3 種青霉素類抗生素對大腸桿菌的時間毒性微板分析法建立及其聯(lián)合抑菌作用

駱縱縱, 張瑾 , 周娜娜, 陳如荔, 洪俊華

安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院,安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室,合肥 230601

目前,抗生素污染及其產(chǎn)生的環(huán)境毒害效應(yīng)已經(jīng)成為社會各界關(guān)注的重點[1-2]。 大量殘留的抗生素會通過城市管網(wǎng)、地表徑流和下滲作用等方式最終匯入到水體中,不僅會威脅到水生生物的生存,而且還會通過食物鏈及生態(tài)循環(huán)等方式,對人類的生產(chǎn)生活和健康造成嚴(yán)重的危害[3-5]。 殷強(qiáng)和付崢嶸[6]研究發(fā)現(xiàn)水體中極微量的抗生素,也會對水生動物的機(jī)體器官和水生植物的光合呼吸作用造成損傷,且長期飲用會降低人體的免疫力。 此外,抗生素過度使用會誘發(fā)細(xì)菌的抗性基因,使細(xì)菌對其建立耐受性,大大增加了人類感染疾病治療的難度[7]。

青霉素類作為最早被人類應(yīng)用于臨床疾病治療的抗生素,在醫(yī)療中的應(yīng)用有著成熟完整的體系,而且在我國的產(chǎn)量較高、使用量較廣、研究度較深[8]。此外,青霉素類抗生素具有“三低一高”的顯著優(yōu)勢,即耐藥性低、毒副作用低、價格低、醫(yī)療效果高[9]。 張藜莉和李靜[10]研究發(fā)現(xiàn)青霉素類藥物對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和厭氧菌等多種細(xì)菌都有抑菌性,可用于治療多種細(xì)菌的感染。 湯雨晴等[11]發(fā)現(xiàn)青霉素類抗生素能與細(xì)菌細(xì)胞膜上的某種蛋白質(zhì)分子結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物,會誘發(fā)細(xì)菌的死亡。 因此,研究多種青霉素類抗生素的抑菌作用具有重要意義。

環(huán)境中的污染物常以混合物形式存在,很可能對暴露生物產(chǎn)生聯(lián)合毒性效應(yīng)。 那么,對抗生素聯(lián)合效應(yīng)的探尋,在多個領(lǐng)域都擁有重要的參考價值[12]。 當(dāng)混合體系表現(xiàn)出協(xié)同作用時,可以為抗耐藥菌的問題和新型抗菌藥物的研發(fā)提供新的解決思路和方法[13-14];當(dāng)混合體系表現(xiàn)為拮抗作用時,可以為抗生素環(huán)境生態(tài)毒性問題的解決提供多方位的策略[15];當(dāng)混合體系表現(xiàn)為加和作用時,表明藥物的抑菌作用靶可能相同,可以為混合藥物的作用機(jī)理提供思考的角度[16]。

此外,藥物的抑菌效果受多種因素的共同影響,而時間是除濃度外的另一個重要影響因素,但很多研究僅關(guān)注了抑菌性較強(qiáng)的某個特殊暴露時間點的抑菌作用,卻很少探究其在不同暴露時間的動態(tài)變化規(guī)律,這可能會掩蔽藥物發(fā)揮抑菌作用的完整過程[17]。 楊啟文等[18]研究了青霉素類抗生素和環(huán)丙沙星或阿米卡星對耐藥的銅綠假單胞菌的體外聯(lián)合抑菌效應(yīng),發(fā)現(xiàn)在暴露24 h 時主要為協(xié)同和加和作用。吳群等[19]以分級抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration, FIC)為藥物聯(lián)合抑菌效應(yīng)的判斷指標(biāo),發(fā)現(xiàn)抗生素在暴露時間為12 h 時,其對大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)聯(lián)合抑菌作用呈現(xiàn)出協(xié)同、累加和拮抗等多種相互作用。 這些研究均表明,長時間暴露可能會使藥物間的相互作用發(fā)生變化,但這些研究均忽視了藥物聯(lián)合抑菌作用的連續(xù)動態(tài)變化規(guī)律。因此,不同暴露時間的連續(xù)動態(tài)測定具有一定的必要性,它能更完整地表達(dá)出藥物對E. coli的影響趨勢,使藥物的聯(lián)合效應(yīng)預(yù)測結(jié)果更加精確可靠。

E. coli是多種疾病的傳播者,且廣泛存在于人類的日常生活中,對抗生素極易產(chǎn)生耐藥性[20],但作為實驗菌種它具有生長周期短、培養(yǎng)方法簡單、應(yīng)用成本低和基因表達(dá)水平高等諸多優(yōu)點[21-22]。 然而,目前針對E. coli抑菌性的研究僅限于藥物在某一特殊暴露時間的抑菌作用,但對于多個藥物在不同暴露時間對E. coli的聯(lián)合抑菌作用的研究較少[23],且多數(shù)人員對E. coli的抑菌性實驗采用微量肉湯稀釋法和棋盤法,但都不宜直接用來獲取藥物及其混合物對E. coli抑菌數(shù)據(jù)[24-25]。 因此,本論文擬以臨床領(lǐng)域中廣泛使用的3 種青霉素類藥物哌拉西林鈉(piperacillin sodium, PIP)、青霉素 G 鉀(penicillin G potassium, PEN)和青霉素V 鉀鹽(penicillin V potassium salt, PHE)[9,26]為研究對象,以大腸桿菌為受試生物,以透明96 孔板為實驗載體,通過調(diào)整培養(yǎng)基成分比例、培養(yǎng)條件和測試時間等因素,建立基于E. coli的時間毒性微板分析方法(time-dependent toxicity microplate analysis, t-MTA)[27],采用均勻設(shè)計射線法(uniform design ray,UD-Ray)[28]構(gòu)建三元混合物體系,且運用t-MTA 全面地測定3 種藥物及其三元混合物的時間毒性數(shù)據(jù),并采用最小二乘法對其數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,應(yīng)用濃度加和(concentration addition model, CA)模型分析三元混合物的聯(lián)合抑菌作用。以期為抗耐藥菌藥物的研發(fā)提供新的思路,為抗生素環(huán)境風(fēng)險的評估提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與儀器

3 種青霉素類抗生素哌拉西林鈉(PIP)、青霉素G 鉀(PEN)和青霉素V 鉀鹽(PHE)均為分析純,且購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,其理化性質(zhì)及儲備液濃度如表1 所示。 均采用Milli-Q 水配制儲備液,并置于棕色瓶中4 ℃條件下保存、備用。

表1 3 種抗生素的基本性質(zhì)及儲備液Table 1 Basic properties and stocks of three antibiotics

培養(yǎng)基配制:(1)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar,NA)成分包括 10 g 蛋白胨、4 g 牛肉膏、5 g NaCl、20 g 瓊脂。(2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrient broth, NB)成分包括 10 g 蛋白胨、4 g 牛肉膏、5 g NaCl。(3)MH 肉湯培養(yǎng)基(Mueller-Hinton broth, MHB)成分包括2 g 牛肉粉、17.5 g 酸水解酪蛋白、1.5 g 可溶性淀粉。 將各成分溶于1 000 mL Milli-Q 水,調(diào)節(jié)pH 為7.2 ~7.4,于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,冷卻后在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?2 倍培養(yǎng)基則按比例擴(kuò)大各成分。本實驗所用主要儀器參照文獻(xiàn)[29]。

1.2 基于E.coli 的時間毒性微板分析法建立及優(yōu)化

以菌株號為ATCC8739 的E. coli(上海魯微科技有限公司)為實驗菌種。 首先,在NA 培養(yǎng)基上挑取2 環(huán)活化后的E. coli轉(zhuǎn)接到NB 培養(yǎng)基中,恒溫震蕩培養(yǎng),設(shè)置溫度(37±1) ℃,轉(zhuǎn)速 170 r·min-1,培養(yǎng)12 h 至對數(shù)生長期,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?其次,取待測保存菌液20 μL 加入1 mL MHB,置于(37±1) ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中過夜靜止培養(yǎng)12 h 后,再用2 倍MHB 調(diào)整E. coli菌液的 OD600值在0.08~0.1 之間,備用。

以96 孔透明微板為實驗載體,首先為了防止邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生,在微板四邊共36個微孔中分別加入200 μL 的 Milli-Q 水。 其次,在第 2、6、7 和 11 列的24 孔分別加入100 μL 超純水作為空白對照組,剩余的36個微孔為處理組,按照預(yù)實驗確定的稀釋因子分別加入12個不同濃度梯度的100 μL 藥物溶液,每個濃度梯度設(shè)3個平行。 最后,向空白微孔和處理微孔中分別加入100 μL 的菌液,使每個微孔的總體積為200 μL。 重復(fù)以上操作3 次,共3 塊板,并在每次實驗均單獨設(shè)置3 塊96 孔板同步監(jiān)測E.coli在微孔中的生長曲線情況,作為陰性對照組。然后再將微板置于(37±1) ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在暴露時間分別為 0.25、2、4、8 和 12 h 時,取出并在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD600值,96 孔透明微板中空白組和藥物濃度梯度設(shè)計示意圖參見文獻(xiàn)[30-31]。 3 種抗生素及其三元混合物對E. coli的抑菌性計算公式如下:

式中:I0為空白對照的OD600平均值,I為各濃度梯度的OD600平均值,x%為抗生素對E. coli的生長抑制率。

1.3 混合物的實驗設(shè)計

為有效地研究混合物中組分之間的相互作用,采用均勻設(shè)計射線法設(shè)計了3 種抗生素的三元混合體系,共5 條混合物射線,每條射線有12個濃度梯度[32]。 三元混合物的各組分濃度配比(pi)如表2 所示,其中 R1、R2、R3、R4 和 R5 是 PEN、PHE 和 PIP三元混合物體系的5 條混合射線。

表2 三元混合物(PIP-PEN-PHE)的組分濃度配比(pi)Table 2 The component concentration ratio (pi) of ternary mixture (PIP-PEN-PHE)

1.4 濃度-效應(yīng)曲線擬合

應(yīng)用APTox 軟件對不同暴露時間下的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合[33],擬合函數(shù)為Logit 或Weibull 函數(shù),其表達(dá)式如下:

式中:E為效應(yīng)(0≤E≤1),c為單個化合物或者混合物濃度,α和β為模型參數(shù)。

1.5 混合物抑菌作用分析

濃度加和(CA)模型能夠很好地評估混合物組分間的相互作用[34],其表達(dá)式如下:

式中:Ci表示混合物產(chǎn)生總效應(yīng)為x%時第i種組分的濃度,ECx,i為i組分單獨存在時產(chǎn)生等效應(yīng)x%時的效應(yīng)濃度。 如果由CA 模型預(yù)測結(jié)果大于、小于和等于混合物的實際觀測值,則認(rèn)為該混合物組分間發(fā)生了協(xié)同作用、拮抗作用和加和作用。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 3 種抗生素對E. coli 的時間毒性微板分析方法的建立及其抑菌活性

通過調(diào)整培養(yǎng)基成分比例和培養(yǎng)條件、暴露時間、增加藥物濃度梯度以及實驗濃度重復(fù)次數(shù)等因素,建立了基于E.coli的t-MTA。 其中,暴露時間點為 0.25、2、4、8 和12 h,與傳統(tǒng)方法的某一特殊暴露時間點相比,多個暴露時間點更有利于污染物的抑菌作用的動態(tài)變化規(guī)律研究;采用最小二乘法計算出的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)的負(fù)對數(shù)(pEC50)作為評價抑菌活性大小的指標(biāo),并在此基礎(chǔ)上設(shè)計了混合物體系,相較于傳統(tǒng)方法中最小抑菌濃度(EC80)更有代表性;在微板設(shè)計上,增加了實驗重復(fù)次數(shù)和空白對照數(shù)量,并同步監(jiān)測E. coli在微孔中的生長曲線情況,作為陰性對照組,大大提高了實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性;實驗將初始菌液濃度的OD600值嚴(yán)格控制在0.08 ~0.1 范圍之內(nèi),確保了初始菌液濃度的一致性,減小了干擾因素。 總之,相比于傳統(tǒng)方法只能獲得某一特殊暴露時間的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)的缺點,優(yōu)化后的t-MTA 法不僅能夠獲得多種污染物或混合藥物的多濃度梯度、多濃度比例和多暴露時間點抑菌作用實驗數(shù)據(jù),而且能更大限度地使試驗點分散更均勻、代表性更強(qiáng)、更接近于最優(yōu)條件和可探究的影響因子更多,且簡便不易出錯,優(yōu)點明顯。 此外,還能夠準(zhǔn)確地得到不同抑菌率下的實驗數(shù)據(jù)和藥物的抑菌濃度,這也可為醫(yī)藥類相關(guān)的研究提供佐證,所以,對于E. coli的多種混合藥物的多濃度梯度、多濃度比例和多暴露時間點抑菌作用實驗的優(yōu)化研究有一定的創(chuàng)新價值。

基于已建立的t-MTA 法,系統(tǒng)測定了3 種抗生素對E. coli的抑菌活性數(shù)據(jù),且采用非線性最小二乘法擬合單個藥物對E. coli在不同暴露時間的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)[35]、模型擬合參數(shù)α和β、擬合效應(yīng)的均方根誤差(RMSE)、擬合相關(guān)系數(shù)(R)以及半數(shù)效應(yīng)濃度負(fù)對數(shù)(pEC50)等結(jié)果如表3 所示。 3 種藥物的時間-劑量-效應(yīng)曲線(t-CRC)如圖1 所示。

由表3 可知,以t-MTA 測定的實驗結(jié)果不僅分散均勻,而且測試數(shù)據(jù)的精密度和代表性更高,幾乎所有數(shù)據(jù)R＞0.90、RMSE＜0.10,說明3 種藥物的劑量-效應(yīng)關(guān)系均可用 Weibull 函數(shù)有效表征。 以pEC50為指標(biāo),3 種藥物對E.coli的抑菌活性大小關(guān)系隨暴露時間的變化而變化,但均隨暴露時間的延長而增大。 3 種藥物對E. coli的抑菌性大小關(guān)系為:在暴露時間為0.25 ~2 h 時,3 種藥物對E. coli的呈現(xiàn)微弱抑菌性;在暴露時間為4 h 時,抑菌活性大小關(guān)系為PEN(pEC50=3.47)＞PHE(pEC50=3.32)＞PIP(pEC50=2.81);在暴露時間為8 ~12 h 時,抑菌活性大小關(guān)系為PIP(pEC50=4.46 ~5.21)＞PEN(pEC50=4.16 ~4.39)＞PHE(pEC50=4.01 ~4.39)。 總的來看,3 種藥物抑菌活性大小整體表現(xiàn)為PIP＞PEN＞PHE。

表3 3 種抗生素的Weibull 函數(shù)擬合結(jié)果及其統(tǒng)計學(xué)參數(shù)Table 3 Fitted results by Weibull function and some statistics for the three antibiotics

由圖1 可知,3 種藥物對E. coli的 t-CRC 均為典型的“S”型,且均具有明顯的時間依賴性。 在暴露時間為0.25 h 時,3 種藥物對E. coli均未表現(xiàn)出抑菌性,即3 種藥物對E.coli均無急性抑菌性;在暴露時間為4 ~12 h 時,3 種藥物對E. coli的抑菌性,均隨著暴露時間的延長而不斷增大,且3 種抗生素的最大抑菌率達(dá)到了95%以上。 青霉素類抗生素是通過阻止細(xì)菌轉(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)肽,抑制其細(xì)胞壁的形成,進(jìn)而促使細(xì)菌的衰亡,且該過程是需要一定時間才能完成的[36],即暴露時間是影響藥物抑菌性效果的重要因素之一,只有充分地考慮時間對實驗結(jié)果的影響,才能更加全面地得出準(zhǔn)確的結(jié)論[37]。 以上結(jié)果也表明,基于E. coli的t-MTA 分析方法可以用來測定和分析不同暴露時間和濃度抗生素對E. coli的抑菌活性的影響,且該法不僅降低了工作強(qiáng)度,而且提高了實驗數(shù)據(jù)量。

圖1 3 種抗生素的時間-濃度-效應(yīng)曲線隨時間變化曲線Fig.1 Time-concentration-effect curve change over time for three kinds of antibiotics

2.2 3 種抗生素的三元混合物對E. coli 的時間依賴抑菌活性

想要得到精準(zhǔn)全面的實驗結(jié)果,不僅要充分考慮時間對藥物抑菌性的影響,而且更要關(guān)注到藥物濃度的大小、組成成分和濃度比等重要因素對抑菌性的影響[38]。 因此,本文研究了三元混合物PENPHE-PIP 初始藥物濃度大小、濃度比和暴露時間對其抑菌活性的影響。 三元混合物的各擬合參數(shù)結(jié)果如表4 所示,其t-CRC 如圖2 所示。

圖2 三元混合物(PIP-PEN-PHE)的時間-濃度-效應(yīng)曲線Fig.2 The time-concentration-effect curve of ternary mixture (PIP-PEN-PHE)

表4 三元混合物體系的Weibull 函數(shù)擬合結(jié)果及其統(tǒng)計學(xué)參數(shù)Table 4 Fitted results by Weibull function and some statistics for ternary mixture system

由表4 可知,運用UD-Ray 所構(gòu)建的三元混合物體系,所有數(shù)據(jù)基本呈現(xiàn)為R＞0.90、RMSE＜0.10,說明UD-Ray 法適用于構(gòu)建多元混合體系以進(jìn)行E. coli的抑菌性實驗,三元藥物混合體系的5 條射線的劑量-效應(yīng)關(guān)系均可用Weibull 函數(shù)有效表征,且運用UD-Ray 所構(gòu)建的三元混合物體系所得的實驗數(shù)據(jù)極具代表性。 以pEC50為指標(biāo),5 條射線對E. coli的抑菌性大小關(guān)系為:在暴露時間為0.25 ~2 h 時,三元混合物的5 條射線對E. coli的呈現(xiàn)微弱抑菌性;在暴露時間為4 h 時,抑菌性大小關(guān)系為R2(pEC50=3.61)＞R4(pEC50=3.54)＞R5(pEC50=3.39)＞R3(pEC50=3.33)=R1(pEC50=3.33);在暴露時間為8~12 h 時,抑菌性大小關(guān)系為R4(pEC50=4.86 ~5.43)＞R5(pEC50=4.79 ~5.28)＞R3(pEC50= 4.48 ~4.70)＞R2(pEC50=4.40~4.52)＞R1(pEC50=3.81~4.00)。

綜上所述,探究多元藥物混合體系對E. coli的抑菌性可用UD-Ray 構(gòu)建,三元混合藥物對E. coli的抑菌性大小關(guān)系隨暴露時間的變化而變化,且均隨暴露時間的延長而增大。 抑菌大小關(guān)系整體表現(xiàn)為 R4＞R5＞R3＞R2＞R1。

由圖2 可知,三元混合體系的5 條射線CRC 曲線表現(xiàn)出典型的“S”型,且對E. coli的抑菌活性均具有明顯的時間依賴性。 在暴露時間為0.25 h 時,5條射線對E. coli均未表現(xiàn)出抑菌性,即均無急性抑菌性;在暴露時間為2 h 時,5 條射線均在中濃度、低濃度區(qū)域表現(xiàn)無抑菌性,在高濃度區(qū)域表現(xiàn)出微弱抑菌性;在暴露時間為4 ~12 h 時,5 條射線的CRC曲線表現(xiàn)出明顯的上揚趨勢,整體表現(xiàn)出低濃度區(qū)域具有微弱抑菌效果,而中高濃度區(qū)域的抑菌效果較為明顯。 方翼和王睿[39]研究指出,青霉素類抗生素的殺菌活性對藥物的濃度依賴性較小,但對藥物與細(xì)菌接觸時間的依賴性較大,這可能是“5 條射線的總趨勢變化基本相同,均隨暴露時間的延長抑菌性不斷增大”的主要原因。 此外,低濃度的青霉素類抗生素僅會引起細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)變化,但高濃度的青霉素類抗生素會使細(xì)菌的細(xì)胞裂解,這可能是高濃度的藥物對E. coli抑制率較高的原因之一[40]。

結(jié)合表2 和圖3 可知,在三元混合體系中,暴露時間為12 h 時,5 條混合射線的抑菌大小關(guān)系為R4＞R5＞R3 ＞R2 ＞R1,該順序與 5 條混合射線中組分PIP 的濃度大小關(guān)系(PPIP:R4＞R5＞R3＞R2＞R1)基本一致(R=0.9189, RMSE=0.0703),體現(xiàn)了組分依賴抑菌性,且混合物射線中組分PIP 的濃度比越大,5 條混合射線的抑菌性就越大,體現(xiàn)了濃度比依賴抑菌性,即三元混合物對E. coli的抑菌性大小隨著組分中PIP 的濃度變化而變化。 有研究表明,PIP 對E. coli的抑菌效果明顯優(yōu)于其他青霉素類抗生素,這也可能是三元混合物的整體抑菌效果與PIP 濃度比相關(guān)性較高的原因之一[9]。

圖3 5 條三元混合射線的毒性(pEC50 值)與PIP 組分濃度比(pPIP)之間的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between toxicity (pEC50 value) of 5 ternary mixed rays and concentration ratio (pPIP)of the component PIP

綜上所述,三元混合體系的5 條射線對E. coli的抑菌活性,不僅均具有明顯的時間依賴性,而且均具有組分濃度比依賴抑菌性,且高濃度區(qū)域的抑菌效果較為顯著。 這也進(jìn)一步證實了藥物的抑菌效果與暴露時間、藥物濃度的大小、藥物的組分和藥物的濃度比的因素密切相關(guān)。 以上結(jié)果也表明,基于E.coli的t-MTA 分析方法可以用來測定和分析不同暴露時間和濃度的抗生素混合物對E. coli的抑菌活性,即該法為研究多因素對E. coli抑菌性的影響提供了參考。

2.3 3 種抗生素的三元混合物相互作用分析

由圖4 可知,三元混合物體系的5 條射線,在暴露時間0.25 h 時,CA 模型預(yù)測線均位于95%置信區(qū)間之內(nèi),即此時5 條混合射線表現(xiàn)為加和作用,且無急性抑菌性;隨著暴露時間的延長,在暴露時間為2 ~12 h 時,CA 模型預(yù)測線均位于95%置信區(qū)間之內(nèi),且低濃度區(qū)域的CA 預(yù)測線與擬合曲線的重合度較高,但中濃度、高濃度區(qū)域的CA 預(yù)測線與擬合曲線的重合度較低,即此時5 條混合射線在低、中、高濃度區(qū)域整體呈現(xiàn)出典型加和作用,但在中濃度、高濃度區(qū)域具有明顯的協(xié)同或拮抗作用趨勢。 可能是因為青霉素類抗生素抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁形成的過程發(fā)生在細(xì)胞的繁殖期,且青霉素類既是繁殖期殺菌劑,又是時間依賴性抗生素[41];也可能與三元混合物體系中的決定性組分的變化緊密相關(guān)[42]。 此外,也可能因為3 種藥物同屬青霉素類抗生素,其對E.coli的抑菌作用機(jī)制相同,當(dāng)它們聯(lián)合使用時會對抑菌結(jié)合位點形成競爭關(guān)系,且由于青霉素類抗生素具有獨特的時間依賴抑菌性,在暴露時間較短時,其抑菌作用較低[43-45]。

綜上所述,針對耐藥菌問題,應(yīng)從藥物的組分、濃度、濃度比和暴露時間等多角度進(jìn)行考察,科學(xué)合理地制定對策。 暴露時間較短時,可能并不能透徹地剖析混合物的相互作用及其抑菌機(jī)理。 因此,全面地研究和收集藥物在不同組分、濃度、濃度比和暴露時間條件下的動態(tài)實驗數(shù)據(jù),不僅有利于藥物作用規(guī)律的總結(jié),更有利于為解決耐藥菌問題提供新的解決思路。 此外,只有避免濫用抗生素,才能夠從源頭減少其生態(tài)危害。

通過以上結(jié)果分析,可得出:

(1) 通過對實驗條件、數(shù)據(jù)處理方法和混合體系設(shè)計等多方面因素進(jìn)行優(yōu)化后,建立了基于E. coli的t-MTA,與傳統(tǒng)方法相比,不僅操作簡便、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,而且可探測的濃度范圍更廣,為研究多因素對E. coli抑菌性的影響提供了參考方法。

(2) 應(yīng)用t-MTA 系統(tǒng)地分析了3 種不同濃度青霉素類抗生素及其混合物對E. coli在不同暴露時間的抑菌性,3 種青霉素類抗生素對E. coli的抑菌性具有明顯的時間依賴性,且濃度-效應(yīng)曲線呈現(xiàn)出典型的“S”擬合性狀。 隨暴露時間的延長,3 種抗生素對E. coli的抑菌活性不斷增加,且在不同暴露時間,抗生素對E. coli的抑菌性大小關(guān)系略有不同。在暴露0.25 ~2 h 時,3 種抗生素對E. coli的均無明顯急性抑菌作用;在暴露4 h 時,抑菌作用大小關(guān)系為 PEN(pEC50=3.47)＞ PHE(pEC50=3.32)＞PIP(pEC50=2.81);在暴露8 ~12 h 時,抑菌作用大小關(guān)系為PIP(pEC50=4.46 ~5.21)＞ PEN(pEC50=4.16 ~4.39)＞PHE(pEC50=4.01 ~4.39)。

(3)3 種抗生素三元混合體系的5 條射線對E.coli的抑菌性具有明顯的時間依賴性,抑菌活性大小關(guān)系整體表現(xiàn)為R4＞R5＞R3＞R2＞R1,該順序與5條混合射線中組分PIP 的濃度大小關(guān)系基本一致(R=0.9189,RMSE=0.0703),即三元混合物對E.coli的抑菌性,不僅具有明顯的時間依賴性,而且具有組分濃度比依賴抑菌性。

(4)3 種抗生素單元及其三元混合物,在暴露時間相同時,對E. coli的抑菌大小隨藥物的濃度升高而增大;在藥物濃度相同時,對E. coli的抑菌性隨暴露時間的延長而增大。

(5) 依據(jù)CA 模型,三元混合物體系對E. coli的抑菌性相互作用,整體呈現(xiàn)為經(jīng)典的加和作用。