低溫等離子體降解嘔吐毒素效果評(píng)價(jià)及降解規(guī)律解析

邢常瑞, 孔志康, 洪 靜, 趙璐玲, 陳露語, 袁 建, 嚴(yán)文靜

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1,南京 210023)(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院2，南京 210095)

真菌毒素是糧食生長、收獲和儲(chǔ)藏環(huán)節(jié)需要高度重視的危害物。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，又稱為嘔吐毒素(Vomitoxin)，是小麥赤霉病發(fā)生過程中在糧食籽粒中產(chǎn)生的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)人體和畜禽動(dòng)物具有很強(qiáng)的毒性，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為第3類致癌物。在我國，小麥及相關(guān)麥類產(chǎn)品中DON的污染限量為1 000 μg/kg[1]。

小麥中DON超標(biāo)會(huì)降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成動(dòng)物拒食、生長停滯甚至中毒死亡。因此，國內(nèi)外對(duì)糧食或飼料中DON的處理和降解做了廣泛研究。不同的處理方法已經(jīng)用于糧食或其他食品中DON的降解并進(jìn)行了評(píng)價(jià)，比如加熱烘烤[2]、化學(xué)試劑處理[3]、微生物酶促轉(zhuǎn)化[4]、超聲波處理[5]、輻照和光照處理[6]、臭氧處理[7]及低溫等離子處理[8]等。其中，低溫等離子體技術(shù)作為一種新型的非熱加工品質(zhì)安全控制技術(shù)，近年來引起人們的廣泛興趣，可以殺滅食品中的微生物、降解真菌毒素并維持相關(guān)食品品質(zhì)[9]。該技術(shù)及相關(guān)設(shè)備能產(chǎn)生包含具有高反應(yīng)活性的組分(活性氧和活性氮)、離子、自由基、紫外線并與DON分子發(fā)生碰撞和反應(yīng)使之降解，比單一使用臭氧或者紫外線的效率高[10]。

為評(píng)價(jià)等離子體氣降解DON的可行性，本研究采用同軸雙介質(zhì)脈沖低溫等離子體設(shè)備產(chǎn)生等離子體氣對(duì)DON溶液進(jìn)行處理，分析降解效率，鑒定相關(guān)降解產(chǎn)物并分析其毒性，同時(shí)對(duì)相關(guān)降解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜裂解途徑分析，為后續(xù)等離子體相關(guān)設(shè)備及相關(guān)技術(shù)聯(lián)用在小麥及玉米中DON降解脫毒的應(yīng)用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，乙腈(色譜級(jí))，同軸雙介質(zhì)脈沖低溫等離子體設(shè)備，質(zhì)譜儀(AB Sciex TripleTOF? 5600)，HMG001快速檢測及監(jiān)測分析箱，DON膠體金定量檢測試紙條。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 同軸雙介質(zhì)脈沖低溫等離子體設(shè)備搭建

脈沖交流高壓電源為CTP-2000K，反應(yīng)器采用同軸雙介質(zhì)阻擋放電形式，介質(zhì)管為石英玻璃材料，外部介質(zhì)管長度350 mm，外徑25 mm，厚度2.5 mm，中心介質(zhì)管長度350 mm，外徑8 mm，壁厚2 mm，介質(zhì)管之間的空氣間隙為6 mm。高壓電極采用150目的不銹鋼網(wǎng)，電極網(wǎng)長度200 mm，居中套在外介質(zhì)管外壁上并用鋼絲固定，低壓電極采用不銹鋼桿，直徑為4 mm，長度為400 mm，低壓電極桿兩端通過螺紋與兩端不銹鋼固定板連接，作為反應(yīng)器低壓端，固定板上有與石英玻璃管截面尺寸一致的凹槽，可將石英玻璃管同軸定位，以形成同軸型雙介質(zhì)阻擋放電結(jié)構(gòu)，固定板上設(shè)置有進(jìn)/出氣管，用于處理氣體產(chǎn)生等離子體。

1.2.2 等離子氣體處理溶液中的DON

配置500 ng/mL的DON溶液和空白水溶液5 mL，各取1 mL置于15 mL離心管中。調(diào)整等離子設(shè)備出氣口高度，保持出氣口與溶液液面1～2 cm距離，持續(xù)產(chǎn)生的等離子體氣對(duì)溶液進(jìn)行吹掃。由于等離子氣體只在液面與DON進(jìn)行接觸，為確保DON充分降解并獲得足夠的降解產(chǎn)物用于質(zhì)譜檢測和結(jié)構(gòu)分析，通過等離子氣吹干溶液，加入1 mL乙腈水溶液(50%)溶解，震蕩后過膜保存。

1.2.3 膠體金試紙條方法測試降解效果

按照LS/T 6113—2015《糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定 膠體金快速定量法》采用膠體金快速檢測試紙條對(duì)降解效果進(jìn)行測試[12]。

1.2.4 液質(zhì)聯(lián)用儀測定降解效果及降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

采用LC-Triple ToF 5600高分辨質(zhì)譜對(duì)DON降解前后進(jìn)行分析和測試，測定經(jīng)等離子氣吹干處理并重新垂懸的DON標(biāo)準(zhǔn)溶液(500 ng/mL)及空白水對(duì)照垂懸樣品溶液及未處理的DON標(biāo)品溶液(500 ng/mL)。儀器采用正離子采集模式，色譜和質(zhì)譜相關(guān)設(shè)置參考實(shí)驗(yàn)室歷史使用條件[13]。對(duì)獲得數(shù)據(jù)使用Peak view 2.0和Metabolite Pilot進(jìn)行降解產(chǎn)物預(yù)測和分析，通過Mass Frontier 7.0軟件對(duì)可能存在的分子的二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析。

1.2.5 基于質(zhì)譜裂解碎片分析的DON低毒性降解產(chǎn)物確認(rèn)

對(duì)于軟件給出的降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和相關(guān)信息進(jìn)行分析，排除無二級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜得分較低的結(jié)果，并分析降解后的化學(xué)式、中性質(zhì)量、質(zhì)核比(m/z)、保留時(shí)間及可能的轉(zhuǎn)化方式。同時(shí)深入分析等離子氣降解產(chǎn)物的降解規(guī)律，解析低毒性的降解產(chǎn)物的質(zhì)譜碎片裂解規(guī)律，確認(rèn)降解途徑。

1.2.6 基于膠體金快速定量檢測方法評(píng)價(jià)低溫等離子體對(duì)小麥的水提取液中DON降解效果

在恒溫恒濕箱中，將1 mL的禾谷鐮刀菌孢子液(5logCFU)噴灑到50 g經(jīng)輻照的小麥表面，置于錐形瓶中搖混均勻，于28 ℃和85% 濕度條件下培養(yǎng)2 d，然后取出后在90 ℃烘箱中烘干2 h。將小麥分次在研磨儀中研磨30 s，合并小麥全粉并混合均勻。稱取6 g小麥粉，加入24 mL水提取液，震蕩提取3 min，在4 000 r/min條件下離心3 min，然后取3 mL上清溶液，將出氣口置于液面以下0.5 cm處，用等離子體氣分別處理 0、2、5、15 min。同時(shí)按同樣的方法做陰性小麥粉的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。小麥粉的水提取液及其等離子體處理后的溶液分別用膠體金快速試紙條法進(jìn)行測定，評(píng)價(jià)降解效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)溶液的降解效果

將1.2.2中配置的DON標(biāo)品溶液經(jīng)過等離子體吹干之后，加入1 mL乙腈水溶液(50%)溶解，震蕩后過膜，取30 μL 垂懸液加入270 μL樣品稀釋液，然后按照試紙條操作說明進(jìn)行測定。同時(shí)將0、100、500 ng/mL的未經(jīng)處理的標(biāo)品溶液，用樣品稀釋液稀釋10倍后，按照同樣方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示標(biāo)品溶液(0、100、500 ng/mL)的RLU值(檢測線光密度值/控制線光密度值)分別為2.36、1.42和0.72；而經(jīng)過等離子體吹干處理后的樣品的RLU值為2.2，數(shù)值接近于空白標(biāo)品的檢測結(jié)果。說明等離子體處理后的樣品溶液經(jīng)過長時(shí)間等離子體氣吹干處理，DON發(fā)生了降解反應(yīng)。

DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)等離子體氣吹干溶解并過膜后，進(jìn)行高分辨質(zhì)譜檢測，色譜和質(zhì)譜條件按照文獻(xiàn)方法[13]進(jìn)行設(shè)置。同時(shí)操作等離子體處理的空白水對(duì)照組和未處理的500 ng/mL DON標(biāo)品溶液。檢測結(jié)果表明，在未處理的500 ng/mL DON標(biāo)品溶液中檢出DON，而經(jīng)過處理的500 ng/mL DON標(biāo)品溶液和空白水對(duì)照組中都未檢出，結(jié)果如圖1所示。測定結(jié)果與膠體金快速檢測結(jié)果一致。

注：選擇離子(297.133±0.002 5) u，a為500 ng/mL DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，b為500 ng/mL DON標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過等離子體氣吹干后垂懸過膜溶液。圖1 DON分子結(jié)構(gòu)及選擇離子流圖

2.2 主要降解產(chǎn)物的變化方式和檢測信息

根據(jù)LC-Triple ToF 5600檢測和分析，解析出以下15種DON降解產(chǎn)物，結(jié)果見表1和表2。主要發(fā)生的轉(zhuǎn)化方式為甲基化、去甲基化、去飽和、氫化、—H2O等，產(chǎn)物分子中性質(zhì)量范圍在250.12～326.10。

表1 可能存在的DON降解物的檢測信息

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)預(yù)測信息可知，DON發(fā)生降解的位點(diǎn)主要在3位羥基、3-4位碳鍵、5位甲基、6位羥甲基、7-羥基、8位羰基、12位環(huán)氧基和15位羥基。研究表明12位環(huán)氧基的結(jié)構(gòu)變化可以顯著降低DON的毒性[14]，3位和15位羥基的變化可以造成毒性的降低或者升高[4]；而另一個(gè)毒性基團(tuán)9位烯鍵在等離子體處理中并未發(fā)生降解。卞科研究團(tuán)隊(duì)[15]基于高效液相-四級(jí)桿軌道阱質(zhì)譜儀研究了臭氧降解DON產(chǎn)物，其中報(bào)道的10個(gè)降解產(chǎn)物中有3個(gè)與本研究推導(dǎo)的產(chǎn)物具有相同的分子質(zhì)量，其分子式分別為酮基化產(chǎn)物M4、氧化產(chǎn)物M10和去甲基和羧基化產(chǎn)物M2，進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)信息確證，須結(jié)合核磁等技術(shù)進(jìn)一步分析。盡管等離子體中的活性氧和活性氮對(duì)降解起到主要作用，本研究降解產(chǎn)物中氧原子個(gè)數(shù)最大為8個(gè)，低于卞科研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的最大氧原子數(shù)量10個(gè)[15]，說明等離子體中臭氧的產(chǎn)生具有一定的降解效果，但是無法引起高比例的氧化降解。另外，在飽和臭氧濃度條件下，受到臭氧作用，降解可能發(fā)生在C9-10雙鍵，生成2個(gè)氧原子加成中間產(chǎn)物，而其余分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，然而作者并未對(duì)可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜解析[16]。表2 中的結(jié)構(gòu)為軟件給出的預(yù)測結(jié)構(gòu)，其中M2、M4、M10與母體結(jié)構(gòu)相比多了1個(gè)或者2個(gè)氧原子。也可能存在其他的結(jié)構(gòu)形式，比如M14，有可能以de-epoxy-DON形式存在，這種轉(zhuǎn)化方式存在于熱處理和微生物轉(zhuǎn)化過程。因此，進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)信息確證，需要通過核磁等其他技術(shù)分析。在這15個(gè)降解產(chǎn)物中，M14、M2和M3均在未降解的標(biāo)品溶液中檢測到，這可能是標(biāo)品純化工藝不足或者有機(jī)溶劑溶解配制后發(fā)生轉(zhuǎn)化導(dǎo)致。

表2 DON降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)預(yù)測信息

此外，DON分子結(jié)構(gòu)的降解發(fā)生位點(diǎn)對(duì)膠體金免疫試紙條的檢測結(jié)果具有重要的影響。DON的抗體特異性是膠體金試紙條特異性和靈敏度的關(guān)鍵，在本研究中所使用的抗體對(duì)另外3種DON類似物分子具有不同的識(shí)別特性，結(jié)果見表3。DON的抗體特異性對(duì)3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇交叉反應(yīng)率為小于70%，對(duì)15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和氧雪腐鐮刀菌烯醇交叉反應(yīng)率為小于1%，說明抗體結(jié)合位點(diǎn)靠近4位和15位，稍微遠(yuǎn)離3位。因此，在降解產(chǎn)物M1、M2、M4、M7、M10、M13，可以被膠體金試紙條方法檢出；而M3、M5、M6、M8、M9、M11、M12、M14和M15降解產(chǎn)物無法被膠體金試紙條方法檢出。膠體金試紙條的測試結(jié)果表明DON降解產(chǎn)物中M1、M2、M4、M7、M10、M13占優(yōu)勢(shì)。

表3 DON抗體交叉反應(yīng)率

2.3 DON環(huán)氧基降解產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解

根據(jù)母體DON分子的質(zhì)譜結(jié)果并分析碎片歸屬，如圖2和圖3所示。結(jié)果表明，質(zhì)譜檢測獲得的二級(jí)質(zhì)譜峰基本能夠與軟件模擬裂解的結(jié)果對(duì)應(yīng)。

圖2 DON一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜裂解圖

圖3 DON(C15H20O6/297.13)質(zhì)譜裂解途徑

本研究通過Mass Frontier 7.0 對(duì)DON環(huán)氧基降解的3個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行碎片歸屬解析[5]。結(jié)果表明質(zhì)譜碎片檢測結(jié)果與模擬分子斷裂結(jié)果大部分都能夠完美匹配，極少部分碎片分子質(zhì)量有不大于0.1 u的差距，基本確定了3種降解產(chǎn)物的分子式、分子結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量，化學(xué)反應(yīng)方程結(jié)構(gòu)式，結(jié)果如圖4～圖9所示，其中虛線表示應(yīng)該存在一個(gè)中間斷裂產(chǎn)物，然而質(zhì)譜并未檢測到，可能是由于相關(guān)的碎片信息強(qiáng)度很低。

圖4 DON降解產(chǎn)物M5一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜裂解圖

圖5 DON降解產(chǎn)物M5質(zhì)譜裂解途徑

圖6 DON降解產(chǎn)物M11一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜裂解圖

圖7 DON降解產(chǎn)物M11質(zhì)譜裂解途徑

圖9 DON降解產(chǎn)物M12質(zhì)譜裂解途徑

2.4 低溫等離子體對(duì)小麥粉水提取液中DON的降解效果

DON在干制品中的降解效率比在溶液中低，因?yàn)樵谌芤褐懈右子诋a(chǎn)生活性自由基[8]。本研究首先將等離子氣體在通入小麥粉水提取溶液中，按照0、2、5、15 min進(jìn)行降解處理，通過膠體金快速試紙條檢測分析DON的降解效果。

陰性小麥1的儀器定量檢測RLU為2.37，表明為陰性小麥，不含有DON；而陽性小麥2檢測后檢測RLU值為0.78，儀器定量結(jié)果表明DON含量值大于4 000 μg/kg，繼續(xù)用陰性小麥粉水提取液將陽性小麥2提取液稀釋1倍后檢測(命名為陽性小麥3)，RLU值為1.09，儀器定量檢測換算后表明禾谷鐮刀菌高濃度污染的小麥中DON含量為5 078 μg/kg。

陰性小麥粉水提取液經(jīng)過等離子氣處理2、5、15 min后，通過膠體金試紙條檢測RLU為2.37、2.24、3.5，表明樣品為陰性。陽性小麥研磨成粉后用水提取后，經(jīng)過2、5、15 min處理后，試紙條檢測RLU分別為 1.86、1.17、1.16。

為便于計(jì)算降解效果，測定結(jié)果換算為處理后小麥粒中DON殘留值分別為350、2 134、2 181 μg/kg；分析結(jié)果可知，2 min降解處理，降解效率可達(dá)94%；而在處理5、15 min之后計(jì)算的DON殘留值反而增加，這可能是由于較長時(shí)間的等離子體處理導(dǎo)致小麥粉水提取液中蛋白質(zhì)等組分發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)，增加了檢測過程的基質(zhì)干擾。使用長時(shí)間處理的提取液會(huì)使膠體金定量試紙條出現(xiàn)檢測效果低估的情況。結(jié)果表明，溶液體系中2 min處理即可對(duì)DON具有明顯的降解效果，這為飼料及其他谷物發(fā)酵液或提取液中的DON降解技術(shù)的開發(fā)提供參考。

3 結(jié)論

溶液狀態(tài)的DON經(jīng)過等離子體氣處理后，發(fā)生了降解反應(yīng)，在小麥水提取液中對(duì)DON的降解效率超過94%。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析，推導(dǎo)出降解產(chǎn)物，其中部分降解產(chǎn)物與臭氧降解產(chǎn)物一致。主要發(fā)生降解的位點(diǎn)在3位羥基、3-4位碳鍵、5位甲基、6位羥甲基、7-羥基、8位羰基、12位環(huán)氧基和15位羥基。通過對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜裂解碎片分析，確定了C15H22O5、C15H24O5和C16H24O5裂解途徑。