聚苯乙烯微塑料和重金屬鎘對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)

廖苑辰, 王倩, 蔣小峰, 李梅,2,*

1. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023

2. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,環(huán)境科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,南京 210023

塑料及其制品應(yīng)用廣泛,巨大消耗量及不當(dāng)處置方式導(dǎo)致塑料廢棄物在環(huán)境中的殘留量不斷增加[1]。 大型塑料垃圾在自然條件下經(jīng)物理、化學(xué)和生物作用,逐漸分解、破碎,形成更為微小的塑料碎片或顆粒,當(dāng)其粒徑＜5 mm 時(shí)被定義為微塑料(microplastics, MPs)[2-3]。 迄今為止,有關(guān)微塑料的研究大多集中在海洋環(huán)境,對(duì)土壤微塑料污染的研究相對(duì)比較匱乏[4],而陸地環(huán)境與人類接觸更為頻繁,因此土壤環(huán)境中的微塑料污染應(yīng)受到更多重視[5]。 已有證據(jù)表明,土壤中也存在不同程度微塑料的檢出。Zhang 等[6]在我國(guó)東北地區(qū)農(nóng)田中檢測(cè)到微塑料的平均含量為0.27 mg·kg-1,最高含量為8.5 mg·kg-1;Fuller 和Gautam[7]的調(diào)查顯示,在澳大利亞悉尼工業(yè)區(qū)土壤中微塑料的平均豐度高達(dá)4 191 mg·kg-1。陸地環(huán)境被認(rèn)為是塑料進(jìn)入海洋的起源和運(yùn)輸通道[8],大多數(shù)微塑料可通過(guò)地膜覆蓋、廢水灌溉、污泥堆肥、道路徑流及大氣輸入等途徑進(jìn)入土壤中[4,9],并保留數(shù)十年或更長(zhǎng)時(shí)間,對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生不利影響[10]。

此外,微塑料具有比表面積大、疏水性強(qiáng)的特性,易吸附環(huán)境中的持久性有機(jī)污染物(POPs)和重金屬等污染物并與之發(fā)生相互作用,因此其復(fù)合毒性效應(yīng)日益受到關(guān)注[11]。 目前,有關(guān)微塑料和重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)生物體的毒性效應(yīng)研究較少,且多集中于水生生物。 例如,已有報(bào)道證實(shí)聚乙烯微塑料的存在可增強(qiáng)重金屬對(duì)鯉魚的毒性效應(yīng)[12],同時(shí)暴露于聚苯乙烯微塑料和重金屬也可誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激[13],對(duì)七彩神仙魚的先天免疫系統(tǒng)造成刺激[14]。 然而,聚苯乙烯微塑料和重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)土壤生物的毒性影響研究數(shù)據(jù)非常有限[15]。

鎘(Cd)是土壤環(huán)境中常見的毒性最強(qiáng)重金屬污染物之一。 據(jù)調(diào)查,我國(guó)沿海地區(qū)表層土壤中Cd的平均含量為1.21 mg·kg-1,太湖望虞河沉積物中Cd 的最大檢出量為 131.53 mg·kg-1[16]。 在我國(guó)農(nóng)田土壤環(huán)境的微塑料中,也檢出了含量范圍為0.058~0.99 mg·kg-1的Cd,表明微塑料和Cd 在自然環(huán)境中存在共暴露現(xiàn)象[17]。 目前尚不清楚土壤中重金屬對(duì)生物的毒性效應(yīng)是否受微塑料的影響,土壤中微塑料和重金屬?gòu)?fù)合污染的毒性效應(yīng)及機(jī)制仍不明晰,亟需相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)的補(bǔ)充。

本文以模式生物赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)為受試生物,選取應(yīng)用最廣泛的塑料之一聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)和重金屬Cd 為受試材料,采用濾紙接觸法,考察PS-MPs 存在下Cd 對(duì)蚯蚓的急性致死作用。 進(jìn)一步通過(guò)人工土壤法,模擬實(shí)際環(huán)境中兩者復(fù)合污染土壤對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)、抗氧化系統(tǒng)、消化酶活性及DNA 損傷的影響,從生長(zhǎng)、生理和遺傳毒性角度初步探討PS-MPs 和Cd 對(duì)蚯蚓的復(fù)合毒性效應(yīng),以期為聚苯乙烯微塑料在土壤環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

赤子愛勝蚓(E.fetida)購(gòu)自江蘇省句容市某蚯蚓養(yǎng)殖基地。 試驗(yàn)前,將所購(gòu)蚯蚓于清潔土壤中預(yù)培養(yǎng)3 ~7 d,挑選具有明顯生殖環(huán)帶、體質(zhì)量500 ~600 mg 的健康成蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

聚苯乙烯熒光微球(PS-MPs)購(gòu)自中國(guó)天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心,將原液(10 mg·mL-1)超聲處理 10 min 后,取 10 μL 微塑料原液于 10 mL 超純水中,稀釋1 000 倍,采用透射電子顯微鏡(TEM,Jeol2100F,日本Jeol 公司)和動(dòng)態(tài)光散射激光粒度儀(DLS,Zetasizer Nano-S,英國(guó) Malvern 公司)進(jìn)行形貌表征。 結(jié)果顯示,試驗(yàn)所用PS-MPs 呈球狀,平均粒徑為(5.04±0.02) μm,溶液體系分散效果良好(圖1)。

圖1 聚苯乙烯塑料微球(PS-MPs)形貌(a)及粒徑強(qiáng)度分布(b)Fig.1 Transition electron microscopy (TEM) image (a) and dynamic light scattering (DLS) result (b) of polystyrene microplastics (PS-MPs)

無(wú)水氯化鎘(CdCl2)(CAS No. 10108-64-2),純度≥99.0%,購(gòu)自中國(guó)上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濾紙接觸法

參照OECD Guideline No.207 標(biāo)準(zhǔn)濾紙接觸法研究Cd 單一及與PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓的急性致死作用,以探討PS-MPs 的存在對(duì)Cd 引起蚯蚓死亡率的影響。 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,確定正式試驗(yàn)中Cd2+濃度為 0、6.51、9.77、14.33、21.98 和 31.28 μg·cm-2;PS-MPs 暴露水平為 0、8×10-3、1.6×10-1μg·cm-2。 濾紙法試驗(yàn)采用平底玻璃管進(jìn)行,取若干長(zhǎng)8 cm,直徑3 cm 的平底玻璃管,管內(nèi)壁平鋪濾紙,濾紙大小剛好覆蓋玻璃管內(nèi)壁且不重疊。 用移液器依次吸取0.5 mL Cd 溶液和0.5 mL PS-MPs 溶液至玻璃管中,放入37 ℃烘箱烘干,使受試物在濾紙上均勻沉淀。 對(duì)照組用1 mL 超純水做相同處理。 之后,用移液槍移取1 mL 超純水于玻璃管中,確保內(nèi)襯濾紙足夠濕潤(rùn),以便蚯蚓生存。 每管放置1 條蚯蚓,以避免同一管內(nèi)蚯蚓的死亡對(duì)其他蚯蚓產(chǎn)生的可能影響,然后置于溫度(20±1) ℃,濕度80%的恒溫恒濕箱中避光培養(yǎng)48 h。 同時(shí)設(shè)不含Cd、PS-MPs 的蒸餾水處理為對(duì)照組,每個(gè)處理組設(shè)置10個(gè)重復(fù)。

1.2.2 人工土壤法

采用人工土壤標(biāo)準(zhǔn)暴露法(OECD Guideline No.207)研究PS-MPs 和Cd 復(fù)合污染土壤對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)。 復(fù)合毒性試驗(yàn)的劑量參照先前已有研究[18-19],同時(shí)基于濾紙接觸法試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行設(shè)定(表1)。 將赤子愛勝蚓暴露于含Cd 和 PS-MPs 的人工土壤中,Cd 和PS-MPs 各設(shè)置高和低2個(gè)染毒劑量組,其中,低劑量(Cd 1 mg·kg-1,PS-MPs 0.5 mg·kg-1)接近環(huán)境實(shí)測(cè)值,高劑量(Cd 130 mg·kg-1,PSMPs 10 mg·kg-1)用以模擬高污染區(qū)域。 人工土壤配制參照OECD 207 試驗(yàn)準(zhǔn)則,并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。 稱取350 g 石英砂,50 g 牛糞和100 g 高嶺土于培養(yǎng)缸中,混勻后加入175 mL 經(jīng)蒸餾水稀釋的不同含量受試物溶液,在實(shí)驗(yàn)室條件下穩(wěn)定7 d 后,每缸放置10 條經(jīng)清潔人工土壤馴化24 h 的蚯蚓,于恒溫恒濕箱中避光培養(yǎng)14 d,培養(yǎng)條件同前,每7 d 向土壤表面均勻加入2 g 牛糞作為養(yǎng)料。 同時(shí)設(shè)置不含Cd、PS-MPs 的清潔人工土壤為對(duì)照組,每個(gè)處理組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(人工土壤法)Table 1 Design of experiment (artificial soil test)

1.3 毒理學(xué)指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 死亡率

分別于濾紙接觸法暴露24 h 和48 h 后,記錄每個(gè)處理組蚯蚓的死亡數(shù)量,并計(jì)算死亡率。 若蚯蚓前尾部對(duì)輕微針扎無(wú)反應(yīng),則視為死亡。

1.3.2 體質(zhì)量變化率

在人工土壤法第0 天和第14 天將蚯蚓從不同處理組培養(yǎng)缸中取出,清洗并用濾紙吸去表面水分后稱量,按下式計(jì)算體質(zhì)量變化率:

體質(zhì)量變化率=(Wt-W0)/W0×100%

式中:Wt為第14 天蚯蚓的平均體質(zhì)量(mg),W0為第0 天蚯蚓的平均體質(zhì)量(mg)。

1.3.3 酶活性及可溶蛋白含量測(cè)定

人工土壤法第14 天將蚯蚓從土壤中取出,每組3 條,于濕潤(rùn)濾紙上清腸24 h。 稱取蚯蚓樣品組織,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶4 的比例加入 4 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下制成勻漿,3 000 r·min-1離心10 min 后,取上清液,一部分直接用于測(cè)定丙二醛(MDA,A003-1-1)含量,另一部分分別稀釋成0.5%、5%和10%(V∶V)的蚯蚓組織勻漿,各用于蛋白含量(A045-4-2)、過(guò)氧化氫酶(CAT,A007-1-1)和堿性磷酸酶(AKP,A059-2-2)活性的測(cè)定。 另取蚯蚓樣品組織若干,在冰水浴條件下將其以質(zhì)量(g)與纖維素酶緩沖液(mL)為 1 ∶9 的比例制成勻漿,4 000 r·min-1離心 10 min,取上清液,稀釋成 10%(V∶V)蚯蚓組織勻漿,進(jìn)行纖維素酶活性(A138-1-1)測(cè)定。 試驗(yàn)用試劑盒及測(cè)定方法均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.4 DNA 損傷檢測(cè)

人工土壤法培養(yǎng)14 d 后,取出蚯蚓,每組3 條,濕潤(rùn)濾紙清腸24 h 后,依據(jù)Eyambe 等[20]的方法提取蚯蚓體腔細(xì)胞,彗星試驗(yàn)參考Singh 等[21]方法。蚯蚓體腔細(xì)胞經(jīng)制片-裂解-解旋-電泳-中和-染色后,將染色后的載玻片置于熒光顯微鏡(BX41,日本奧林巴斯公司)下,用明美顯微數(shù)碼測(cè)量分析系統(tǒng)軟件觀察蚯蚓體腔細(xì)胞熒光圖像,并拍照儲(chǔ)存。 圖像用CASP 彗星分析軟件逐一進(jìn)行分析,選取彗星尾部DNA 百分比(tail DNA%)、彗星尾長(zhǎng)(tail length,TL)和 Olive 尾矩(Olive tail moment,OTM)作為 DNA損傷的指標(biāo),每張片子分析50個(gè)細(xì)胞。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2013 和SPSS 20 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Probit 回歸分析和相關(guān)性分析,計(jì)算半數(shù)致死劑量(lethal dose 50%, LD50),彗星試驗(yàn)3 項(xiàng)指標(biāo)所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20 進(jìn)行Mann-Whitney U(二樣本)檢驗(yàn)。 利用方差分析(ANOVA)方法,在 0.05、0.01 和0.001 的顯著性水平下進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 濾紙法測(cè)定Cd 單一及與PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓死亡率的影響

不同濃度Cd 及其與PS-MPs 復(fù)合暴露條件下赤子愛勝蚓的死亡率如圖2 所示。 無(wú)論P(yáng)S-MPs 存在與否,蚯蚓的死亡率均隨著Cd 濃度增加呈梯度上升趨勢(shì)。 當(dāng) Cd 濃度為 31.28 μg·cm-2時(shí),Cd 單一暴露及與0.008 μg·cm-2PS-MPs 復(fù)合暴露條件下,赤子愛勝蚓的48 h 死亡率均達(dá)100%。

圖2 Cd 及其與PS-MPs 復(fù)合暴露24 h (a)和48 h (b)后赤子愛勝蚓的急性致死率(濾紙法)Fig.2 The motility of E. fetida treated with Cd and Cd+PS-MPs after 24 h (a) and 48 h (b) exposure time (filter paper method test)

以Cd 濃度對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo),將蚯蚓死亡率進(jìn)行概率變換作為縱坐標(biāo),通過(guò)線性擬合得到線性回歸方程(表 2)。 Cd 單一暴露時(shí),蚯蚓 24 h 和 48 h 的LD50分別為 22.09 μg·cm-2和 13.55 μg·cm-2,即1 380.7 mg·L-1和 843.75 mg·L-1。 其中,24 h-LD50與Neuhauser 等[22]、吳聲敢等[23]的研究結(jié)果一致,但48 h 急性毒性結(jié)果較已有研究結(jié)果稍低,這可能是由于赤子愛勝蚓個(gè)體差異及處理劑量的不同造成的。

表2 Cd 及其與PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)回歸分析Table 2 The regression analysis of the acute toxic effects of Cd and Cd+PS-MPs on E. fetida

當(dāng) PS-MPs 濃度為 0.008 μg·cm-2(即 0.5 mg·L-1)時(shí),蚯蚓 24 h 和 48 h 的 LD50分別為 21.96 μg·cm-2和 14.44 μg·cm-2;當(dāng) PS-MPs 濃度為 0.160 μg·cm-2(即 10.0 mg·L-1)時(shí),蚯蚓的 24 h-LD50和 48 h-LD50分別為 21.75 μg·cm-2和 16.43 μg·cm-2。 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,Cd 單一及其與PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓的24 h-LD50無(wú)明顯差異;48 h 作用下,Cd 與0.160 μg·cm-2PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓的 LD50最大,Cd 單一暴露對(duì)蚯蚓的LD50最小。 LD50數(shù)值越小,表示急性毒性效應(yīng)越強(qiáng)。 Davarpanah 和 Guilhermino[24]研究發(fā)現(xiàn),微塑料與銅的結(jié)合可以減輕重金屬對(duì)微藻(Tetraselmis chuii)的毒性。 有證據(jù)表明,微塑料顆粒易于吸附包括Cd2+在內(nèi)的金屬陽(yáng)離子[25],因此在本研究中,PS-MPs 可能在溶液中吸附重金屬,導(dǎo)致Cd 在濾紙上的沉積量減少,降低了Cd的生物利用度,從而減輕其對(duì)蚯蚓的毒害作用[26]。即PS-MPs 的存在一定程度上降低了Cd 對(duì)蚯蚓的濾紙法急性毒性。

2.2 人工土壤法

2.2.1 Cd 與PS-MPs 復(fù)合污染對(duì)蚯蚓體質(zhì)量的影響

Cd 與PS-MPs 復(fù)合污染對(duì)赤子愛勝蚓體質(zhì)量的影響如圖3 所示。 暴露14 d 后,各處理組蚯蚓體質(zhì)量增長(zhǎng)率與對(duì)照組相比均顯著降低(P＜0.05),為對(duì)照組的69.15% ~74.93%,表明 Cd 與 PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)速率具有一定抑制作用,與先前研究結(jié)果類似。 有報(bào)道表明,土壤中的高含量Cd(250 ~500 μg·g-1)可降低蚯蚓生長(zhǎng)速率,導(dǎo)致體質(zhì)量減輕[27]。 Cao 等[28]研究了赤子愛勝蚓對(duì)土壤聚苯乙烯微塑料暴露的適應(yīng)性,結(jié)果表明,高含量(1%和2%)(m/m)PS-MPs 暴露下蚯蚓生長(zhǎng)受抑,死亡率增加。 Zhou 等[15]研究發(fā)現(xiàn),聚丙烯微塑料(300 ~9 000 mg·kg-1)與 Cd(8 mg·kg-1)復(fù)合暴露使赤子愛勝蚓的生長(zhǎng)速率降低,且Cd 的存在加劇了聚丙烯微塑料對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)的負(fù)面影響,其中,較高含量(＞3 000 mg·kg-1)聚丙烯微塑料對(duì)蚯蚓腸道造成的磨損和堵塞可能是蚯蚓體質(zhì)量減輕的直接原因,這與我們的研究結(jié)果略有不同。 在本試驗(yàn)中,不同處理組之間的體質(zhì)量增長(zhǎng)率無(wú)明顯差異,結(jié)果的不同可能與土壤成分、微塑料種類以及暴露濃度有關(guān),這也說(shuō)明了土壤環(huán)境中微塑料和重金屬相互作用的復(fù)雜性。

圖3 Cd 和PS-MPs 復(fù)合污染對(duì)赤子愛勝蚓體質(zhì)量變化的影響注:CK 表示對(duì)照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs; *表示與 CK 相比有顯著差異,P＜0.05。Fig.3 Changes of growth rate of E. fetida treated with PS-MPs and CdNote: CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs; *indicates a significant difference compared with CK, P＜0.05.

2.2.2 Cd 與PS-MPs 復(fù)合污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響

CAT 是抵御活性氧傷害的典型酶類,可以清除逆境過(guò)程中活性氧轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的H2O2,緩解其對(duì)細(xì)胞的毒害[29]。 由圖4(a)可知,不同處理組蚯蚓體內(nèi)CAT 活性均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。 其中,CAT活性在 130 mg·kg-1Cd 與 10 mg·kg-1PS-MPs 復(fù)合暴露時(shí)僅為對(duì)照組的29.39%。 比較同含量Cd 與不同含量PS-MPs 組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,相同暴露時(shí)間下,PS-MPs 含量高的處理組,CAT 活性較低。 當(dāng)PS-MPs 含量為 10 mg·kg-1時(shí),隨 Cd 含量升高,CAT活性呈下降趨勢(shì),表明 CAT 活性與 Cd 含量以及PS-MPs 含量均呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系。 Wen 等[14]的研究也有類似結(jié)果,Cd 與PS-MPs 聯(lián)合暴露七彩神仙魚(Symphysodon aequifasciatus)時(shí),CAT 活性受MPs、Cd 這2 種壓力源及其相互作用影響,且聯(lián)合暴露組較對(duì)照組有所下降,CAT 活性受到抑制。 較對(duì)照而言,處理組的CAT 活性值整體呈下降趨勢(shì),即活性受到抑制,說(shuō)明在Cd 與PS-MPs 復(fù)合暴露條件下,機(jī)體受到氧化脅迫作用,自由基產(chǎn)生和消除之間的平衡被破壞,CAT 分解H2O2的速度低于其產(chǎn)生速度,使得CAT 消耗殆盡,酶活性降低,而CAT活性的抑制將導(dǎo)致H2O2的累積,可能對(duì)蚯蚓造成過(guò)氧化損傷[30]。

圖4 Cd 和PS-MPs 復(fù)合污染對(duì)赤子愛勝蚓過(guò)氧化氫酶(CAT)活性(a)和丙二醛(MDA)含量(b)的影響注:CK 表示對(duì)照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;與 CK 相比有顯著差異,*表示 P＜0.05,**表示 P＜0.01,***表示 P＜0.001。Fig.4 Changes of catalase (CAT) activity (a) and malondialdehyde (MDA) content (b) in E. fetida treated with PS-MPs and CdNote: CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;a significant difference compared with CK, *represents P＜0.05, **represents P＜0.01, ***represents P＜0.001.

當(dāng)蚯蚓受到外界脅迫打破抗氧化防御系統(tǒng)與體內(nèi)活性氧之間動(dòng)態(tài)平衡時(shí),過(guò)量的超氧陰離子會(huì)與細(xì)胞中重要大分子結(jié)合,造成脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA 損傷等。 MDA 是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,可指示蚯蚓受到的氧化損傷,含量越高,表明損傷越大[31]。 在本研究中,Cd 與PS-MPs 復(fù)合暴露14 d 后,各處理組 MDA 含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)(圖 4(b)),分別為對(duì)照組的 2.21 倍、2.46 倍、4.74倍和1.89 倍,說(shuō)明蚯蚓受到氧化損傷。 Panzarino等[32]研究了Cd 單一脅迫下蚯蚓(Eisenia andrei)各生物標(biāo)志物的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)100 μg·g-1Cd 顯著誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)MDA 含量的上升,抑制CAT 活性。 也有研究證實(shí),聚苯乙烯微塑料暴露可以誘導(dǎo)赤子愛勝蚓體內(nèi)活性氧水平的升高和抗氧化酶活性的降低,對(duì)蚯蚓產(chǎn)生氧化損傷[33],與本研究結(jié)果一致。 在本試驗(yàn)中,Cd 與PS-MPs 復(fù)合作用誘導(dǎo)蚯蚓脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),產(chǎn)生了氧化損傷,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定損害,表明在Cd 與PS-MPs 復(fù)合作用下,蚯蚓抗氧化系統(tǒng)受到一定程度的損傷。

2.2.3 Cd 與PS-MPs 復(fù)合污染對(duì)蚯蚓體內(nèi)消化酶活性的影響

AKP 是一種普遍存在的膜結(jié)合金屬酶,在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和蛋白質(zhì)磷酸化等生理過(guò)程中必不可少[34]。 其活性也可以反映蚯蚓的代謝效率及消化能力[35]。 由圖5(a)可知,不同處理組的AKP 活性與體質(zhì)量變化結(jié)果相類似,均較對(duì)照組低(圖3),但二者變化趨勢(shì)仍存在一定差異,其可能原因?yàn)樯锪孔兓?lián)系著化學(xué)脅迫、化學(xué)效應(yīng)與能量變化等多種因素,是機(jī)體在個(gè)體水平的綜合響應(yīng)[36]。其中,130 mg·kg-1Cd 與 0.5 mg·kg-1PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓體內(nèi)AKP 活性呈顯著抑制(P＜0.01),酶活性僅為對(duì)照組的29.90%。 這與Banaee 等[12]的研究結(jié)果一致,該研究在暴露于高濃度Cd 和MPs 的鯉魚(Cyprinus carpio)中發(fā)現(xiàn)AKP 活性顯著下降。AKP 活性的降低一方面可能與機(jī)體的Cd 吸收有關(guān),AKP 活性中心含有金屬離子鋅(Zn),Cd 的存在能打亂其現(xiàn)有構(gòu)象,從而特異性抑制AKP 活性[37];另一方面,微塑料的加入也能阻礙機(jī)體消化能力,降低物質(zhì)代謝水平,導(dǎo)致AKP 活性降低[38]。

纖維素酶是蚯蚓體內(nèi)主要的消化酶,其活性變化可以指示蚯蚓生命活動(dòng)狀況,直接反映蚯蚓分解土壤有機(jī)質(zhì)的能力[39]。 纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,除 1 mg·kg-1Cd 與 0.5 mg·kg-1PS-MPs 復(fù)合暴露組外,其余各處理組纖維素酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)(圖 5(b)),說(shuō)明土壤中 Cd 與 PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性起一定激活作用。由圖 4(b)可知,1 mg·kg-1Cd 與 10 mg·kg-1PS-MPs復(fù)合脅迫下,蚯蚓體內(nèi)MDA 含量最高,說(shuō)明此時(shí)蚯蚓體內(nèi)污染物代謝產(chǎn)物積累值最大,因此纖維素酶活性升高,以清除體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

圖5 Cd 和PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)赤子愛勝蚓堿性磷酸酶(AKP)活性(a)和纖維素酶活性(b)的影響注:CK 表示對(duì)照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;與 CK 相比有顯著差異,*表示 P＜0.05,**表示 P＜0.01。Fig.5 Changes of alkaline phosphatase (AKP) (a) and cellulase activities (b) in E. fetida treated with PS-MPs and CdNote: CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs; a significant difference compared with CK, *represents P＜0.05, **represents P＜0.01.

張薇等[40]研究發(fā)現(xiàn),不同含量(0.1 ~4 mg·kg-1)恩諾沙星和200 mg·kg-1銅復(fù)合污染14 d 顯著抑制赤子愛勝蚓AKP 活性,誘導(dǎo)纖維素酶活性上升;類似地,Shi 等[35]研究了菲暴露14 d 對(duì)赤子愛勝蚓消化酶活性的影響,結(jié)果顯示,蚯蚓的纖維素酶活性增加,而AKP 活性受到抑制,與本研究結(jié)果相一致。誘導(dǎo)的纖維素酶活性表明蚯蚓在一定含量下對(duì)Cd與PS-MPs 復(fù)合暴露可能表現(xiàn)出興奮效應(yīng),增強(qiáng)生理功能以抵抗氧化應(yīng)激[41-42]。

2.2.4 Cd 與PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞的DNA 損傷

彗星試驗(yàn)是一種能快速地在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA 損傷的測(cè)試方法[43]。 在本研究中,與對(duì)照組相比,Cd 與 PS-MPs 不同含量處理組均能引起 tail DNA% 、TL 和 OTM 這 3 項(xiàng)指標(biāo)顯著增加(圖 6),暗示蚯蚓體腔細(xì)胞DNA 受損。 根據(jù)彗星損傷程度等級(jí)分析DNA 損傷情況,可知Cd 與PS-MPs 復(fù)合污染對(duì)蚯蚓DNA 造成輕中度損傷,其中,1 mg·kg-1Cd 與0.5 mg·kg-1PS-MPs 復(fù)合暴露組的受損程度最高(表3),說(shuō)明二者復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓具有潛在的遺傳毒性效應(yīng)。 已有研究證實(shí)PS-MPs 或Cd 單獨(dú)暴露可引起赤子愛勝蚓體腔細(xì)胞的DNA 損傷[33,44],且隨暴露濃度的增大,損傷加劇。 DNA 損傷可能與污染脅迫引起的氧化應(yīng)激有關(guān)[45],有害環(huán)境的刺激誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生[32],DNA 受自由基攻擊易受到破壞,從而導(dǎo)致單鏈或雙鏈斷裂[46]。Wang 等[30]的研究也表明,外界脅迫下過(guò)量活性氧(ROS)的生成,最終可導(dǎo)致赤子愛勝蚓膜脂過(guò)氧化和DNA 損傷。 推測(cè)在本試驗(yàn)中,Cd 與 PS-MPs 復(fù)合暴露也可能通過(guò)氧化脅迫引起蚯蚓DNA 一定程度的損傷。

表3 PS-MPs 和Cd 對(duì)赤子愛勝蚓DNA 損傷程度等級(jí)表Table 3 The degree of DNA damage in E. fetida after exposed to PS-MPs and Cd

圖6 Cd 和PS-MPs 復(fù)合暴露對(duì)蚯蚓體腔細(xì)胞DNA 損傷注:(a) 彗尾長(zhǎng)度,(b) Olive 尾矩,(c) 彗尾DNA 含量;CK 表示對(duì)照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;與CK 相比有顯著差異,***表示P＜0.001。Fig.6 Effects of co-exposure of PS-MPs and Cd on DNA damage in E. fetidaNote: (a) Tail length (TL), (b) Oliver tail moment (OTM), (c) Tail DNA%; CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;a significant difference compared with CK, ***represents P＜0.001.

總的來(lái)說(shuō),本研究采用濾紙法試驗(yàn),比較了Cd單一及其與PS-MPs 復(fù)合暴露下蚯蚓存活率的變化情況。 再依據(jù)濾紙法結(jié)果,開展人工土壤法試驗(yàn),初步證實(shí)了土壤環(huán)境中PS-MPs 和Cd 復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)、生理代謝及DNA 損傷的不利影響,這些不利影響可能通過(guò)食物鏈干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)正常的生態(tài)功能,表現(xiàn)出的生態(tài)毒理效應(yīng)需引起足夠重視。但本研究?jī)H初步探索了微塑料和重金屬在土壤環(huán)境中共存時(shí)對(duì)土壤生物的毒性效應(yīng),其復(fù)合毒性效應(yīng)具有復(fù)雜性,機(jī)制尚不明晰。 未來(lái)還需結(jié)合環(huán)境濃度微塑料對(duì)土壤生物的單一毒性、微塑料及其復(fù)合污染物在土壤環(huán)境中的相互作用展開深入研究。