人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究

周蓓 朱巧鳳 陳譽(yù)丹 馮莉婷 劉舒凌 吳燕春

關(guān)鍵詞人參;蛤蚧;配伍;腎陽虛;下丘腦-垂體-腎上腺軸;下丘腦-垂體-甲狀腺軸;下丘腦-垂體-性腺軸;神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)

人參為五加科植物人參Panax ginseng C. A. Mey.的根和根莖，性微溫，味甘、微苦，主歸脾、肺、心、腎經(jīng)，臨床常用于治療久病虛羸、驚悸失眠、陽痿宮冷等[1]。因其具有強(qiáng)心、免疫增強(qiáng)、抗衰老、抗腫瘤等廣泛的藥理作用，故具有極高的藥用價(jià)值[2]。蛤蚧為壁虎科動(dòng)物蛤蚧Gekko gecko Linnaeus.的干燥體，性平而味咸，主歸肺、腎經(jīng)，臨床常用于治療虛喘氣促、陽痿、遺精等[1]。《本草綱目》曰：“昔人言補(bǔ)可去弱，人參、羊肉之屬。蛤蚧補(bǔ)肺氣，定喘止渴，功同人參;益陰血，助精扶羸，功同羊肉”。

經(jīng)典人參蛤蚧補(bǔ)虛藥對配伍出自《衛(wèi)生寶鑒》“人參蛤蚧散”、《醫(yī)級(jí)》“人參蛤蚧丸”、《圣濟(jì)總錄》“獨(dú)圣餅”等，臨床應(yīng)用歷史悠久。古今諸多醫(yī)家認(rèn)為蛤蚧配伍人參使用可增強(qiáng)補(bǔ)虛壯陽之效。目前的研究多集中在人參、蛤蚧為君藥的復(fù)方治療喘息性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等肺系疾病[3-5]。本課題組前期研究已明確蛤蚧對腫瘤、衰老等均具有實(shí)驗(yàn)免疫調(diào)節(jié)作用，并對腎陽虛動(dòng)物具有改善作用[6-8]，但蛤蚧配伍人參后，是否能增強(qiáng)其補(bǔ)腎陽作用及相關(guān)機(jī)制尚未明確。

中藥配方顆粒由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，更有利于進(jìn)行配伍的藥效學(xué)研究。目前中藥配方顆粒的藥理作用研究主要集中在抗炎、止痛等中醫(yī)藥優(yōu)勢領(lǐng)域[9]。本研究通過氫化可的松復(fù)制腎陽虛模型大鼠，觀察人參與蛤蚧配方顆粒配伍應(yīng)用對模型大鼠的補(bǔ)腎陽作用，并探討其對模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitaryadrenal，HPA）軸、下丘腦-垂體-甲狀腺（hypothalamuspituitary-thyroid，HPT）軸、下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸及免疫功能形成的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為人參與蛤蚧配方顆粒的臨床配伍應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

SQP 型精密電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司;Infinite M200 Pro 型酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan 公司;i2000 型全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀購自美國Abbott 公司;cobas? c 311 型全自動(dòng)生化分析儀購自德國羅氏診斷有限公司;TGL-16 型低溫離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;GeneAmp PCR System9700 型基因擴(kuò)增儀、ViiATM 7 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）系統(tǒng)均購自美國ABI 公司;BX43 型光學(xué)顯微鏡購自奧林巴斯貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 主要藥物與試劑

人參配方顆粒購自江陰天江藥業(yè)有限公司（批號(hào)20010253，每2.50 g 顆粒相當(dāng)于飲片10 g）;蛤蚧配方顆粒購自深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司（批號(hào)1903001C，每2.99 g 顆粒相當(dāng)于飲片20 g）;金匱腎氣丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠（批號(hào)1803280，規(guī)格360 丸）;氫化可的松注射液購自百正藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)1908003，規(guī)格10 mg ∶2 mL）;環(huán)磷酸腺苷（serum cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（guanosine cyclic phosphate，cGMP）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）、睪酮（testosterone，T）的大鼠酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號(hào)分別為LY2B9CTRRR、6P6TK8JK57、N3VIFVDNRX、3H9J32UP81、512AVRZZQT、9DVDF6-2B98）;三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、雌二醇（estradiol，E2）的放射免疫分析試劑盒均購自意大利DiaSorin 公司（批號(hào)分別為201946、201913B、RE34872）;鼠源IgG、IgM 試劑盒均購自德國羅氏診斷有限公司（批號(hào)分別為38451501、35257501）;Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司（批號(hào)15596026）;蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)G1120）;Gold View染料購自上海賽百勝基因技術(shù)有限公司（批號(hào)HGV-Ⅱ）;RNA 酶抑制劑、SuperScriptTM Ⅲ 反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Epicentre 公司（批號(hào)分別為SRI6310K、RF910100）;2×PCR MasterMix 核酸擴(kuò)增試劑購自美國Arraystar 公司（批號(hào)AS-MR-006-25）。

1.3 動(dòng)物

48 只雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過（批準(zhǔn)號(hào)DW20190106-003）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、金匱腎氣丸組（陽性對照）、人參組、蛤蚧組、配伍組，每組8 只。除正常組外，其余組大鼠每天后腿肌內(nèi)注射氫化可的松25 mg/kg，連續(xù)15 d 進(jìn)行造模，根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]判斷造模是否成功;正常組同期肌內(nèi)注射等體積生理鹽水。造模成功后，對各組大鼠進(jìn)行灌胃。金匱腎氣丸組灌胃劑量為2.33 g/kg，臨用時(shí)用生理鹽水配制。人參、蛤蚧按照配方顆粒量/飲片量比例、人體質(zhì)量60 kg 換算，并參照人與大鼠體表面積折算的等效劑量比值換算[11]，臨用時(shí)用生理鹽水溶解，37 ℃水浴攪拌5 min，配制混懸液。人參組灌胃劑量為0.53g/kg（臨床等效劑量的2 倍），蛤蚧組灌胃劑量為0.21g/kg（臨床等效劑量的2 倍），配伍組灌胃劑量為人參配方顆粒0.53 g/kg 和蛤蚧配方顆粒0.21 g/kg。模型組和正常組灌胃等體積生理鹽水。所有大鼠灌胃體積均為10 mL/kg，每日1次，共灌胃28 d。

2.2 大鼠體質(zhì)量、肛溫測定

分別于灌胃前和灌胃第7、14、21、28 天，采用電子天平測定大鼠體質(zhì)量，采用電子體溫計(jì)測定大鼠肛溫。

2.3 取材與處理

灌胃28 d 后，大鼠禁食不禁水12 h，然后以水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血。血樣以3 000 r/min 于4 ℃離心10 min，取上清液于-80 ℃保存。腹主動(dòng)脈取血后，在冰上將大鼠左右腎上腺、甲狀腺、左右睪丸完整剪下，生理鹽水洗凈，置于4%甲醛溶液中固定。在冰下摘取大鼠下丘腦，置于凍存管在-80 ℃保存待測。

2.4 大鼠血清cAMP、cGMP水平檢測

采用ELISA 法檢測。根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。按相應(yīng)試劑盒說明書方法檢測大鼠血清cAMP、cGMP 水平并計(jì)算cAMP/cGMP。

2.5 大鼠HPA 軸（CRH、ACTH、CORT）、HPT 軸（T3、

T4）、HPG軸（T、E2）、免疫（IgG、IgM）相關(guān)指標(biāo)檢測根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。采用ELISA法，按相應(yīng)試劑盒說明書檢測大鼠血清CRH、ACTH、CORT、T 水平。采用放射免疫法，按相應(yīng)試劑盒說明書檢測T3、T4、E2水平。采用免疫比濁法，按相應(yīng)試劑盒說明書檢測IgG、IgM水平。根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算T/E2。

2.6 大鼠腎上腺、甲狀腺、睪丸組織病理形態(tài)學(xué)觀察

根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。腎上腺、甲狀腺、睪丸組織用4%甲醛溶液固定，再進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、乙醇梯度脫蠟、HE染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化并拍照。

2.7 大鼠下丘腦CRH、TRH、GnRH mRNA 表達(dá)水平檢測

采用qRT-PCR 法檢測。根據(jù)“2.1”項(xiàng)下分組、造模與給藥，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下取材與處理。取-80 ℃凍存的下丘腦（每組取3 只小鼠樣本），先用Trizol 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR 擴(kuò)增，用以檢測CRH、促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin releasing hormone，TRH）、促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRh）mRNA表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠體質(zhì)量、肛溫的影響

與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量在不同時(shí)點(diǎn)均顯著降低（P<0.01）。各給藥組大鼠灌胃前體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;灌胃第7、14、21、28 天，各給藥組大鼠體質(zhì)量均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠體質(zhì)量在不同時(shí)點(diǎn)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

與正常組比較，模型組大鼠肛溫在各時(shí)點(diǎn)均顯著下降（P<0.05 或P<0.01）。各給藥組大鼠灌胃前肛溫差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，配伍組大鼠肛溫在灌胃第7、14、21、28 天均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠肛溫在灌胃第7 天均顯著降低（P<0.05），蛤蚧組大鼠肛溫在灌胃第14、21 天均顯著降低（P<0.05）。這說明人參與蛤蚧配方顆粒配伍對升高腎陽虛模型大鼠肛溫具有一定的協(xié)同作用。結(jié)果見表3。

3.2 人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP的影響與正常組比較，模型組大鼠cAMP 水平、cAMP/cGMP 顯著降低（P<0.01），cGMP 水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠cAMP 水平、cAMP/cGMP 顯著升高（P<0.05 或P<0.01），cGMP 水平顯著降低（P<0.01）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠cAMP 水平、cAMP/cGMP 有降低趨勢，cGMP 水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表4。

3.3 人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠HPA軸、HPT軸、HPG軸、免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠CRH、ACTH、CORT、T3、T4、T 水平和T/E2均顯著降低，E2、IgG、IgG 水平均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠CRH、ACTH、CORT、T3 水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），金匱腎氣丸組、配伍組大鼠T 水平、T/E2均顯著升高（P<0.05 或P<0.01），人參組、配伍組大鼠E2水平均顯著降低（P<0.05），配伍組大鼠IgG 水平顯著降低（P<0.05）。與配伍組比較，人參組、蛤蚧組大鼠CRH、ACTH、CORT、T3、T4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），金匱腎氣丸組T4 水平顯著升高（P<0.01），人參組、蛤蚧組大鼠T/E2顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。這說明人參與蛤蚧配方顆粒配伍對升高腎陽虛大鼠T/E2比值有一定協(xié)同作用。結(jié)果見表5。

3.4 人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠腎上腺、甲狀腺、睪丸組織病理形態(tài)學(xué)的影響

與正常組比較，模型組大鼠可見腎上腺組織皮質(zhì)細(xì)胞分層不清晰，細(xì)胞排列不規(guī)則、體積縮小，束狀帶變窄，細(xì)胞呈空泡樣改變;甲狀腺組織濾泡大部分上皮細(xì)胞被破壞，細(xì)胞核減少，組織紊亂，部分濾泡膠質(zhì)缺失，可見明顯病理性損傷;睪丸組織生精小管排列略松散、間隙略變大，部分生精細(xì)胞排列紊亂，部分有初級(jí)精母細(xì)胞固縮、精子細(xì)胞質(zhì)消失現(xiàn)象，有輕微病理性損傷。與模型組比較，各給藥組大鼠腎上腺、甲狀腺、睪丸組織的病理性損傷均有所改善。結(jié)果見圖1。

3.5 人參與蛤蚧配方顆粒配伍對腎陽虛模型大鼠下丘腦CRH、TRH、GnRH mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平顯著升高，TRH、GnRH mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平均顯著降低，TRH、GnRH mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與配伍組比較，金匱腎氣丸組CRH、GnRH 和蛤蚧組CRH mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。這說明人參與蛤蚧配方顆粒配伍對降低腎陽虛模型大鼠下丘腦CRH mRNA表達(dá)有一定的協(xié)同作用。結(jié)果見圖2。

4 討論

腎陽虛是中醫(yī)研究的熱點(diǎn)。沈自尹院士多年研究得出腎陽虛證具有下丘腦-垂體-靶腺軸（包括HPA軸、HPT軸、HPG軸）不同水平、不同程度的功能紊亂，也與免疫功能形成的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)[12]。神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說將神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)相互間的調(diào)節(jié)關(guān)系作為動(dòng)態(tài)性整體進(jìn)行全面系統(tǒng)研究，并以細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)作為信息分子來實(shí)現(xiàn)人體整體功能的調(diào)控[13]。

中醫(yī)認(rèn)為腎是先天之本，腎陽乃一身陽氣之根本。腎陽虛是中醫(yī)臨床基本證型之一。腎陽虛證有畏寒肢冷、腰膝酸痛、男子遺精、女子帶下清稀等臨床癥狀。外源性糖皮質(zhì)激素復(fù)制大鼠腎陽虛模型是目前比較經(jīng)典、應(yīng)用最廣的模型。本研究造模后大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量、肛溫下降。研究表明，腎陽虛的評價(jià)指標(biāo)包括cAMP、cGMP水平及cAMP/cGMP[10]。本研究中模型組大鼠cAMP水平、cAMP/cGMP 顯著降低，cGMP 水平顯著升高，表明腎陽虛動(dòng)物模型構(gòu)建成功。

本研究復(fù)制大鼠腎陽虛模型是利用外源性糖皮質(zhì)激素抑制ACTH的釋放，使腎上腺萎縮、腎上腺皮質(zhì)分泌類固醇激素減少，能真實(shí)模擬HPA軸受抑制時(shí)的病理狀態(tài)，而HPT 軸、HPG 軸受干擾相對不明顯[12]。血清CRH、ACTH、糖皮質(zhì)激素（主要為CORT）為HPA軸參與控制應(yīng)激反應(yīng)的激素。同時(shí)，糖皮質(zhì)激素升高也會(huì)造成HPA軸負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平升高[14]。本研究結(jié)果顯示，造模后大鼠HPA軸功能被抑制，表現(xiàn)為血清CORT、CRH、ACTH水平降低，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-16];人參與蛤蚧配方顆粒配伍灌胃能顯著升高大鼠血清CRH、ACTH、CORT 水平，而顯著降低下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平，且對下丘腦CRH mRNA表達(dá)的影響效果優(yōu)于陽性對照藥金匱腎氣丸，同時(shí)改善腎上腺組織的病理損傷。這提示人參與蛤蚧配方顆粒配伍能有效改善HPA軸功能紊亂及病理損傷。HPT軸功能抑制與T3、T4分泌紊亂有關(guān)，T3是診斷甲狀腺功能亢進(jìn)癥的特異性指標(biāo)，T4是甲狀腺分泌最豐富的激素，而臨床上腎陽虛者通常表現(xiàn)為甲狀腺功能降低[17]。本研究結(jié)果顯示，外源性糖皮質(zhì)激素復(fù)制腎陽虛模型大鼠的T3、T4水平和下丘腦TRH mRNA表達(dá)水平顯著降低，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[18-20];人參與蛤蚧配方顆粒配伍灌胃后，大鼠T3水平顯著升高，T4水平有升高趨勢，而陽性對照藥金匱腎氣丸對T4水平升高更有優(yōu)勢。此外，人參與蛤蚧配方顆粒配伍后還能顯著升高下丘腦TRHmRNA表達(dá)水平，同時(shí)改善甲狀腺組織的病理損傷。這提示人參與蛤蚧配方顆粒配伍能改善HPT軸功能紊亂及病理損傷。E2、T 為性激素，與HPG 軸生殖器官發(fā)育相關(guān)。腎陽虛造模后動(dòng)物往往表現(xiàn)為卵巢、睪丸功能不足或衰退，性激素水平紊亂[10]。本研究結(jié)果顯示，外源性糖皮質(zhì)激素復(fù)制腎陽虛模型導(dǎo)致大鼠T 水平和下丘腦GnRH mRNA表達(dá)水平顯著降低、E2水平顯著升高，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[21-22];人參與蛤蚧配方顆粒配伍灌胃能顯著升高大鼠T水平、E2/T、下丘腦GnRH mRNA表達(dá)水平，顯著降低E2水平，同時(shí)改善睪丸組織的病理損傷。這提示人參與蛤蚧配方顆粒配伍能改善HPG軸功能紊亂及病理損傷。

“正氣存內(nèi)，邪不可干”，正氣的產(chǎn)生離不開腎陽溫煦，故腎與免疫具有密切關(guān)系。免疫球蛋白是重要的免疫分子，IgG、IgM 水平升高也是外源性糖皮質(zhì)激素復(fù)制大鼠腎陽虛模型后免疫功能紊亂的表現(xiàn)[23]。本研究結(jié)果顯示，腎陽虛造模后大鼠IgG、IgM 水平升高;人參與蛤蚧配方顆粒配伍灌胃可在一定程度上降低兩者水平，使之恢復(fù)至免疫蛋白分泌正常。這說明人參與蛤蚧配方顆粒配伍能在一定程度上改善免疫系統(tǒng)功能紊亂。

綜上所述，人參與蛤蚧配方顆粒配伍應(yīng)用對腎陽虛模型大鼠具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPA軸、HPT軸、HPG軸及免疫功能形成的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)有關(guān);且人參與蛤蚧配方顆粒配伍對提高腎陽虛模型大鼠肛溫、T/E2，降低下丘腦CRH mRNA表達(dá)水平等的效果優(yōu)于單用人參或蛤蚧配方顆粒。筆者團(tuán)隊(duì)下一步擬對人參、蛤蚧配方顆粒的不同配伍比例進(jìn)行研究。