測溶液的吸光度。

1.3.2.3 樹莓配制酒對超氧陰離子自由基清除能力的測定方法 取Tris-HCl緩沖液4.5 mL(50 mmol/L,pH 8.2)于試管中,加入2.0 mL蒸餾水后充分混勻,37 ℃水浴30 min,加入2.0 mL不同濃度的樹莓配制酒和0.5 mL鄰苯三酚溶液(25 mmol/L,37 ℃預熱),混勻后37 ℃水浴6 min,滴加1 mL鹽酸(10 mmol/L)終止反應,320 nm下測定吸光度,并做空白對照,同時以100 mg/L的抗壞血酸進行比較研究。分別計算樹莓配制酒對超氧陰離子自由基的清除率。

超氧陰離子自由基清除率的計算公式:超氧陰離子自由基清除率(%)=(Ao-Ax)/Ao×100%,式中,Ao為空白對照液的吸光度;Ax為待測溶液的吸光度。

1.4 樹莓養(yǎng)生配制酒色澤穩(wěn)定性的分析方法

采用pH示差法對花青素進行定量分析,以矢車菊素葡萄糖苷的經驗公式來計算樣品酒中的花青素含量,研究樹莓養(yǎng)生配制酒的色澤穩(wěn)定性,但樣品酒中花青素成分比較復雜,雖然經驗公式是基于矢車菊素葡萄糖苷,但最佳測定波長應根據具體樣本進行優(yōu)化[15-16]?；ㄇ嗨睾坑嬎愎饺缦?

式中:C為樹莓配制酒中花青素含量,mg/L;A=A(513 nm,pH1.0)-A(513 nm,pH4.5);M為矢車菊素葡萄糖苷的相對分子質量,449.2 g/mol,n為樣品稀釋倍數;n為矢車菊素葡萄糖苷的摩爾消光系數,26 900 (L/mol)·cm-1。

1.4.1 吸收波長的確定 將樹莓配制酒用pH 1.0的KCl緩沖液稀釋40倍,用紫外可見分光光度計掃描樹莓配制酒在300～700 nm處的吸收光譜圖。同理,將樹莓養(yǎng)生配制酒用pH 4.5的醋酸鈉緩沖液稀釋40倍,掃描其在300～700 nm范圍內的吸收光譜圖。當吸光度出現最大差值時,此時的波長為實驗的最佳波長[17]。

1.4.2 平衡時間和平衡溫度的確定 在高溫條件下,花色苷易分解,不同樣品在不同溫度下達到平衡的時間也不同,因此需要確定樹莓配制酒在 pH 1.0和 pH 4.5緩沖溶液中的平衡時間和平衡溫度。將稀釋40倍的樹莓養(yǎng)生配制酒分別置于20、30、40、50和 60 ℃的恒溫水浴鍋中,每 10 min取樣一次測其吸光度,當吸光度穩(wěn)定時,實驗結束并記錄結果,得到最短的平衡時間和最適宜的平衡溫度[17]。

1.5 數據處理

每組實驗均進行3次平行實驗,實驗數據的處理以及顯著性分析使用SPSS統計分析軟件,圖表使用origin 8.5繪制。

2 結果與分析

2.1 pH示差法吸收波長以及平衡時間、平衡溫度的確定

經測定,樹莓配制酒樣品在pH 1.0和pH 4.5的緩沖液中,吸收波長在513 nm處出現最大差值,因此,使用513 nm作為檢測樹莓配制酒的最佳波長。同時，樣品在pH 4.5和pH 1.0的緩沖液中,30 ℃水浴90 min吸光度趨于穩(wěn)定。因此,樹莓配制酒的平衡溫度選擇30 ℃、平衡時間選擇90 min。

2.2 樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定性研究

2.2.1 溫度對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 樹莓配制酒經過不同的溫度處理后,花青素含量變化如圖1所示。由圖1可以看出,在-10 ℃的低溫環(huán)境中,花青素含量變化不大,表明在低溫條件下花青素以穩(wěn)定的結構存在于樹莓配制酒中或酒中與大分子結合的花色苷釋放;而隨著溫度的升高和處理時間的延長,花青素穩(wěn)定性降低,尤其是高溫環(huán)境下隨著貯存時間的延長,酒中花青素含量顯著降低(P<0.05)。20 ℃貯存5 d花青素的保留率為91.37%;而在高溫環(huán)境中花青素大量降解,50 ℃時,花青素保存率僅有22.95%。由此表明,高溫對花青素破壞極大,低溫對樹莓配制酒中的花青素有保護作用,樹莓配制酒應在低溫環(huán)境中儲存,以確保其色澤穩(wěn)定性。王子悅[18]分別研究了貯藏溫度對紅莧菜花青素穩(wěn)定性的影響,研究表明紅莧菜花青素在低溫下有較高的穩(wěn)定性,研究結果與本文結果類似。

圖1 溫度對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響

2.2.2 光照對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 如圖2所示,與溫度相比,光照對樹莓配制酒中花青素的影響較小。避光保存第1天酒中花青素的含量有所上升,而隨著儲存時間的延長,花青素含量逐漸下降,12 h之后,花青素含量為133.67 mg/L,保存率最高。在紫外燈照射下的樹莓配制酒中花青素含量下降緩慢,12 h之后,花青素含量為132.89 mg/L,保存率為98.33%;而自然光下的酒樣12 h之后,花青素含量為132.67 mg/L,保存率為98.17%,這與焦嬌等[19]研究紫外光照對紅棗發(fā)酵酒色澤穩(wěn)定性影響結果類似。而白熾燈對花青素的穩(wěn)定性破壞性較強,12 h之后,花青素含量為127.67 mg/L,保存率為93.73%。由此表明,白熾燈對花青素的穩(wěn)定性破壞性較強,不利于樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定;紫外光線波長較短,對樹莓配制酒中色澤穩(wěn)定性并無影響;而在避光條件下,12 h之后花青素含量最高,表明避光保存有利于樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定性[20]。

圖2 光照對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響

2.2.3 氧濃度對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 在不同的氧濃度環(huán)境中,樹莓配制酒中花青素的穩(wěn)定性不同。由圖3可以看出,在敞口和紗布覆蓋的條件下,樹莓配制酒中花青素含量下降速度較快(P<0.05),表明在與氧氣接觸的環(huán)境中,酒樣中的花青素大量分解,不利于樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定;而在脫脂棉及封口的微氧環(huán)境中,樹莓配制酒中的花青素含量呈現先上升后下降的變化趨勢,最終花青素含量為107.8 mg/L,表明在微氧環(huán)境中,酒中與大分子結合的花青素先釋放,之后由于氧氣的影響,花青素分解;而在封口膜密封的無氧環(huán)境中,花青素含量也有所下降,但下降速度緩慢,最終花青素含量為108.5 mg/L。由圖可知,5 d后花青素含量的關系是:密封>脫脂棉>紗布>敞口。由此可知,氧氣使樹莓配制酒中的花青素大量分解,對樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定性有不利的影響,樹莓配制酒應密封儲存。

圖3 氧濃度對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響

2.2.4 有機酸對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響 向樹莓配制酒中添加不同濃度的蘋果酸、檸檬酸和乙酸后,樹莓配制酒中花青素含量變化分別如圖4～6所示。從圖中可以看出,向樹莓配制酒中添加不同濃度的蘋果酸、檸檬酸和乙酸后,樹莓配制酒中花青素含量均有所下降,但與對照組相比,添加了蘋果酸和檸檬酸的酒樣中花青素含量下降速度緩慢,并隨著蘋果酸和檸檬酸濃度的增加,樹莓配制酒的花青素越穩(wěn)定,當有機酸的添加量為1.5 g/L時,花青素含量較對照組差異顯著(P<0.05),可能是因為花青素在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性增強[21]。

從圖4～5可以看出,在加入不同濃度的蘋果酸和檸檬酸條件下,樹莓配制酒儲藏5 d后的色澤保存率隨著有機酸濃度的升高而增大,以添加1.5 g/L的檸檬酸效果最顯著,花青素含量為124.99 mg/L,色澤保存率達到96.87%,穩(wěn)定性最好。秦麗歡等[22]采用不同濃度檸檬酸作為清洗劑清洗杏干發(fā)現檸檬酸在一定程度上可使杏干保持較好的外觀色澤,周劍忠等[23]研究發(fā)現蘋果酸提高藍莓汁色澤穩(wěn)定性的效果顯著優(yōu)于其它有機酸。以上研究說明檸檬酸與蘋果酸均在一定程度上有助于色澤穩(wěn)定,與本研究結果類似。

圖4 蘋果酸對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響

圖5 檸檬酸對樹莓配制酒色澤穩(wěn)定性的影響

從圖6可以看出,在添加了不同濃度乙酸的樹莓配制酒中,花青素含量先大幅下降且酒體有渾濁現象,之后花青素含量緩慢上升,可能因為乙酸酸度過高,使酒中與大分子物質結合的花青素大量釋放,形成沉淀;之后由于花青素水溶性較強,沉淀溶解,花青素含量又緩慢上升,目前研究乙酸對食品色澤穩(wěn)定性的研究不多。因此,在樹莓配制酒中添加適量的蘋果酸和檸檬酸可以使花青素以穩(wěn)定的結構存在于樹莓配制酒中,有助于保護其色澤穩(wěn)定性,而乙酸可能導致酒中與大分子物質結合的花青素大量釋放,形成沉淀,不利于樹莓配制酒的穩(wěn)定性。

圖6 乙酸對樹莓配制酒的影響

2.3 樹莓配制酒的抗氧化性研究

2.3.1 樹莓配制酒對DPPH自由基清除能力的研究 DPPH是一種穩(wěn)定存在于有機溶劑中的自由基,在乙醇溶液中呈深紫色,于517 nm的波長處有最大吸光度,其吸光度與濃度成正比,當加入自由基清除劑或抗氧化劑時,它們會結合或取代自由基,DPPH數量變少,其吸光度也會變小[24]。

如圖7所示,樹莓配制酒和抗壞血酸對DPPH自由基清除率均隨著稀釋倍數的增加迅速降低,即與濃度呈現線性相關。在同一稀釋倍數下,樹莓配制酒對DPPH自由基清除率高于抗壞血酸,其中樹莓配制酒的DPPH自由基清除率94.67%,遠高于100 mg/L抗壞血酸DPPH自由基清除率,表明樹莓配制酒具有較好的DPPH自由基清除能力,對人體具有一定的抗氧化性作用。

圖7 樹莓配制酒對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 樹莓配制酒對羥基自由基清除能力的研究 羥基自由基與人體細胞的衰老、突變密切相關,是對人體危害最大的一種自由基[25]。如圖8所示,樹莓配制酒和抗壞血酸對羥基自由基的清除率與濃度呈線性相關,隨著稀釋倍數的增加迅速降低,在同一稀釋倍數下,樹莓配制酒的羥基自由基清除率高于抗壞血酸,其中樹莓配制酒的羥基自由基清除率為91.67%,遠高于100 mg/L抗壞血酸的羥基自由基清除率,表明樹莓配制酒具有很好的羥基自由基清除能力,在一定程度上具有一定的營養(yǎng)價值。

圖8 樹莓配制酒對羥基自由基的清除能力

2.3.3 樹莓配制酒對超氧陰離子自由基清除能力的研究 超氧陰離子是人體代謝過程中產生的可以攻擊體內生物大分子、引起細胞結構和功能破壞的一種自由基,與人體的衰老病變密切相關[26]。如圖9所示,成品樹莓配制酒和抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除率與濃度呈線性相關,隨著稀釋倍數的增加迅速降低,在同一稀釋倍數下,樹莓配制酒對超氧陰離子自由基清除率高于抗壞血酸,其中樹莓配制酒的超氧陰離子自由基清除率77.5%,遠高于100 mg/L抗壞血酸的超氧陰離子自由基清除率,表明樹莓配制酒同樣具有很好的超氧陰離子自由基清除能力。

圖9 樹莓配制酒對超氧陰離子自由基的清除能力

3 結論與討論

根據樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定性分析,20 ℃以下的低溫、避光、密封保存可以使花青素以穩(wěn)定的結構存在于樹莓配制酒中,有利于樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定。由于樹莓配制酒的呈色物質主要是花青素,花青素在酸性條件下能保持穩(wěn)定狀態(tài),在不影響口感的情況下向樹莓配制酒中加入適量的蘋果酸和檸檬酸,有利于提高樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定性,而加入乙酸則會使樹莓色澤穩(wěn)定性降低；同時,溫度相對于其他條件而言對本酒的色澤穩(wěn)定性影響最大?？傊?為了保證樹莓配制酒的色澤穩(wěn)定,本酒適于在低溫、避光、密封條件下儲存,在利用有機酸進行勾調時避免使用乙酸。

經過對樹莓配制酒的體外抗氧化活性的測定,與100 mg/L的抗壞血酸相比,樹莓配制酒具有更高的DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基清除能力,其中DPPH自由基清除率最大為94.67%,羥基自由基的清除率最大為91.67%,超氧陰離子自由基清除率最大為77.5%,表明樹莓配制酒具有很好的抗氧化活性,具備能夠清除人體內自由基的能力。自由基或氧化劑會將細胞和組織分解,影響代謝功能,并會引起不同的健康問題,隨著生活水平的提高,具有抗氧化作用的酒引起人們重視,樹莓配制酒的抗氧化性較強、極具營養(yǎng)保健價值,因此具有廣闊的發(fā)展空間。本研究為后續(xù)優(yōu)化樹莓配制酒的護色工藝進而確定其他貯存條件奠定基礎,為進一步深入研究樹莓配制酒功效提供理論基礎。