3株魔芋莖腐病病原菌的分離鑒定與致病性研究

趙興麗 賀圣凌 劉思睿 羅林麗 周羅娜 范士杰 周玉鋒

（1 貴州省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，貴州貴陽 550006；2 貴州省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，貴州貴陽 550006）

魔芋為天南星科（Araceae）魔芋屬（Blume）多年生草本植物，又名蒟蒻、蒟芋、蒻頭、鬼芋，磨芋等，全屬共有記載160 余種（吳祝平，2007；徐煒，2011）。其球莖中含有蛋白質(zhì)、維生素、葡萄甘露聚糖、谷氨酸和甘氨酸等17 種人體必需氨基酸以及磷、鉀、鈉、鐵、鋅等多種微量元素（馬俊和齊穎，2006），具有調(diào)整、平衡、改善人體代謝，提高機體免疫力和保健療效的重要功能，在食品、醫(yī)藥、保健、美容以及工業(yè)等方面有著廣闊的開發(fā)前景（周舒婷 等，2014；葛珍珍 等，2021；何國菊 等，2021；林清 等，2021；邱藍昊 等，2021；汪佳文和謝顯珍，2021；王友清 等，2021；韓曉磊 等，2022）。近年來，魔芋的加工與利用越來越受到人們的關(guān)注，魔芋加工品的開發(fā)也越來越多樣化。

魔芋是貴州名、優(yōu)、特農(nóng)作物之一，隨著魔芋消費市場需求的擴大，貴州省致力于打造魔芋產(chǎn)業(yè)鏈，很多地區(qū)已出現(xiàn)相對集中連片種植，據(jù)中國魔芋協(xié)會統(tǒng)計，2021 年貴州省魔芋種植面積約為2.31 萬hm，并在不斷增加。魔芋在種植過程中很容易受到各類病害危害，包括真菌引起的莖/ 根腐病（spp.）（王維 等，2002）、疫?。ǎ▽O道旺 等，2015；王瑞仙 等，2018）、白絹?。⊿acc）（高啟國和張盛林，2004）以及細菌引起的軟腐?。╯ubsp.）（崔雙 等，2021；張卓然 等，2021）等。由鐮刀菌屬（spp.）真菌引起的魔芋莖腐病是魔芋栽培種植過程中的一種重要的土傳病害，大面積暴發(fā)會給魔芋生產(chǎn)帶來毀滅性的災難，增加芋農(nóng)種植風險；雖然不斷有關(guān)于魔芋莖腐病防治方法的研究報道，且產(chǎn)生了一定的作用（段曾平 等，2021；趙小明 等，2021；鄒強，2021），但在實際種植中，魔芋莖腐病仍是魔芋生產(chǎn)中一大難題。球莖是魔芋重要的經(jīng)濟價值所在，莖腐病發(fā)生后會引起魔芋球莖腐爛，給芋農(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失，甚至顆粒無收，但目前針對貴州省魔芋莖腐病致病菌分離鑒定的研究較少。明確種植區(qū)莖腐病的病原種類，了解其致病力，對莖腐病防控過程中農(nóng)藥的選擇及用量具有重要的指導意義。2019 年以來，筆者對貴州省興義市魔芋種植區(qū)魔芋種植中出現(xiàn)的高發(fā)病害進行了調(diào)查，多次在倒伏的魔芋球莖腐爛部分發(fā)現(xiàn)大量鐮刀菌分生孢子，該病害在田間的癥狀主要表現(xiàn)為：發(fā)病初期葉片黃綠色，葉緣倒卷；發(fā)病中期植株黃化萎蔫、倒伏，葉柄有縱的皺折，基部有水浸狀深綠色病斑；發(fā)病后期葉柄基部變成紫褐色，根部甚至塊莖全部腐爛，病株很容易拔出（蔣曉云 等，2015）；明確該地區(qū)魔芋莖腐病病原菌，可為魔芋莖腐病精準防治提供基礎(chǔ)依據(jù)，為魔芋產(chǎn)業(yè)的健康和持續(xù)發(fā)展提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試病樣、培養(yǎng)基及試劑

供試病樣：2019 年7月底在貴州省興義市魔芋種植區(qū)采集具莖腐病典型癥狀的發(fā)病球莖，編號，帶回實驗室進行病原分離。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，蒸餾水1 000 mL），1%水瓊脂（WA）培養(yǎng)基（瓊脂粉1 g，無菌水100 mL）。

供試試劑：Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司，PCR 擴增采用的2×PCR Master Mix 購于天根生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 魔芋莖腐病致病菌的分離純化 采用組織分離法對發(fā)病球莖進行病原分離純化，由于魔芋組織染病后，組織軟化、腐臭，不宜用剪刀操作，故采用整體消毒的方式進行；具體方法為：將魔芋病癥處（腐爛球莖）進行表面消毒，先用75%酒精浸泡1 min，再用3%次氯酸鈉浸泡1 min，最后無菌水沖洗3～5 次；將表面消毒處理后的球莖置于經(jīng)高溫滅菌處理的濾紙上，在超凈工作臺中風干，去掉病癥處的表皮，用鑷子夾取黃豆大小的魔芋病樣組織，鋪于PDA 平板上，25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每天觀察；待從病樣組織塊上長出菌絲，并在組織周圍形成菌落，挑取最外側(cè)菌絲轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)物。

1.2.2 魔芋莖腐病致病菌的形態(tài)學鑒定 純化后的培養(yǎng)物在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，觀察菌落形態(tài)和色澤，并測量菌落直徑；將培養(yǎng)7 d 的純培養(yǎng)物，用無菌水沖洗制成孢子懸浮液，濃度約為1 × 10個·mL，將孢子懸浮液涂布于1%水瓊脂平板上，48 h 后在顯微視野下觀察菌絲、大小型分生孢子、厚垣孢子以及分生孢子梗等的形態(tài)特征；同時滴1 滴孢子懸浮液于雙凹載玻片上，蓋上蓋玻片，25 ℃培養(yǎng)24 h，顯微視野下觀察分生孢子的萌發(fā) 情況。

1.2.3 魔芋莖腐病致病菌的分子生物學鑒定 將實驗用手術(shù)刀在酒精燈下反復灼燒3～4 次，冷卻后刮取培養(yǎng)物的菌絲及分生孢子，按照Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒說明書進行操作提取純培養(yǎng)物的基因組DNA；采用引物：ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）（Seliger et al.，1990）、TEF1-728F/TEF1-rev（5′-CATCGAGA AGTTCGAGAAGG-3′/5′-GCCATCCTTG GAGATACCAGC-3′）（Carbone &Kohn et al.，1999），進行PCR 擴增。PCR 反應體系（25 μL）為：2×Master Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL、通用引物各1 μL、ddHO 9.5 μL。PCR 擴增程序分別為：ITS（94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min）、（95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送于生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并將所得序列經(jīng)過校驗后在NCBI 中進行BLASTn 比對，根據(jù)比對結(jié)果選擇同源性較高的序列構(gòu)建數(shù)據(jù)集。利用BIOEDIT 軟件對數(shù)據(jù)集進行多位點比對并進行手動校正，再利用MEGA 5.01 軟件將2 條堿基序列按照→ITS 的順序進行拼接，獲得1 條含有2 個基因片段的序列，采用最大似然法運用MEGA 5.01軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 魔芋莖腐病致病菌的致病性測定 離體接種：根據(jù)柯赫氏法則將分離得到的菌株回接至魔芋的葉片正面和背面。將分離得到的菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d 后，用打孔器在菌落周圍取直徑為6 mm 的菌餅備用；選擇新鮮的無病斑的魔芋葉片，表面消毒后，用無菌接種針在葉脈兩側(cè)針刺形成傷口，平鋪于裝有潤濕的滅菌紗布的保鮮盒中，葉柄處放濕潤脫脂棉保濕；用無菌接種針挑取菌餅分別接種于葉脈兩側(cè)傷口處，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件（晝/夜）為：28 ℃/22 ℃、95%/75%、14 h/10 h；以接種PDA 平板為對照，試驗設(shè)置5 個生物學重復，接種后觀察并記錄其發(fā)病 情況。

活體灌根接種：將離體接種致病力較強的菌株在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，用無菌水沖洗制成孢子懸浮液，濃度約為1 × 10個·mL，灌根接種于魔芋葉柄周圍，并用滅菌手術(shù)刀劃傷葉柄，每株接種30 mL，以清水為對照，試驗設(shè)置15 個生物學重復，接種后觀察并記錄其發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋莖腐病致病菌的分離純化

通過組織分離法從采自興義市的具莖腐病病癥的魔芋球莖上分離獲得3 株菌株，分別命名為xymy-7、xymy-8、xymy-9。

2.2 魔芋莖腐病致病菌的形態(tài)學鑒定

菌株xymy-7 在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，菌落半徑約為23.5 mm，菌絲生長速度較快，氣生菌絲白色，表面產(chǎn)生土黃色色素，基物表面肉色（圖1-A）；顯微鏡下，小型分生孢子橢圓形或卵圓形，大小為（6.75～16.00）μm ×（2.05～4.00）μm，大型分生孢子馬特形，大小為（34.50～55.00）μm ×（4.55～6.05）μm，壁厚，原生質(zhì)多（圖1-A1）；單瓶梗產(chǎn)孢，產(chǎn)孢梗有長有短（圖1-A2-1、1-A2-2）；適宜條件下，大型分生孢子和小型分生孢子均可萌發(fā)長出菌絲（圖1-A3、1-A4）。通過培養(yǎng)特性及形態(tài)特征，結(jié)合Perez-Hernandez 等（2019）的研究，將菌株xymy-7 初步鑒定為茄腐鐮刀菌（）。

菌株xymy-8 在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，菌落半徑約為22.5 mm，菌落背面淡紫紅色，氣生菌絲呈氈狀，略帶淡紫紅色（圖1-B）；大型分生孢子生長稀少，呈紡錘形至鐮形，孢子較直，大小為（28.05～43.55）μm ×（3.10～4.50）μm，小型分生孢子數(shù)量多，卵形至橢圓形，平直或彎曲，假頭狀著生，大小約（4.55～12.05）μm ×（2.25～3.75）μm（圖1-B1）；分生孢子著生于從菌絲的分生孢子梗旁伸出的產(chǎn)孢細胞上（圖1-B2-1、1-B2-2）；厚垣孢子橢圓形或球形，單個間生；大型分生孢子和小型分生孢子均可萌發(fā)長出菌絲（圖1-B3、1-B4）。結(jié)合前人研究，菌株xymy-8 的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征與Hussain 等（2012）研究的尖孢鐮刀菌（）相似，初步鑒定為尖孢鐮刀菌。

菌株xymy-9 在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，菌落半徑約為24.0 mm，菌絲生長速度較快，氣生菌絲白色，較菌株xymy-7 豐富，表面產(chǎn)生少量土黃色色素，基物表面白色（圖1-C）；小型分生孢子橢圓形或卵圓形，大小為（5.65～14.55）μm ×（2.05～4.25）μm，大型分生孢子馬特形，大小為（33.85～52.00）μm ×（2.65～4.95）μm，原生質(zhì)多（圖1-C1）；單瓶梗產(chǎn)孢，產(chǎn)孢梗有長有短（圖1-C2-1、1-C2-2）；大型分生孢子和小型分生孢子均可萌發(fā)長出菌絲（圖1-C3、1-C4）。通過其培養(yǎng)特性及形態(tài)特征，結(jié)合Perez-Hernandez 等（2019）的研究，將菌株xymy-9 初步鑒定為茄腐鐮刀菌（）。

圖1 3 株魔芋鐮刀菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征（標尺=25 μm）

2.3 魔芋莖腐病致病菌的分子生物學鑒定

根據(jù)NCBI中BLASTn比對結(jié)果，菌株xymy-7和xymy-9的ITS序列與strain GFR03（登錄號：MT447 508.1）的序列相似度均為100.00%，菌株xymy-8 的ITS 序列與strain F1（登錄號：MH553 293.1）的序列相似度達100.00%；菌株xymy-7 和xymy-9 的序列與strain NRRL 52778（登錄號：JF740 846.1）的序列相似度分別為99.26%和99.25%，菌株xymy-8 的序列與f.sp.isolateATCC90245（登錄號：KP964 890.1）的序列相似度為99.42%。根據(jù)比對結(jié)果，下載與目標菌株相關(guān)的同源序列（表1），以isolateLT-C1 為外群，使用MEGA 5.01構(gòu)建最大似然樹（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明菌 株xymy-7 和xymy-9 與聚在同一分支，菌株xymy-8 與具有較高的同源性，支持率為95%，結(jié)合形態(tài)特征將菌株xymy-7和xymy-9 確定為茄腐鐮刀菌（），將菌株xymy-8 確定為尖孢鐮刀菌（）。

圖2 基于ITS 序列和tef 序列構(gòu)建的最大似然樹

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的真菌序列

2.4 魔芋莖腐病致病菌的致病性測定

將3 株鐮刀菌菌餅接種到具傷口并經(jīng)表面消毒后的葉片上，人工氣候箱中培養(yǎng)，菌株xymy-7 培養(yǎng)3 d 后菌餅周圍葉片開始褪綠，出現(xiàn)褐色病斑；培養(yǎng)5 d 后褐色病斑面積擴大；培養(yǎng)7 d 后病斑顏色加深，面積擴大，呈不規(guī)則狀；培養(yǎng)9 d 后菌餅覆蓋處葉片干枯，易脆，呈透明狀。3 株鐮刀菌接種后發(fā)病時間和發(fā)病程度存在一定差異，菌株xymy-7 接種3 d 后葉片就開始褪綠，出現(xiàn)褐色病斑，菌株xymy-9 接種5 d 后菌餅周圍才產(chǎn)生褐色病斑。培養(yǎng)9 d后，與對照（圖3-A、3-E）相比，菌株xymy-7（圖3-B、3-F）和xymy-9（圖3-D、3-H）具有較強的致病性，其菌餅周圍產(chǎn)生黑褐色或褐色病斑，而菌株xymy-8（圖3-C、3-G）沒有致病性，菌餅周圍沒有出現(xiàn)病斑。由于鐮刀菌菌株xymy-7的侵染時間和侵染能力均強于其他2株菌株，故又對其進行活體接種?；铙w接種45 d 后魔芋植株葉片開始褪綠，出現(xiàn)黃色病斑，接種60 d 后（圖4），植株開始倒伏，隨著時間延長，最終干枯死亡。

圖3 離體接種下魔芋鐮刀菌的致病性

圖4 活體灌根接種菌株xymy-7 孢子懸浮液60 d 后魔芋的發(fā)病情況

3 結(jié)論與討論

病害病原種類的確定在植物病害防控中起著十分重要的作用，只有明確病原種類才能有針對性地采取防控措施。隨著分子生物學的快速發(fā)展，形態(tài)特征與基因組DNA 序列分析的結(jié)合極大提高了植物病原種類鑒定的準確性（孫道旺 等，2015；崔月貞 等，2020）。近年來，由于魔芋市場供不應求，且魔芋的經(jīng)濟價值遠高于其他農(nóng)作物，越來越多的人投入到魔芋產(chǎn)業(yè)中。然而魔芋在生長過程中對其生存的環(huán)境（土壤、氣候條件等）及管理（病害防控等）具有較高要求，一旦生存條件不滿足或病害防控不及時，損失將慘不忍睹，甚至絕收。鐮刀菌是一種能夠危害多種作物的病原真菌，研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌可侵染荸薺（Zhu et al.，2014）、辣椒（Hami et al.，2021）、西葫蘆（Perez-Hernandez et al.，2019）、番茄（Lopez et al.，2021）以及核桃樹（Lazarotto et al.，2014）等作物，導致其發(fā)生枯萎病。本試驗發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌還可以侵染魔芋球莖致使球莖腐爛引起莖腐病，給魔芋種植戶帶來巨大的經(jīng)濟損失。為明確引起貴州省興義市魔芋種植區(qū)魔芋莖腐病的病原種類，筆者從發(fā)病魔芋球莖中分離獲得3 株致病菌，命名為菌株xymy-7、xymy-8 以及xymy-9；經(jīng)鑒定，3 株致病菌分屬于2 個種，分別為茄腐鐮刀菌（）和尖孢鐮刀菌（），這與蔣曉云等（2015）、高雪等（2017）研究報道的魔芋根腐病的病原菌為鐮刀菌屬真菌一致。

分離的3 株鐮刀菌中，2 株為茄腐鐮刀菌，1 株為尖孢鐮刀菌；雖然茄腐鐮刀菌的分離數(shù)量多于尖孢鐮刀菌，但是由于取樣地點及數(shù)量較少，不足以說明茄腐鐮刀菌為該地區(qū)魔芋莖腐病優(yōu)勢菌。因此，在今后的研究中還應擴大采樣范圍及采集數(shù)量，明確其優(yōu)勢菌種，采用分子鑒定明確其分類水平，柯赫氏回接掌握其致病性，深入研究魔芋對病原菌的抗逆性及抗病機理等，為魔芋莖腐病的有效精準防控提供理論依據(jù)。

研究表明，病原種類不同，致病力會存在一定的差異性（楊劍鋒 等，2021）；本試驗發(fā)現(xiàn)，茄腐鐮刀菌菌株xymy-7 和xymy-9 均能使魔芋離體葉片發(fā)病，但接種菌株xymy-7 后魔芋葉片發(fā)病程度較接種菌株xymy-9 嚴重，而尖孢鐮刀菌菌株xymy-8 不能使魔芋葉片發(fā)?。淮送馇迅牭毒陎ymy-7 能使魔芋植株發(fā)病倒伏，甚至死亡，離體接種和活體接種結(jié)果均表明茄腐鐮刀菌的致病力強于尖孢鐮刀菌。由于在發(fā)病部位同時分離獲得茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，是否能夠說明田間魔芋莖腐病的發(fā)生可能與多種致病菌（包括茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌）有關(guān)，又是否為復合侵染，尖孢鐮刀菌的存在是否會加速發(fā)病時間和加重發(fā)病程度，需要今后進一步深入研究。

魔芋莖腐病是危害魔芋的一種重要病害，對魔芋的品質(zhì)和產(chǎn)量有巨大的影響，嚴重制約著魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本試驗明確了引起貴州省興義市魔芋種植區(qū)魔芋莖腐病的病原種類以及優(yōu)勢致病菌的種類，對于該病害的防控具有十分重要的現(xiàn)實意義。