基于SG2快速分離膠搭建法醫(yī)遺傳分析快檢平臺

李英 俞麗娟 豐華 李澤倫 公安部第一研究所

引言

DNA 檢測技術(shù)有“新一代證據(jù)之王”的美譽。在刑偵案件偵破中，該技術(shù)有著廣泛的運用。隨著DNA檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和革新，提高DNA檢測準(zhǔn)確率的同時，也不斷推出了快速DNA檢測方案，如國外推出的RapidHIT 200和ANDE 6C DNA快速檢測平臺，兩款平臺都是基于微流控芯片和毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)，集DNA 提取、擴(kuò)增、電泳和分析四大功能于一體，實現(xiàn)樣品快速自動化檢測，降低污染風(fēng)險且大幅縮短了檢驗時間，可應(yīng)用于重大案件現(xiàn)場的快速排查[1]。但上述兩款快檢平臺雖然能夠大幅度縮短DNA檢測時間，但在檢測通量、檢測精度、試劑的適用性、數(shù)據(jù)的可靠性、耗材的昂貴性等方面仍與傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳遺傳分析儀存在很大差距，限制了在國內(nèi)法醫(yī)DNA領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

國外的DNA快檢設(shè)備或傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳遺傳分析儀，都是基于凝膠的分子篩效應(yīng)，在高壓電場作用下將長度不同的DNA片段得到有效的分離。如果為了縮短電泳時間，可以施加更高的電壓，但會帶來電泳通道溫度過高等不利影響。因此，本文通過自主研制的SG2快速分離膠和GA118-24B遺傳分析儀、SureID S6人類DNA身份鑒定試劑盒搭建法醫(yī)DNA快檢平臺，可大幅度縮短傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳遺傳分析儀的檢測時間，為DNA實驗室實現(xiàn)快速檢測提供了解決方案。

一、基于SG2快速分離膠搭建法醫(yī)DNA快檢平臺

（一）系統(tǒng)組成

法醫(yī)DNA快檢平臺由GA118-24B遺傳分析儀，SG2快速分離膠、SureID S6人類DNA身份鑒定試劑盒構(gòu)成，其余緩沖液、甲酰胺、毛細(xì)管等均為GA118-24B遺傳分析儀的配套試劑耗材。

凝膠作為毛細(xì)管電泳分離基質(zhì)，電泳過程中動態(tài)涂覆于毛細(xì)管內(nèi)壁上，有效控制電滲流的同時，其分子篩效應(yīng)可對DNA片段進(jìn)行有效分離。SG2快速分離膠由N-二甲基丙烯酰胺（PDMA）和緩沖液（尿素、TAPS緩沖液等）組成，高分子聚合物PDMA作為篩分介質(zhì)，其分子量大小影響毛細(xì)管電泳的分離效率和片段讀長，分子量越高分離效果越好，有利于大片段DNA的分離，反之則有利于小片段DNA的分離[2]。SG2快速分離膠通過合理控制PDMA分子量大小，在保證大片段高分辨率的同時盡可能的提升DNA片段的遷移速度[3]，大幅度提高了DNA電泳檢測速度、縮短DNA電泳時間。

SureID S6是國內(nèi)第一款固體擴(kuò)增試劑，采用六色熒光技術(shù)，復(fù)合擴(kuò)增23個基因座，包含21個常染色體基因座，1個性別標(biāo)記基因座Amelogenin及1個Y染色體基因座DYS391，最大片段不超過400bp，滿足法庭科學(xué)現(xiàn)場檢材檢驗需求，操作簡單，性能強大，鑒于其含有15個小于250bp的基因座，可提高降解DNA模板中數(shù)據(jù)信息的獲取，擴(kuò)增時間不超過90分鐘，在實際案件中應(yīng)用效果良好，本文搭建的DNA快檢平臺選用該試劑盒作為擴(kuò)增試劑。

GA118-24B遺傳分析儀是一所自主研制的新一代全自動多通道基因操作平臺。在傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳儀基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了業(yè)內(nèi)首創(chuàng)八色以上熒光檢測技術(shù)，國內(nèi)首臺可同時檢測24個樣品的高通量平臺，設(shè)備所有零部件全部實現(xiàn)國產(chǎn)化，極大地降低了設(shè)備的使用成本。

（二）電泳參數(shù)

毛細(xì)管電泳遺傳分析儀的檢測時間主要分為三部分：恒溫箱升溫時間、電泳數(shù)據(jù)采集時間和其他部件運行時間，恒溫箱需要從室溫升至60℃以保證凝膠的最佳分辨率和數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，數(shù)據(jù)采集時間用來采集電泳時所有DNA片段經(jīng)過檢測窗口的熒光信息。GA118-24B的整個電泳過程需要約40分鐘，其中數(shù)據(jù)采集時間為1500s，占整個檢測時間的60%以上，DNA快檢平臺由于采用了SG2快速分離膠和SureID S6擴(kuò)增試劑盒，利用SG2能夠大幅度提升DNA片段電泳速度和SureID S6最大片段不超過400bp的優(yōu)勢，能夠大幅度縮短電泳時間，數(shù)據(jù)采集時間可以減少到800s，保證所有小于500bp的DNA片段熒光信息在這個時間內(nèi)都能夠被采集到[4]，DNA快檢平臺在GA118-24B上建立的運行模型參數(shù)如圖1所示。

二、實驗測試結(jié)果

（一）電泳時間

按DNA快檢平臺電泳參數(shù)設(shè)置，將96個樣本（含ladder、內(nèi)標(biāo)及9948陽性對照）在GA118-24B上進(jìn)行連續(xù)電泳，采用GeneMapperTMID-X分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個樣本中的最大長度內(nèi)標(biāo)500bp片段出峰時間在600-700s內(nèi)，如圖2所示為一組24個樣本的500bp片段出峰時間，數(shù)據(jù)采集時間減少到800s完全可以滿足SureID S6試劑盒的檢測要求。

（二）分型準(zhǔn)確性

對上述測試的96個樣本中的5個基因分型對照物ladder 和10個9948陽性對照樣本進(jìn)行分析，5個Ladder中的23個基因座、10個9948陽性對照樣本均分型準(zhǔn)確，結(jié)果與試劑盒說明書中的給定結(jié)果完全一致，如圖3、圖4所示。

（三）分辨率

對5個Ladder中D1S1656基因座的4個等位基因15.3、16、16.3、17兩組相差1bp的DNA片段進(jìn)行分析，均能夠被正確分辨識別，如圖5所示，兩個相差1bp的等位基因峰高3000rfu，分離點峰高為1600rfu，能夠被軟件正確識別。

（四）重復(fù)性

隨機(jī)選取5個9948陽性對照樣本，對D8S1179的等位基因12、13進(jìn)行分析，如圖6所示，5個樣本的片段長度誤差均小于0.5bp，分型準(zhǔn)確，峰形尖銳，峰高均衡，具有高度的重復(fù)性和一致性。

三、討論

（一）基于SG2快速分離膠的法醫(yī)遺傳分析快檢平臺的適應(yīng)性

在SG2快速分離膠DNA快檢平臺通過SureID S6試劑盒的驗證后，利用該平臺對目前國內(nèi)外主流擴(kuò)增試劑進(jìn)行了初步測試，測試試劑盒包括：公安部物證鑒定中心的Typer19，閱微基因的M28A，華大基因的炎黃34、YDB，AB公司的ID Plus、VFP，Promega公司的PP21等7個試劑盒，均順利通過平臺測試，大幅度減少電泳時間10分鐘以上，測試結(jié)果見圖7～13。

（二）大幅度縮短DNA檢測時間、提高DNA檢測效率

采用上述DNA快檢平臺，第一次電泳時需要的時間包括恒溫箱升溫時間15分鐘，數(shù)據(jù)采集時間13分鐘，其他部件運行時間2分鐘，合計檢測時間30分鐘，連續(xù)檢測時恒溫箱已處于60℃不需要升溫，每次電泳檢測時間僅需15分鐘，檢測通量可達(dá)到72個樣本/小時，日檢測2304個樣本，可大幅度提高DNA實驗室的檢測能力。

（三）儀器、試劑、耗材的全面配套

SG2快速分離膠與GA118-24B遺傳分析儀和SureID X S6試劑盒搭建的法醫(yī)DNA快檢平臺，在數(shù)據(jù)采集時間上比傳統(tǒng)凝膠電泳節(jié)約10分鐘以上。SG2快速分離膠也可用于GA118系列其他檢測平臺，對國內(nèi)外其他主流擴(kuò)增試劑進(jìn)行檢測，同時電泳檢測所采用的毛細(xì)管陣列、緩沖液、甲酰胺等試劑耗材也實現(xiàn)了全面配套。