荷花NnWRKY22 基因的克隆與表達分析

王婉茹，劉 瑩，劉紅利,2，賀 丹,2，劉藝平,2 ，孔德政,2

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種苗工程研究中心，河南 鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】荷花（Nelumbo nucifera）屬蓮科蓮屬，是我國傳統(tǒng)十大名花中唯一的水生花卉，具有重要的園林觀賞價值和經(jīng)濟價值，既可觀賞、藥用又可食用。隨著工農(nóng)業(yè)廢水的無節(jié)制排放，荷花的水生環(huán)境受到污染，Cu、Hg、Cr、Pb、Cd 等各類重金屬含量超標，其中Cu 的過量累積在水體污染中占據(jù)了很大比例[1]。荷花在銅脅迫下生長狀況受到影響[2]，導(dǎo)致葉片失綠、植株矮小等[3]，研究荷花抗銅脅迫的分子機制對提高荷花耐銅性有很大意義。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在荷花應(yīng)對銅脅迫中發(fā)揮著重要作用，因此對荷花WRKY 轉(zhuǎn)錄因子進行克隆和表達分析研究具有很大意義?！厩叭搜芯窟M展】WRKY 轉(zhuǎn)錄因子（TFs）是一個大的基因家族[4]，自甘薯WRKY 基因的首次報告以來[5]，來自廣泛植物物種的大量WRKY基因已被特征化并被證明參與生長、發(fā)育、代謝和對環(huán)境線索的響應(yīng)[6-10]。WRKY 蛋白通常包含1～2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域，這一段保守域序列為WRKYGQK加上一個C2H2 或C2HC 的長約60 個氨基酸的鋅指基序的區(qū)域[11,12]。大量的研究證明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在與植物防御相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控反應(yīng)中有著重要的作用，通過調(diào)節(jié)重金屬（鐵、鎘和鋁）的螯合和轉(zhuǎn)運以及減少二次氧化損傷，應(yīng)對過量的重金屬（鐵、鎘和鋁）脅迫[13]。AtWRKY46 基因突變體顯示出蘋果酸分泌增加，根尖中鋁的積累減少，從而提高了鋁的抗性[14]。AtWRKY13 通過直接激活A(yù)tPDR8表達并減少鎘積累來賦予鎘耐受性[15]。AtWRKY12 通過谷胱甘肽依賴性植物螯合素合成途徑負調(diào)控鎘的耐受性[16]。【本研究切入點】荷花的水生環(huán)境重金屬污染嚴重，銅是重金屬污染的主要成分，關(guān)于荷花抗銅脅迫的研究較少；WRKY 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物各類防御調(diào)控，荷花WRKY 基因的克隆及抗銅脅迫的研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于荷花銅脅迫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，克隆荷花NnWRKY22基因，對克隆出的氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析以及在荷花不同組織的表達模式和銅脅迫處理下的表達量變化分析，以期為進一步探索荷花NnWRKY22的基因功能和該基因參與抗銅脅迫的機制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試荷花品種艷陽天購自河南荷韻花卉有限公司，栽植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三生活區(qū)試驗基地，取完全開放的荷花內(nèi)輪花瓣、幼嫩根、新生嫩葉和莖液氮速凍后存于-80 ℃，用于基因不同組織表達模式分析。待荷花培養(yǎng)到長勢基本一致時，用課題組黃志遠[17]篩選出的 400 mg·kg-1CuSO4·5H2O對荷花進行0、7、14 d 的銅脅迫處理，3 個重復(fù)。取0、7、14 d 銅處理后的荷花葉片樣品液氮速凍并于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于目的基因抗銅脅迫下的相對表達量分析。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA 的提取和cDNA 的合成 于-80 ℃超低溫冰箱取荷花艷陽天冷凍葉片液氮研磨，采用改良CTAB 法提取荷花葉片總RNA。用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（RR047A，Takara，大連）合成cDNA。

1.2.2 荷花NnWRKY22 基因的克隆 通過實驗室荷花艷陽天抗銅基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得WRKY22基因序列，根據(jù)序列設(shè)計ORF 段全長引物NnWRKY22-F、NnWRKY22-R（表1）。采用擎科生物的1.1×T3 Super PCR Mix 對荷花艷陽天cDNA 進行PCR 擴增，設(shè)置程序：預(yù)變性98 ℃ 2 min；變性98 ℃ 10 s，退火58 ℃10 s，延伸72 ℃ 6 s，35 個循環(huán)；終延伸72 ℃ 2 min；4 ℃保溫。將PCR 產(chǎn)物進行跑膠驗證，驗證正確的條帶用天根試劑盒進行膠回收，連接 pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化Top10 大腸桿菌，進行菌液驗證，挑取陽性克隆送至上海生工測序比對。

1.2.3 荷花NnWRKY22 基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI CDD（Conserved domain database）數(shù)據(jù)庫對NnWRKY22 結(jié)構(gòu)域進行分析，使用ProtParam 進行蛋白質(zhì)特性分析，TMHMM 預(yù)測NnWRKY22 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，Signal IP 預(yù)測信號肽結(jié)構(gòu)，SOPMA 工具預(yù)測NnWRKY22 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，NetPhos 3.1 分析磷酸化位點，MEGAX 軟件（Neighbor-Joining，Bootstrap 1000）進行系統(tǒng)進化分析和進化樹構(gòu)造。

1.2.4 荷花NnWRKY22 基因的表達模式分析 為了研究NnWRKY22 在荷花根、莖、葉、花中的表達模式，使用 Primer Premier 5 設(shè)計特異引物qRT-NnWRKY 22-F、qRT-NnWRKY22-R（表1）進行熒光定量PCR分析，選取18S rRNA（表1）為內(nèi)參，用TB Green?Premix Ex Taq? II（RR820A，Takara，大連）試劑盒對CuSO4·5H2O（400 mg·kg-1）處理0、7 和14 d 荷葉的cDNA 樣本進行qRT-PCR 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷花NnWRKY22 基因的克隆

以荷花銅脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測出的WRKY22 基因序列設(shè)計引物，荷花葉片的cDNA 為模板進行RT-PCR擴增，得到一條的573 bp 大小的清晰條帶（圖1）。結(jié)果表明成功克隆出了荷花NnWRKY22 基因，該基因序列含有一個高度保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域，共編碼190 個氨基酸（圖2）。

圖1 NnWRKY22 基因PCR 擴增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of NnWRKY22 gene

圖2 NnWRKY22 基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acids of NnWRKY22

2.2 荷花NnWRKY22 生物信息學(xué)分析

對荷花NnWRKY22 基因進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白分子量、等電點分別為21.33 kDa 和9.03；不穩(wěn)定系數(shù)、親水性平均系數(shù)分別為71.93、0.69，推測為不穩(wěn)定的親水性蛋白。由工具分析可知該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)以及信號肽結(jié)構(gòu)；二級結(jié)構(gòu)主要包括無規(guī)則卷曲和α-螺旋，其中無規(guī)則卷曲占比為70.00%；α-螺旋為17.89%；β-折疊占比3.16%。結(jié)構(gòu)域分析表明，NnWRKY22 蛋白特定匹配在WRKY，屬于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子超家族（圖3）。磷酸化位點預(yù)測該蛋白含有27 個磷酸修飾位點，包括絲氨酸（Serine）和蘇氨酸（Threonine）位點各13 個，酪氨酸（Tyrosine）位點1 個（圖4）。另外該蛋白的酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）和堿性氨基酸殘基（Lys+Arg）數(shù)量分別為17 和21，脂肪族指數(shù)為62.16。

圖3 NnWRKY22 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 3 The analysis of conserved domain for NnWRKY22 protein

圖4 NnWRKY22 磷酸化位點預(yù)測Fig. 4 Predicted phosphorylation site of NnWRKY22

通過Blast 網(wǎng)站對荷花WRKY22 氨基酸序列進行在線比對，選取12 個物種的WRKY 氨基酸序列進行多重序列比對和進化樹構(gòu)建。進化樹結(jié)果表明荷花（Nelumbo nucifera）、洛 磯 山 耬 斗 菜（Aquilegia coerulea）和博落回（Macleaya cordata）在同一分支上，水青樹（Tetracentron sinense）和藍果樹（Nyssa sinebsis）聚為一支，其余8 個物種聚為一支（圖5）。

圖5 NnWRKY22 與其他植物同源WRKY 蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree on NnWRKY22 and WRKY proteins of other plants

2.3 荷花NnWRKY22 基因的表達分析

qRT-PCR 結(jié)果表明，在荷花品種艷陽天根、莖、葉和花中均能檢測到NnWRKY22 基因的表達，但其表達量存在明顯差異。NnWRKY22 基因在荷花的根中的相對表達量最高，在荷花的花中表達量最低，其中在根、莖和葉的表達量分別是在花中的16.5倍、3.3 倍和3 倍（圖6）。

圖6 NnWRKY22 在荷花不同組織中的相對表達量Fig. 6 Relative expressions of NnWRKY22 in lotus tissuesThe same as Fig.7.

分析400 mg·kg-1硫酸銅處理下NnWRKY22 基因表達量隨時間的變化，結(jié)果表明處理7 d 時荷葉中NnWRKY22 的相對表達量顯著上升并到達最高值，相比對照組上升了3.4 倍；處理14 d 時表達量相比處理7 d 下降了19.5%，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（P＜0.01），在銅脅迫7 d 時NnWRKY22 基因的表達量到峰值，之后開始下降（圖7）。

圖7 銅脅迫下NnWRKY22 的相對表達量Fig. 7 Relative expressions of NnWRKY22 under copper stress

3 討論與結(jié)論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族在植物應(yīng)對逆境方面發(fā)揮著重要作用，它們在調(diào)節(jié)植物生長、植物發(fā)育以及生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵性作用[10,18-19]。水稻OsWRKY22 與核心轉(zhuǎn)錄因子ART1 共同作用于OsFRDL4表達和檸檬酸鹽分泌的正調(diào)控，從而促進水稻耐鋁性[20]；番茄SlWRKY6在抗CdCl2、CuCl2、HgSO4 脅迫中發(fā)揮重要作用[21]；水稻OsWRKY15 通過NO、ABA 等信號途徑參與鎘脅迫[22]；WRKY46 作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在擬南芥鋁脅迫條件下負性調(diào)節(jié)ALMT1 的表達[14]。以上結(jié)果表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物抗重金屬脅迫方面發(fā)揮著重要作用，廣泛參與了植物抗重金屬脅迫的應(yīng)答機制。

本研究從荷花品種艷陽天中克隆得到NnWRKY22基因，該基因序列ORF 段序列長度為573 bp，編碼的氨基酸數(shù)量為190。通過序列比對和進化樹分析得出，荷花（Nelumbo nucifera）與洛磯山耬斗菜（Aquilegia coerulea）和博落回（Macleaya cordata）的親緣關(guān)系較近。荷花NnWRKY22 氨基酸序列含有一個高度保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域，表示NnWRKY22屬于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子超家族。蛋白特性分析表明荷花NnWRKY22 屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，這與前人在番茄SlWRKY6和梅花PmWRKY2[23]得出的結(jié)論相同。大量研究表明，WRKY 在植物不同組織的表達具有特異性，杉木ClWRKY44 基因主要在杉木嫩葉中表達[24]，菊花CmWRKY13[25]基因在根中表達量最高，枇杷EJWRKY27[26]在根中高表達。本研究中NnWRKY22 在荷花中的表達也具有組織特異性，在根中表達量最高，花中表達量最低。推測該基因主要通過荷花根部發(fā)揮NnWRKY22 基因功能，參與荷花抗銅脅迫。通過課題組前期對銅脅迫荷花品種艷陽天的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可知[17]，NnWRKY22 是參與銅脅迫的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可能在抗銅脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)荷花中的NnWRKY22 基因在銅脅迫下被誘導(dǎo)表達，在高濃度銅處理7d 表達量到達峰值，說明NnWRKY22 參與了荷花抗銅脅迫的應(yīng)答機制，在荷花抗銅過程中發(fā)揮著重要作用，為荷花抵抗銅脅迫提供了新的候選基因。