蒙藥三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS快速分析與鑒定

李君 胡玉霞 張夢(mèng)迪 王躍武 張謙 胡格吉胡 高峰 常福厚

關(guān)鍵詞蒙藥;三子散;高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜;成分組成;結(jié)構(gòu)鑒定

三子散系蒙古族經(jīng)典名方，收載于2020 年版《中國(guó)藥典》（一部），由訶子、川楝子、梔子3 味藥材按1 ∶1 ∶1 配比組成[1]。該方具有清血熱、解毒等功效，將其制成糊狀外用還具有收斂、止痛、消炎的作用，蒙醫(yī)臨床用于溫?zé)?、血熱、眩暈、新久熱等疾病的治療[2]?，F(xiàn)有研究表明，三子散所含化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等[3]，但其在疾病治療過(guò)程中發(fā)揮藥效的活性成分尚不清楚。而明確該方的化學(xué)物質(zhì)組成是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要前提。本課題組前期采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，以方中沒(méi)食子酸、阿魏酸、梔子苷、槲皮素、川楝素等10 種成分含量為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)三子散的醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)化[4]，并在最優(yōu)提取工藝的支撐下，通過(guò)冷凍干燥技術(shù)獲得了三子散醇提物。在此基礎(chǔ)上，本研究采用具有分析周期短、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)的高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-Q-Exactive-MS）技術(shù)對(duì)三子散醇提物中的復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行快速在線(xiàn)分離與鑒定，從而為后續(xù)該方移行入血成分分析、藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)相關(guān)性研究等提供基礎(chǔ)，進(jìn)而闡明該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

HPLC-Q-Exactive 型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（含Ultimate 3000 型色譜儀、Q-Exactive 型高分辨質(zhì)譜儀）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;AP135W型十萬(wàn)分之一電子天平購(gòu)自日本Shimadzu公司;KH-500DV型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山禾創(chuàng)超聲有限公司;2TB-A 型磁力加熱攪拌電熱套購(gòu)自山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;RE3000A型全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司;FDU2110 型冷凍干燥機(jī)購(gòu)自東京理化器械株式會(huì)社。

1.2 主要藥品與試劑

梔子（批號(hào)19072703，產(chǎn)地為江西）、川楝子（批號(hào)200101131，產(chǎn)地為四川）、訶子（批號(hào)20022403，產(chǎn)地為云南）飲片均購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古北域藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室渠弼教授鑒定分別為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis、楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc.和絨毛訶子Terminaliachebula Retz. var tomentella Kurt. 的干燥成熟果實(shí)。川楝素（批號(hào)111824-201804，純度≥96.9%）、梔子苷（批號(hào)110749-201718，純度≥97.6%）、山柰酚（批號(hào)110861-202013，純度≥98.0%）、沒(méi)食子酸（批號(hào)110831-201605，純度≥98.8%）、鞣花酸（批號(hào)111959-201903，純度≥88.8%）、槲皮素（批號(hào)100081-201810，純度≥99.1%）、阿魏酸（批號(hào)110773-201914，純度≥99.0%）、蘆丁（批號(hào)21020402，純度≥98.0%）、綠原酸（批號(hào)110753-202018，純度≥96.1%）9 種對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;柯里拉京（批號(hào)DST190113-012，純度≥98.2%）、木犀草素（批號(hào)DSTDM003201，純度≥98.0%）、齊墩果酸（批號(hào)DSTDQ005101，純度≥98.0%）3 種對(duì)照品均購(gòu)自成都德思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、乙酸銨均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

采用Shim-pack GIST-HP C18 色譜柱（150 mm×4.6mm，3 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，10%A;10～15 min，10%A→30%A;15～25 min，30%A→70%A;25～30 min，70%A→90%A;30～35 min，90%A;35～40 min，10%A）;流速為1 mL/min;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下檢測(cè)。正離子檢測(cè)模式下的檢測(cè)條件為：輔助氣體積流量30 L/min，噴霧電壓3.50 kV，離子傳輸管溫度300 ℃，輔助氣溫度200 ℃，碰撞能量45 eV;負(fù)離子檢測(cè)模式下的檢測(cè)條件為：輔助氣體積流量30 L/min，噴霧電壓2.80 kV，離子傳輸管溫度400 ℃，輔助氣溫度100 ℃，碰撞能量30 eV。檢測(cè)方式為Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500，掃描范圍為m/z110～1 200。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[4]，按處方比例稱(chēng)取川楝子、梔子、訶子飲片，粉碎，混勻，過(guò)60 目篩。稱(chēng)取混合粉末共約180.00 g，置于圓底燒瓶中，加50%乙醇1 800 mL，用電熱套加熱回流提取3 次、每次1.5 h，分別過(guò)濾并收集濾液。合并3 次濾液，旋蒸濃縮，回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，得到三子散醇提物凍干粉。稱(chēng)取上述凍干粉1.0 g 于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度后稱(chēng)質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）20 min，冷卻至室溫，再次稱(chēng)定其質(zhì)量，以甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取川楝素、梔子苷、齊墩果酸、山柰酚、沒(méi)食子酸、鞣花酸、柯里拉京、槲皮素、阿魏酸、蘆丁、木犀草素、綠原酸12 種對(duì)照品各適量，分別置于不同10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成上述12 種成分質(zhì)量濃度分別為475、201、258、285、206、200、239、237、255、228、292、344 μg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述各單一對(duì)照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成上述12 種成分質(zhì)量濃度分別為950、402、516、570、412、400、478、474、510、456、584、688 ng/mL 的混合對(duì)照品溶液，將其置于4 ℃保存，備用。

2.3 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及分析

利用中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索有關(guān)三子散全方及各單味藥材化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)，將收集的化學(xué)成分信息進(jìn)行匯總，建立一個(gè)包括化合物名稱(chēng)、分子式、精確分子量、一級(jí)和多級(jí)質(zhì)譜碎片等信息的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，從而為化合物的鑒定提供參考。將供試品溶液和對(duì)照品溶液在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)到的質(zhì)譜信息導(dǎo)入Xcalibur3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用HPLC-Q-Exactive-MS高分辨質(zhì)譜計(jì)算化合物的精確分子量，再結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜信息及Xcalibur 3.0 軟件擬合的分子式，通過(guò)與已建立數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物信息和部分對(duì)照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，以實(shí)際測(cè)得與理論的偏差小于10 ppm 為原則[5]，快速鑒別出三子散醇提物中所含有的固有化學(xué)成分。

3 結(jié)果

3.1 三子散醇提物的總離子流圖及成分分析

按“2.1”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件，對(duì)三子散醇提物進(jìn)行HPLC-Q-Exactive-MS 檢測(cè)分析，獲得了三子散醇提物在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的總離子流圖（見(jiàn)圖1）。根據(jù)“2.3”項(xiàng)下分析方法，最終鑒定出化合物64 個(gè)，包括9 個(gè)黃酮類(lèi)成分、13 個(gè)環(huán)烯醚萜類(lèi)成分、14 個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分、18 個(gè)鞣質(zhì)類(lèi)成分、3 個(gè)三萜類(lèi)成分、3 個(gè)氨基酸類(lèi)成分和4 個(gè)脂肪酸類(lèi)成分。其中，有11 個(gè)成分的結(jié)構(gòu)通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)得到了確證。三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 成分鑒定過(guò)程分析

鑒于同類(lèi)成分具有相似的裂解規(guī)律，本文選取組方中主要含有的環(huán)烯醚萜類(lèi)成分、黃酮類(lèi)成分、有機(jī)酸類(lèi)成分和鞣質(zhì)類(lèi)成分為例進(jìn)行成分鑒定過(guò)程分析。

3.2.1 環(huán)烯醚萜類(lèi)成分在組方中共鑒定出環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物13 個(gè)。本研究以梔子苷（化合物33）為例來(lái)說(shuō)明環(huán)烯醚萜類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z 433.133 82[M+COOH]-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰相繼脫去1 分子甲酸和1 分子中性碎片葡萄糖殘基后產(chǎn)生碎片離子峰m/z 225.077 03[M-HGlu]-，然后進(jìn)一步丟失1 分子H2O得到碎片離子峰m/z207.065 87[M-H-Glu-H2O]-，隨后苷元進(jìn)一步發(fā)生逆狄爾斯-阿德?tīng)柗磻?yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z 123.043 95。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對(duì)照品比對(duì)結(jié)果[5，7]，確認(rèn)化合物33 為梔子苷。梔子苷對(duì)照品和化合物33 的二級(jí)質(zhì)譜（MS2）圖分別見(jiàn)圖2、圖3，梔子苷可能的裂解途徑見(jiàn)圖4。

3.2.2 黃酮類(lèi)成分在組方中共鑒定出黃酮類(lèi)化合物9個(gè)。本研究以蘆?。ɑ衔?9）為例來(lái)說(shuō)明黃酮類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z609.147 22[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，并發(fā)現(xiàn)其主要二級(jí)碎片離子峰為m/z 301.034 76、m/z 300.027 80、m/z271.025 27、m/z 151.002 62，即準(zhǔn)分子離子峰通過(guò)碰撞解離丟失蕓香糖產(chǎn)生碎片離子峰m/z 301.034 76[M-HC12H20O9]-，并進(jìn)一步脫去1 個(gè)氫產(chǎn)生碎片離子峰m/z300.027 80[M-H-C12H20O9-H]-，或脫去1 個(gè)中性碎片H2CO 產(chǎn)生碎片離子峰m/z 271.025 27[M - H -C12H20O9-H2CO]-，或發(fā)生逆狄爾斯-阿德?tīng)柗磻?yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z 151.002 62。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對(duì)照品比對(duì)結(jié)果，確認(rèn)化合物39 為蘆丁[11]。蘆丁對(duì)照品和化合物39 的MS2圖分別見(jiàn)圖5、圖6，蘆丁可能的裂解途徑見(jiàn)圖7。

3.2.3 有機(jī)酸類(lèi)成分在組方中共鑒定出有機(jī)酸類(lèi)化合物14 個(gè)。本研究以綠原酸（化合物28）為例來(lái)說(shuō)明有機(jī)酸類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z 353.087 74[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，其特征裂解途徑為結(jié)構(gòu)中酯鍵斷裂產(chǎn)生奎寧酸（quinic acid，QA）及咖啡酸（caffeic acid，CA），主要二級(jí)碎片離子峰為m/z191.055 54[QA - H] - 、m/z 179.034 23[CA - H] - 、m/z173.044 75[QA-H-H2O]-、m/z 135.044 10[CA-HCO2]-，即準(zhǔn)分子離子峰脫去咖啡酰氧基或奎尼酸基團(tuán)產(chǎn)生m/z 191.055 54[QA-H]-或m/z 179.034 23[CAH]-的特征碎片離子峰，然后進(jìn)一步丟失1 分子CO2或1 分子H2O 產(chǎn)生m/z 173.044 75[QA-H-H2O] - 、m/z135.044 10[CA-H-CO2]-的碎片離子峰。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對(duì)照品的比對(duì)結(jié)果，確認(rèn)化合物28 為綠原酸[9-10]。綠原酸對(duì)照品和化合物28 的MS2圖分別見(jiàn)圖8、圖9，綠原酸可能的裂解途徑見(jiàn)圖10。

3.2.4 鞣質(zhì)類(lèi)成分在組方中共鑒別出鞣質(zhì)類(lèi)化合物18 個(gè)。本研究以柯里拉京（化合物30）為例來(lái)說(shuō)明鞣質(zhì)類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程：在負(fù)離子檢測(cè)模式下可見(jiàn)m/z633.074 40[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰失去1 分子沒(méi)食子酰葡萄糖單元形成特征碎片離子峰m/z300.999 39[M-H-galloyl-glu]-，或失去1 分子葡萄糖單元和1 分子六羥基二苯甲酰基（HHDP）產(chǎn)生碎片離子峰m/z 169.013 34[M-H-glu-HHDP]-。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對(duì)照品比對(duì)的結(jié)果，確認(rèn)化合物30 為柯里拉京[11]?？吕锢?duì)照品和化合物30 的MS2圖分別見(jiàn)圖11、圖12，柯里拉京可能的裂解途徑見(jiàn)圖13。

4 討論

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組對(duì)不同流動(dòng)相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸溶液）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入適量甲酸能夠明顯改變組方中成分的質(zhì)譜響應(yīng)值;而與甲醇比較，采用乙腈為流動(dòng)相組成部分能夠顯著提高組方中各成分的分離度。因此，本研究采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相體系。

由于傳統(tǒng)復(fù)方制劑中成分較多且響應(yīng)模式不盡相同，為獲得全面的質(zhì)譜信息，本研究采用正、負(fù)離子全掃描模式對(duì)三子散醇提物中的化學(xué)成分進(jìn)行了辨識(shí)分析。結(jié)果，在三子散醇提物中共鑒定出64 個(gè)化學(xué)成分，以環(huán)烯醚萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)為主?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，環(huán)烯醚萜類(lèi)成分梔子苷在抗炎、抗氧化、降壓、調(diào)脂等方面作用顯著，并具有保肝利膽的作用[17-18]。黃酮類(lèi)化合物存在于多種藥用植物中，具有多重生物活性：槲皮素可通過(guò)縮小心肌梗死面積、降低心肌髓過(guò)氧化物酶活力而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[19];蘆丁具有顯著的抗炎活性，且該作用可能與其減少促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)[20]。鞣質(zhì)類(lèi)成分大多具有抗真菌及抗腫瘤活性，同時(shí)對(duì)結(jié)腸癌、肝癌和宮頸癌細(xì)胞均表現(xiàn)出了一定的抑制作用[11]。此外，本研究還鑒定出了多種有機(jī)酸類(lèi)成分，其在心血管相關(guān)疾病方面作用廣泛：蘋(píng)果酸可提高琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶活性，增加腺苷三磷酸合成，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞的完整性[21];沒(méi)食子酸具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死模型大鼠有較好的心臟保護(hù)作用[22];綠原酸對(duì)中輕度高血壓患者具有降壓作用，這可能與其抑制活性氧的過(guò)量產(chǎn)生、降低氧化應(yīng)激有關(guān)[23]。在鑒定出的三萜類(lèi)成分中，熊果酸和齊墩果酸可通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[24]。

綜上，本研究采用HPLC-Q-Exactive-MS 技術(shù)對(duì)三子散醇提物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)、快速、全面的定性研究，所鑒定出的多種化合物可能是三子散發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，但仍需進(jìn)行進(jìn)一步的藥效學(xué)驗(yàn)證。