CsZFP2 基因的克隆及其在煙草中的抗旱功能分析

李婉雪，姚新轉(zhuǎn)，張寶會(huì)，劉 洋

（1.貴州大學(xué)茶學(xué)院,貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心,貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】植物在生命周期中會(huì)受到如水澇、干旱、冷害等非生物脅迫，影響其生長(zhǎng)發(fā)育。煙草是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物之一，良好的生態(tài)環(huán)境能讓煙草正常生長(zhǎng)發(fā)育，產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)良的煙葉，然而在煙草生長(zhǎng)過程中會(huì)遭受多種逆境脅迫，影響其產(chǎn)量。在以往研究中發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白（zinc finger protein）屬于III 型轉(zhuǎn)錄因子，它廣泛分布于生物體內(nèi)，是調(diào)控諸多生理生化反應(yīng)的一類核酸蛋白，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)。因此本研究克隆了茶樹中CsZFP2 基因并對(duì)該蛋白的組織特異表達(dá)及干旱脅迫下的基因表達(dá)進(jìn)行分析，為研究CsZFP2 基因?qū)Ω珊淀憫?yīng)及抗旱分子機(jī)理研究提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類黃酮是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，它作為重要的活性物質(zhì)，具有抗氧化、心血管保護(hù)等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品等行業(yè)。在以往研究中發(fā)現(xiàn)，類黃酮3′,5′-羥化酶（flavonoid 3′,5′hydroxylase,F3′5′H）是茶樹類黃酮生物的催化酶之一，以影響花色而出名，但B環(huán)的羥基化程度和部位與類黃酮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、抗氧化功能有著密切關(guān)系[1]。所以類黃酮在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抵御逆脅迫等方面發(fā)揮重要功能[2]。外界環(huán)境條件影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，植物為了適應(yīng)外界的逆境條件，進(jìn)化出了一系列生理及分子響應(yīng)機(jī)制[3-5]，調(diào)節(jié)植物的生理生化、蛋白及基因等各方面。高溫、高鹽、干旱等非生物脅迫會(huì)影響煙草的正常生長(zhǎng)發(fā)育，干旱脅迫使煙草葉片脫水變枯，嚴(yán)重影響其品質(zhì)成分的積累，降低經(jīng)濟(jì)效益。而脅迫響應(yīng)可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實(shí)現(xiàn)，在干旱脅迫環(huán)境下，提高抗氧化系統(tǒng)活性，清除細(xì)胞內(nèi)過量的自由基和過氧化物，抑制膜脂質(zhì)過氧化和保護(hù)細(xì)胞細(xì)胞膜的完整性。對(duì)與F3′5′H 基因啟動(dòng)子區(qū)域互作的鋅指蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)生物信息學(xué)分析和相關(guān)功能驗(yàn)證，預(yù)測(cè)可能參與了高溫、高鹽、干旱等逆境響應(yīng)，將鋅指蛋白轉(zhuǎn)入煙草后增強(qiáng)煙草的耐旱性，有利于進(jìn)一步闡明鋅指蛋白基因表達(dá)模式，為培育抗逆性強(qiáng)的煙草奠定基礎(chǔ)。鋅指蛋白基因家族是植物最大的基因家族之一[6]，其特征為鋅指域由半胱氨酸和組氨酸結(jié)合鋅離子形成[7]。鋅指蛋白（ZFPs）在生理和生物化學(xué)過程中具有重要的作用，其中就包括非生物脅迫[8]。在逆境脅迫方面已有一些報(bào)道，例如，剛毛怪柳（Tamarix hispida）中鋅指蛋白ThZFP1 在擬南芥中過表達(dá)，增加了POD 和SOD 活性、脯氨酸含量，增加了相關(guān)基因如P5CS、SOD 和POD 的表達(dá)，最終增加了對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的抗性[6]。水稻中轉(zhuǎn)錄因子ART1通過影響鋁脅迫相關(guān)基因的表達(dá)增加水稻對(duì)鋁脅迫的抗性[9]；在干旱脅迫下，ZFP245 的過表達(dá)增強(qiáng)了SOD 和POD 的活性，表明ZFP245 可能通過激活植物體內(nèi)的酶活活性，從而提高水稻的耐旱性[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有研究結(jié)果表明鋅指蛋白能夠調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)非生物脅迫，然而關(guān)于茶樹鋅指蛋白的研究有待深入進(jìn)行?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)CsZPF2 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其潛在分子功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CsZPF2基因轉(zhuǎn)入煙草，進(jìn)行干旱脅迫下的功能驗(yàn)證，觀察自然干旱后煙草的變化，進(jìn)一步了解茶樹鋅指蛋白在煙草中的抗旱機(jī)理，為后續(xù)培育耐旱煙草新種質(zhì)和進(jìn)一步研究超量表達(dá)CsZPF2 煙草對(duì)干旱脅迫耐受機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為煙草（Nicotiana tabacun'Xanthin'）。

1.2 基因克隆與載體構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中已通過酵母單雜篩選出一個(gè)與F3′5′H 基因啟動(dòng)子區(qū)域互作的鋅指蛋白，首先利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)CsZPF2目的基因引物，以cDNA 的第一鏈為模板，克隆目的基因保守片段，獲得擴(kuò)增的目的基因后，以酶切PCR 產(chǎn)物為模板，質(zhì)粒用SalI、SacI 雙酶切，回收連接，將目的基因正向和反向整合到載體的啟動(dòng)子和終止子之間，構(gòu)建超量表達(dá)載體（圖1）。

圖1 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)載體Fig. 1 Overexpression vector of ZFP transcription factor

1.3 鋅指蛋白cDNA 編碼產(chǎn)物同源序列比對(duì)分析

在 NCBI 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索出不同物種的鋅指蛋白，并與CsZFP2鋅指蛋白序列排列比較（DNAMAN,MegAlign Program,Clustal W method）。利用DNAMAN 軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及分子鑒定

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化至煙草葉片，取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)好的煙草無菌苗,切成方片，置于農(nóng)桿菌溶液中侵染8～10 min，將侵染的葉片取出,用無菌濾紙將農(nóng)桿菌菌液吸干,置于共培培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2 d 后接種在含有Kan 抗生素培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，再置于無菌培養(yǎng)室25 ℃光照培養(yǎng),每2 周繼代1 次,30 d 后觀察茶樹愈傷生長(zhǎng)情況。

以實(shí)驗(yàn)室無菌苗作為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法[11]進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。待移栽植株成活后剪取葉片進(jìn)行β-葡糖苷酶（β-glucosidase,GUS）組織化學(xué)染色，利用CsZFP2 序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，初步鑒定完畢后再?gòu)闹仓耆~片中提取基因組DNA 用于PCR鑒定。

1.5 qRT-PCR

提取自然干旱條件下脅迫處理前、后的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草葉片總RNA，將反轉(zhuǎn)后得到的cDNA 作為模板。根據(jù)CsZFP2基因序列，設(shè)計(jì)qRTPCR 擴(kuò)增引物，通過qRT-PCR 分析相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)序列：

F：GGAGCCCTTCAGACATCAATTA；

R：CTGCACAAGAACTGCCAAAC。

內(nèi)參對(duì)照為煙草 β -actin 基因，

F：5'-TGGTTAAGGCTGGATTTGCT-3'；

R：5'-TGCATCCTTTGACCCATAC-3'。

qRT-PCR 擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參考劉洋[12]，每個(gè)基因設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.6 煙草的干旱脅迫處理

選取5～6 葉期（煉苗移栽后15 d）、長(zhǎng)勢(shì)及大小一致的轉(zhuǎn)基因及野生型植株為材料，進(jìn)行自然干旱處理，分別于處理后的0、7、14、21、28 d 剪取煙草葉片，所有樣品均放入液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱備用。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)各平均值差異性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS 22.0 軟件包完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹ZPF 基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

通過搜索比對(duì)，將候選基因提交到ExPASy、NCBI 等在線網(wǎng)站驗(yàn)證其保守域的結(jié)構(gòu)，最終得到11 個(gè)物種的鋅脂蛋白基因，進(jìn)一步分析該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（表1），結(jié)果顯示：11 個(gè)物種的鋅指蛋白基因有5 個(gè)可以定位在染色體上，其余6 個(gè)物種尚不清楚，他們的內(nèi)含子數(shù)相似，最少11 個(gè)，最多14 個(gè)，其中大多數(shù)物種有13 個(gè)內(nèi)含子數(shù)；蛋白長(zhǎng)度最短的物種為獼猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis）1 202 aa，最長(zhǎng)為灰山杜鵑（Rhododendron griersonianum）、筍 瓜（Cucurbita maxima）、南瓜（Cucurbita moschata）1 256 aa，理論等電點(diǎn)(pI)介于5.62 獼猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis）～5.97 南瓜（Cucurbita moschata）之間，發(fā)現(xiàn)11 個(gè)物種的ZPF 基因Pi＜7，表明這11 個(gè)物種鋅指蛋白富含酸性氨基酸。

表1 11 個(gè)物種鋅指蛋白基因的特征Table 1 Characteristics of ZFP genes in 11 species

2.2 CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)CsZPF2 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CsZPF2編碼蛋白質(zhì)具有51.34% α-螺旋，37.39%無規(guī)則卷曲，7.95% 延伸鏈，3.33% β-轉(zhuǎn)角，說明 螺旋為CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2）。利用Phyre2 在線軟件構(gòu)建CsZPF2三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3），分析預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角組成無規(guī)則卷曲的三維空間結(jié)構(gòu)。

圖2 CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Predicted secondary structure of CsZPF protein

圖3 茶樹ZPF2 編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 3 Predicted tertiary structure of CsZPF protein

2.3 蛋白質(zhì)親疏水性分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

對(duì)CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析（圖4）。其中大于零部分多于50%為疏水性蛋白，小于零部分多于50%為親水性蛋白，結(jié)果表明，CsZPF2 編碼蛋白為親水性蛋白。通過Cell-PLoc 2.0軟件預(yù)測(cè)CsZPF 編碼蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核。

圖4 CsZPF2 編碼蛋白質(zhì)序列的親疏水性分析Fig. 4 Hydrophilicity and hydrophobicity of CsZPF2 protein sequence

2.4 CsZPF2 基因序列同源比對(duì)及進(jìn)化樹分析

將CsZPF2 的cDNA 序列進(jìn)行Blastx 分析，結(jié)果顯示，11 個(gè)不同物種植株中鋅指蛋白都有很高的同源性，其中茶樹（Camellia sinensis，XM_028257969.1）鋅指蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)域與灰山杜鵑（Rhododendron griersonianum，KAG5536119.1）的鋅指蛋白相似性為 85%，與獼猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis，PSR84926.1）的鋅指蛋白相似性為82.82%，與甜櫻桃（Prunus avium，XP_021810862.1）的鋅指蛋白相似性為73.60%,與水蜜桃（Prunus persica，ONI09200.1）的鋅指蛋白相似性為73.30%，杏花（Prunus armeniaca，CAB4311713.1）的鋅指蛋白相似性為73.00%，與筍瓜（Cucurbita maxima，XP_023002699.1）的鋅指蛋白相似性為71.20%，與煙草（Nicotiana tabacum，XP_016463943.1）的鋅指蛋白相似性為68.57%。選取同源性比較高的物種氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，在進(jìn)化過程中鋅指蛋白基因與獼猴桃和灰山杜鵑有較高的同源性（圖5、6）。

圖5 茶樹鋅指蛋白與其他物種的蛋白質(zhì)序列同源比對(duì)Fig. 5 Homologous analysis on ZPF protein sequences of various species

2.5 干旱處理對(duì)轉(zhuǎn)CsZPF2 基因煙草的影響

本研究對(duì) 5～6 葉期的煙草進(jìn)行了自然干旱脅迫處理，將長(zhǎng)勢(shì)一致的野生煙草及轉(zhuǎn)基因煙草移栽至室外，相同條件下自然干旱28 d 后，觀察其表型。在干旱28 d 后，兩組材料底部葉片均明顯發(fā)黃，但野生型煙草底部葉片基本完全失綠，呈枯萎狀態(tài)，而轉(zhuǎn)基因煙草底部葉片呈輕度萎蔫狀態(tài)，大部分仍然呈現(xiàn)綠色。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性優(yōu)于野生型煙草（圖7）。

圖6 茶樹鋅指蛋白與其他物種鋅指蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 6 Phylogenetic relationship between ZFP of C.sinensis and other species

圖7 干旱脅迫對(duì)煙草植株生長(zhǎng)的影響Fig. 7 Effect of drought stress on growth of tobacco plants

3 討論與結(jié)論

鋅指蛋白普遍存在于植物中，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及非生物應(yīng)答等多種生命過程中有重要作用。在水稻中鑒定出一組A20/AN1 類型鋅指蛋白，包括ZFP157 基因能夠誘導(dǎo)低溫、干旱及鹽脅迫[13]。在煙草中過表達(dá)ZFP177 能夠提高煙草對(duì)高溫及低溫的抗性[14]。在擬南芥中過表達(dá)AtSAP5 基因能夠提高擬南芥的抗旱性[15]。植物在干旱的逆境脅迫中，SAP類鋅指蛋白部分成員的抗旱功能在水稻及擬南芥等多個(gè)物種中得到了驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中通過酵母單雜篩選出一個(gè)與F3′5′H 基因啟動(dòng)子區(qū)域互作的鋅指蛋白，從茶樹中克隆到一個(gè)鋅指蛋白基因，將命名為CsZPF2，該基因CDS 全長(zhǎng)為4 269 bp，蛋白編碼長(zhǎng)度為1 233 aa，具有保守的A20 與N1 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。鋅指蛋白基因在獼猴桃和灰山杜鵑中具有相應(yīng)同源基因且同源性較高，預(yù)測(cè)CsZPF2 編碼蛋白是親水性且為酸性蛋白，α 螺旋為蛋白主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。茶樹（Camellia sinensis）鋅指蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)域與灰山杜鵑（Rhododendron griersonianum）的鋅指蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性為85%。煙草中過表達(dá)ZFP177基因煙草對(duì)干旱脅迫更敏感，表明ZFP177 可能提高煙草對(duì)干旱的抗性[16-20]。野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草在經(jīng)過28 d 自然干旱脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比更具耐旱性，驗(yàn)證了該基因在煙草抗旱的生理過程中發(fā)揮功能。

本研究從茶樹中克隆到一個(gè)CsZPF2 基因，其具有保守的 A20 與 N1 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。CsZPF2 基因在多個(gè)物種中具有相應(yīng)同源基因，在栽培煙草三星中CsZPF2 基因的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草呈現(xiàn)出抗旱表型，表明該基因參與煙草抗旱早期應(yīng)答的調(diào)控過程且能夠增強(qiáng)煙草抵抗干旱脅迫能力。目前,對(duì)于茶樹鋅指蛋白的研究尚處于基因克隆、結(jié)構(gòu)鑒定與表達(dá)分析等層面上，本研究表明過表達(dá)CsZPF2 基因能夠提高煙草的抗旱能力,并且從生物學(xué)功能方面驗(yàn)證了CsZPF2 基因在煙草抗旱方面的功能,對(duì)利用轉(zhuǎn)錄因子提高作物的抗逆性提供重要的參考價(jià)值，為作物逆境脅迫提供了重要候選基因,為培育抗旱煙草新品種提供參考。