日糧中添加蘆丁對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌菌群多樣性及其組成的影響

王海波，占今舜，谷志勇,3，劉宇航，霍俊宏 ，趙生國(guó)

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

0 引言

【研究意義】反芻動(dòng)物精巧的胃腸發(fā)酵系統(tǒng)（瘤胃或瘤-網(wǎng)胃）能夠維持胃腸功能，并發(fā)酵、轉(zhuǎn)化植物性飼料，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（VFA）、甲烷氣體等[1-2]。研究蘆丁對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌菌群多樣性及組成的調(diào)控，對(duì)促進(jìn)反芻動(dòng)物對(duì)植物性飼料的利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】體外發(fā)酵試驗(yàn)表明，沙棘黃酮可以提高微生物對(duì)氮代謝、糖代謝的能力，降低產(chǎn)甲烷菌、瘤胃球菌、原蟲的數(shù)量[3]。而且，黃酮類化合物能增強(qiáng)抗氧化能力，改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能[4-6]，并能通過影響DNA 和RNA 的合成抑制微生物繁殖，降低瘤胃微生物的數(shù)量[7-8]；還可直接作用瘤胃產(chǎn)甲烷菌，抑制CH4產(chǎn)生，提高能量利用率[9]。蘆?。ㄊ|香苷、維生素P）作為一種廣泛存在于植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中的黃酮類提取物，不僅可當(dāng)作治療藥物，還能作為保健品，在呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、免疫保護(hù)等方面發(fā)揮功能[6]，具有改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、提高瘤胃代謝和消化能力的作用[10]。蘆丁經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)或微生物降解生成槲皮素等代謝產(chǎn)物，發(fā)揮抗氧化、抗菌、抗病毒和保護(hù)腎、肝臟及胃腸道黏，促進(jìn)免疫器官發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[11-12]的功能。研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠抑制對(duì)綠膿桿菌、變形桿菌等的生長(zhǎng)[6]，并通過瘤胃代謝影響微生物的定植[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組成員占今舜等[14]在日糧中添加蘆丁對(duì)湖羊生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、激素水平及瘤胃發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠改善湖羊生長(zhǎng)性能，調(diào)控纖維素、蛋白質(zhì)降解效率，影響瘤胃發(fā)酵。然而有關(guān)日糧中添加蘆丁對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌菌群多樣性及其組成的影響有待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過高通量測(cè)序探究在日糧添加蘆丁對(duì)湖羊瘤胃細(xì)菌菌群多樣性及組成的影響，為后續(xù)研究蘆丁在湖羊中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蘆丁購(gòu)自寧波玉健醫(yī)藥有限公司（浙江，寧波），提取自槐米（Sophora japonicaL.），純度≥95%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇3 月齡左右、健康且體重相近的湖羊36 只，隨機(jī)分為3 個(gè)處理，每個(gè)處理12 只湖羊（公母各半，分欄飼養(yǎng)）。對(duì)照組（CON 組）飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組R50 和R100 分別在基礎(chǔ)日糧中按照湖羊體重分別添加50 和100 mg·kg-1的蘆丁，試驗(yàn)期為70 d（預(yù)試期14 d，正試期56 d）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及管理

試驗(yàn)于2019 年8～10 月在江西省贛州市綠林灣農(nóng)牧有限公司湖羊養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場(chǎng)的規(guī)定執(zhí)行，每天飼喂2 次，分別在8：30 和17：30 進(jìn)行飼喂，羊只自由采食，飲水，隔天早上稱取余料。

1.4 基礎(chǔ)日糧

參考我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816—2004）配制基礎(chǔ)日糧。其中精料組成及營(yíng)養(yǎng)水平在前期占今舜等[14]的研究中進(jìn)行了詳細(xì)的描述（消化能為13.39 MJ·kg-1、粗蛋白為20.06%、中性洗滌纖維為23.24%、酸性洗滌纖維為13.78%、鈣為0.66%、磷為0.45%）。日糧中精料和粗料按照質(zhì)量比6∶4 先后分開飼喂。粗料為鍘碎的紫象草（干物質(zhì)中含10.98%的粗蛋白質(zhì)、2.90%的粗脂肪、14.07%的粗灰分、61.23%的中性洗滌纖維為和34.67%的酸性洗滌纖維）。

1.5 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 瘤胃液采集 試驗(yàn)結(jié)束后，選擇各處理組中平均體重接近[對(duì)照組、R50 和R100 的平均體重分別 為（29.63±0.63）kg、（30.80±0.84）kg 和（29.93±0.89）kg]的湖羊（公羊）4 只快速屠宰取出瘤胃，并將瘤胃內(nèi)容物經(jīng)4 層紗布過濾，分裝于5 mL 凍存管放入液氮速凍后-80 ℃保存，用于細(xì)菌總DNA 提取。

1.5.2 瘤胃液微生物 DNA 的提取、測(cè)序以及分析湖羊瘤胃液中總DNA 提取送至蘇州金唯智生物科技有限公司，參照試劑盒說明進(jìn)行細(xì)菌總DNA 提取，并使用Qubit?dsDNA HS Assay Kit 檢測(cè)DNA 濃度。以20～30 ng 的DNA 為模板，使用設(shè)計(jì)PCR 引物（F：CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT，R：GG ACTACNVGGGTWTCTAATCC）擴(kuò)增原核生物16S rRNA 基因V3～V4 的2 個(gè)高度可變區(qū)。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按Illumina MiSeq（Illumina,San Diego,CA,USA）儀器使用說明書進(jìn)行雙端測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果原始圖像數(shù)據(jù)利用軟件Bcl2fastq（v2.17.1.14）進(jìn)行圖像堿基識(shí)別，質(zhì)量分析，得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)通過Qiime 1.9.1軟件進(jìn)行拼接，使用Cutadapt 1.9.1 和Vsearch 1.9.6軟件去除低質(zhì)量序列和嵌合體進(jìn)行優(yōu)化得到有效數(shù)據(jù)。使用Vsearch 1.9.6 在相似性97%的水平上進(jìn)行聚類成為OTUs（Operational taxonomic units），以Silva_132 16S rRNA database（http://www.arb-silva.de/）為參考，利用RDP classifier 2.2（Ribosomal Database Program）貝葉斯算法對(duì)OTU 的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析。通過軟件 Qiime 1.9.1 對(duì)檢測(cè)樣品a多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。經(jīng)Qiime 1.9.1 和R 語(yǔ)言作圖，基于Brary-Curtis 距離矩陣，進(jìn)行PCoA 作圖分析；基于beta 多樣性距離矩陣，用R 語(yǔ)言進(jìn)行NMDS 作圖，并采用UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）聚類方法進(jìn)行樣本聚類。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013 初步整理后，采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU 分析和物種注釋

本試驗(yàn)中12 個(gè)樣品平均每個(gè)樣品測(cè)得 103 929條原始PE reads，經(jīng)過質(zhì)量?jī)?yōu)化平均獲得90 653 條有效序列，其平均長(zhǎng)度為453 bp，有效序列獲取率為87.39%。以97%的一致性對(duì)瘤胃微生物進(jìn)行OTUs 聚類繪制Venn 圖（圖1）可知，共得到446 個(gè)OTU。其中，3 個(gè)處理組共享396 個(gè)OTU，占總OTU 數(shù)的88.79%。同時(shí)，CON 組和R50 組共享416 個(gè)OTU，CON組和R100組共享404個(gè)OTU，R50 組 和R100 組共享402 個(gè)OTU。且CON 和R50 組分別特有15 個(gè)、1 個(gè)OTU。其中，CON 組主要以擬桿菌門的3 個(gè)菌屬，分別為uncultured_rumen_bacterium（OTU83、OTU48、OTU213、OTU396、OTU397 和OTU417）、普雷沃菌屬_1（OTU438、OTU84、OTU422和OTU425）及理研菌科_RC9_gut_group（OTU51）為主。通過以Silva 132 為參考數(shù)據(jù)庫(kù)，利用 RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)OTU 的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，所有樣品共注釋了14 個(gè)門（Phylum）、18 個(gè)綱（Class）、21 個(gè)目（Order）、34 個(gè)科（Family）和99 個(gè)屬（Genus）。通過對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU 的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線（圖2）可知，隨著測(cè)序深度的增加，OTU 的數(shù)量先增加最后趨向平坦，持續(xù)抽樣新物種出現(xiàn)的速率降低，檢測(cè)到的OTU 數(shù)目不再增加，測(cè)序數(shù)據(jù)量較為合理。

圖1 OTUs 分布維恩圖Fig. 1 Venn diagrams of OTU distribution

圖2 OTUs 的稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of OTUs

2.2 Alpha 多樣性分析

日糧中添加蘆丁對(duì)瘤胃液微生物Alpha 多樣性的影響見表1。由表可知1，日糧中添加蘆丁顯著影響瘤胃液微生物Alpha 多樣性。相比較CON 組和R50 組，R100 組ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。R100 組Chao1 指數(shù)與CON 組相比顯著降低（P＜0.05），與R50 組無(wú)顯著差異。同時(shí)，CON組和R50 組Alpha 多樣性均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 瘤胃液細(xì)菌群Alpha 多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis on microbial community in rumen fluid

2.3 Beta 多樣性分析

基于Brary-Curtis 距離矩陣的PCoA 作圖分析（圖3）可知，PC1 和PC2 對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)率分別為21.48%和20.00%，且樣本點(diǎn)的距離越近，相似度越高。NMDS 分析可知，不同樣本間的差異程度通過點(diǎn)間的距離體現(xiàn)，由圖4 可知，Stress＜0.097，表明NMDS 可以準(zhǔn)確反映樣本間的差異程度。由PCoA分析（圖3）、NMDS 分析（圖4）和UPGMA 聚類方法（圖5）可知，R100 組與CON 和R50 組在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在差異，而CON 和R50 組群落組成相似。Anosim 分析結(jié)果見圖6。圖6 中a（R=0.156，P=0.223）、b（R=0.417，P=0.064）和c（R=0.469，P=0.035）中的R值逐漸增大，表明日糧中添加蘆丁能夠影響微生物結(jié)構(gòu)分布，且R50 與R100 兩組之間存在顯著差異（P＜0.05），CON 組和R50 組之間、CON和R100 組之間無(wú)顯著差異。

圖3 主坐標(biāo)分析Fig. 3 Principal coordinate analysis

圖4 非度量多維標(biāo)定法Fig. 4 Non-metric multi-dimensional scaling

圖5 湖羊瘤胃微生物UPGMA 聚類方法Fig. 5 UPGMA on microbes in rumen of Hu sheep

圖6 湖羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)Anosim 分析Fig. 6 Anosim analysis on microbial community structure in rumen of Hu sheep

2.4 湖羊瘤胃液中微生物群落組成

日糧中添加蘆丁對(duì)湖羊瘤胃液中微生物在門和屬水平的分布見表2～3。在門水平，由表2 可知：擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）兩大優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度超過88.31%，在CON 組分別占52.84%和35.47%，在R50 組分別占59.18%和31.56%，在R100 組分別占62.76%和29.67%。日糧中添加蘆丁在門水平顯著影響迷蹤菌門（Elusimicrobia）和髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）的相對(duì)豐度（P＜0.05）。相比CON 組，R100 組顯著提高Patescibacteria的相對(duì)豐度，降低Elusimicrobia 的相對(duì)豐度（P＜0.05），同時(shí)R50 組Elusimicrobia 的相對(duì)豐度顯著高于CON 組和R100 組（P＜0.05），其他各處理組之間在門水平均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在屬水平上，由表3 可知，CON 組、R50 組和R100 組優(yōu)勢(shì)菌屬均為普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）和理研菌科_RC9_gut_group（Rikenellaceae_RC9_gut_group），在CON 組分別占20.28%和12.16%，在R50 組分別占26.34%和11.05%，在R100 組分別占26.79%和18.60%。在已鑒定豐度排名前30 的菌屬中，日糧中添加蘆丁能顯著影響新月形單胞菌屬_1（Selenomonas_1）、琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、f__Bacteroidales_RF16_group_Unclassified和f__Lachnospiraceae_Unclassified的相對(duì)豐度。其中，與CON組相比，R100 組中Selenomonas_1、f__Bacteroidales_RF16 _group_Unclassified、Succiniclasticum的相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05），但與R50 組差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)，R100 組中f__Lachnospiraceae_Unclassified極顯著低于R50 組（P＜0.01）。其他各處理組之間在屬水平均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 蘆丁對(duì)湖羊瘤胃微生物相對(duì)豐度的影響（門水平）Table 2 Effect of rutin on microbial relative abundance in rumen of Hu sheep (at phylum level)（單位：%）

表3 蘆丁對(duì)湖羊瘤胃微生物相對(duì)豐度的影響（屬水平）Table 3 Effect of rutin on microbial relative abundance in rumen of Hu sheep (at genus level) （單位：%）

3 討論

瘤胃微生物主要由真菌、細(xì)菌和原蟲組成，通過高通量測(cè)序技術(shù)可以快速高效地了解群落的種類和結(jié)構(gòu)[15]，可通過α 和β 多樣性對(duì)微生物群落的多樣性進(jìn)行評(píng)估[16]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的OTU 數(shù)目大于添加蘆丁的試驗(yàn)組，添加蘆丁導(dǎo)致微生物多樣性降低。這可能是因?yàn)樘J丁作為黃酮類化合物，可引起DNA 和RNA 的合成，抑制微生物繁殖，降低瘤胃微生物的數(shù)量，并能改善瘤胃消化代謝及碳水化合物的發(fā)酵影響微生物群落的多樣性[7,8,13,15,17]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加50 mg·kg-1的蘆丁對(duì)瘤胃菌群的豐度及多樣性均無(wú)顯著性影響，但添加100 mg·kg-1的蘆丁顯著降低α 多樣性的ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)。通過PCoA、NMDS 和UPGMA 聚類方法對(duì)β 多樣性分析可知，添加100 mg·kg-1的蘆丁對(duì)瘤胃微生物群落有顯著的影響。日糧中添加50、100 mg·kg-1蘆丁不能改變瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群，這與前期研究發(fā)現(xiàn)瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群相一致[18-19]。其中，對(duì)照組、50 mg·kg-1蘆丁組和100 mg·kg-1蘆丁組中Bacteroidetes 和Firmicutes 占比與牦牛[20]、水牛[21]、蒙古羊[22]、湖羊[23]等反芻動(dòng)物瘤胃優(yōu)勢(shì)菌為Bacteroidetes 和Firmicutes 的結(jié)果相似。擬桿菌門是一類革蘭氏陰性菌，在核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等有機(jī)物的轉(zhuǎn)換和非纖維類碳水化合物的降解中發(fā)揮重要功能[15,24-25]。厚壁菌門中含有大量纖維素分解菌屬，主要促進(jìn)纖維的分解[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加50、100 mg·kg-1蘆丁能使瘤胃中的Firmicutes與Bacteroidetes 的比值較對(duì)照組分別降低20.56%和37.23%。變形菌門在腸道富集，容易引起炎癥或外源性病原體的入侵，造成微生物群落失衡[18,26]。同時(shí)，蘆丁對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等的生長(zhǎng)具有抑制作用[6]。日糧中添加50 和100 mg·kg-1蘆丁能使變形菌門的相對(duì)豐度較對(duì)照組分別降低71.55%，81.38%，有利于維持菌群的平衡，增強(qiáng)機(jī)體抵抗外源性病原體的入侵[18]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)添加100 mg·kg-1的蘆丁顯著提高Patescibacteria 豐度，降低Elusimicrobia 的相對(duì)豐度。但Elusimicrobia在胃腸中占比較低，其功能作用研究也鮮有報(bào)道，需進(jìn)一步探討。

日糧中添加50 和100 mg·kg-1蘆丁不會(huì)影響育肥湖羊瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬Prevotella_1和Rikenellaceae_RC9_gut_group分布，這一結(jié)果與孫美杰等[23]研究結(jié)果中育肥湖羊瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬的結(jié)果一致。Prevotella和Rikenellaceae_RC9_gut_group能夠促進(jìn)養(yǎng)分利用[20,27-28]。Prevotella_1 是Prevotella中主要的類群[29]，參與木聚糖發(fā)酵、半纖維素和果膠的降解以及蛋白質(zhì)和多肽的代謝及丙酸的生成[2,30]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，各處理組中Prevotella-1 占比最高，這與之前報(bào)道的瘤胃液中優(yōu)勢(shì)菌為普氏菌屬[20,31]的結(jié)果相一致，但添加50 和100 mg·kg-1BW 的蘆丁組Prevotella-1分別較對(duì)照組分別提高了29.39%和32.10%，這有利于促進(jìn)瘤胃發(fā)酵[2]。體外試驗(yàn)表明，蘆丁能夠提高飼料的降解率，降低CH4產(chǎn)量[32]。進(jìn)一步通過體內(nèi)試驗(yàn)證明蘆丁能提高瘤胃碳水化合物發(fā)酵效率和瘤胃細(xì)菌合成蛋白質(zhì)的能力，增加乙酸、丙酸和MCP 濃度[10]。以上結(jié)果表明，日糧中添加蘆丁有利于提高瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬Prevotella_1 的相對(duì)豐度，促進(jìn)瘤胃氮代謝及對(duì)相關(guān)代謝產(chǎn)物的吸收利用[2]。

4 結(jié)論

在本研究條件下，添加日糧中添加蘆丁能提高瘤胃液中擬桿菌門的相對(duì)豐度，降低瘤胃中厚壁菌門和變形菌門的相對(duì)豐度。添加100 mg·kg-1的蘆丁能影響瘤胃微生物的α 多樣性和β 多樣性，并顯著降低月形單胞菌屬和琥珀酸屬的相對(duì)豐度。