黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群的篩選及其促生效果探究

李欣 張旭 剌世凱 謝鷹飛 陳世君 高麗紅 田永強(qiáng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，設(shè)施蔬菜生長(zhǎng)發(fā)育北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要的廢棄物，也是重要的可再生資源。2020年我國(guó)的秸稈產(chǎn)生量為7.71億t，其中包括作物秸稈和蔬菜秸稈。與作物秸稈相比，蔬菜秸稈的營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含水量高，不易燃燒，且容易引發(fā)病蟲(chóng)害（陳慈 等，2021）。雖然我國(guó)每年產(chǎn)生的蔬菜秸稈量巨大，但絕大部分被直接丟棄或者露天焚燒，不僅造成資源浪費(fèi)，而且嚴(yán)重污染環(huán)境（吳文輝 等，2020）。

將蔬菜秸稈原位還田，能夠有效避免因秸稈離田后處置不當(dāng)造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染（陳慈 等，2021；吳文輝 等，2021）。有研究發(fā)現(xiàn)，蔬菜秸稈還田后，其腐熟產(chǎn)生的養(yǎng)分可以增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤質(zhì)量，并提高作物產(chǎn)量（吳文輝 等，2021）。然而，一些蔬菜（特別是果菜類(lèi)）秸稈的主要成分是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的復(fù)雜木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，田間降解難度大（Zhang et al.，2021），這不僅導(dǎo)致了秸稈原位還田后難以被充分利用，而且阻礙了蔬菜秸稈還田腐熟的推廣和普及。

微生物通過(guò)產(chǎn)生纖維素酶將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖，在秸稈降解過(guò)程中發(fā)揮了重要作用（Covino et al.，2020）。在自然條件下，秸稈降解是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果（Qu et al.，2020；Zhang et al.，2021）。近些年，越來(lái)越多的研究發(fā) 現(xiàn)，純培養(yǎng)分離的單菌株的纖維素降解能力較弱，而將多種纖維素類(lèi)降解菌混合培養(yǎng)后，纖維素酶的多樣性增加，多種酶協(xié)同作用共同提高了秸稈的降解率（Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019）。因此，利用微生物間的協(xié)同關(guān)系，人工篩選構(gòu)建一個(gè)高效的協(xié)同降解菌群是提高秸稈降解效率的重要方式。盡管如此，目前鮮見(jiàn)與蔬菜（特別是果菜類(lèi)）秸稈協(xié)同降解菌群篩選相關(guān)的研究報(bào)道，實(shí)際生產(chǎn)中仍缺乏蔬菜秸稈的專(zhuān)性降解菌劑。值得注意的是，在生產(chǎn)中，除評(píng)價(jià)篩選的協(xié)同降解菌群對(duì)秸稈的降解效果外，還應(yīng)關(guān)注菌群是否會(huì)對(duì)作物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。

為解決蔬菜秸稈協(xié)同降解菌群缺乏及其對(duì)作物生長(zhǎng)影響不明確的問(wèn)題，本試驗(yàn)以黃瓜秸稈為試驗(yàn)材料，以菜田土壤、優(yōu)質(zhì)堆肥、蚯蚓糞和生物炭的混合物作為混合物料，采用專(zhuān)化缺碳培養(yǎng)基篩選了能夠?qū)Ｐ越到恻S瓜秸稈的高效協(xié)同降解菌群，測(cè)定了其在黃瓜秸稈降解過(guò)程中的相關(guān)指標(biāo)，分析了該協(xié)同降解菌群的群落組成和碳源利用特征，并通過(guò)種子測(cè)試和幼苗測(cè)試探究了協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的影響。此外，分離純化了協(xié)同降解菌群的單菌株，并鑒定了其纖維素降解能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜品種為中農(nóng)26 號(hào)（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所育成品種）。

磷酸鹽 緩沖液：KHPO0.661 8 g，KHPO0.163 3 g，MgSO0.1 g，NaCl 6.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；液體專(zhuān)化缺碳培養(yǎng)基：MgSO·7HO 0.4 g，KHPO1.323 8 g，KHPO0.326 6 g，CaCl·2HO 0.05 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.01 g，MnSO·HO 2.1 mg，ZnSO·7HO 0.25 mg，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；菌源：在100 mL磷酸鹽緩沖液中加入10 g 固體混合物料（由菜田土壤、優(yōu)質(zhì)堆肥、蚯蚓糞和生物炭混合而成），于28 ℃和200 r·min轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)1 h 獲得。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018 年6月至2021 年9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施蔬菜栽培生理與環(huán)境調(diào)控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群的篩選 將5 g 黃瓜秸稈剪成3～4 cm 長(zhǎng)的小段，裝入125 mL 含有4%（體積比）菌源的液體專(zhuān)化缺碳培養(yǎng)基中，共設(shè)置4 次重復(fù)，于30 ℃和200 r·min轉(zhuǎn)速條件下限制性培養(yǎng)15 d。將培養(yǎng)15 d 的混濁菌液作為菌源，取出5 mL 接種到新的液體專(zhuān)化缺碳培養(yǎng)基中，其余的原料和步驟均不變，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)15 d。如此連續(xù)限制性繼代培養(yǎng)10 代以上（＞ 150 d），得到的菌液即為能夠穩(wěn)定降解黃瓜秸稈的專(zhuān)性高效協(xié)同降解菌群。

盡管身價(jià)倍增，不過(guò)依然有一部分“有錢(qián)、任性”的消費(fèi)者愿意為禮盒包裝的“高顏值”奶糖埋單，或是作為送人的禮品，或是為了滿(mǎn)足自己的“少女心”。

1.2.2 黃瓜秸稈降解特性與協(xié)同降解菌群特征測(cè)定 吸取5 mL 繼代培養(yǎng)10 代后的協(xié)同降解菌群菌液，加入到含有5 g 秸稈的125 mL 液體專(zhuān)化缺碳培養(yǎng)基中繼續(xù)繼代培養(yǎng)，將繼代培養(yǎng)0、1、3、6、9、12、15 d 的秸稈用自來(lái)水沖洗3～4 次，直至將多余的微生物雜質(zhì)沖洗干凈，在65 ℃烘箱烘干至恒重，用百分之一天平測(cè)定降解前和降解后的秸稈干質(zhì)量，計(jì)算秸稈降解率。

式中和W分別為降解前和降解后的秸稈干質(zhì)量。

木質(zhì)纖維素組分采用Goering 和van Soest（1971）的方法測(cè)定并計(jì)算其降解率：將繼代培養(yǎng)0、1、3、6、9、12、15 d 后烘干的黃瓜秸稈，用打樣機(jī)粉碎后過(guò)1 mm 篩孔，稱(chēng)取0.5 g 放入F57專(zhuān)用袋中，用ANKOM220 纖維分析儀（USA）分析纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量。

取繼代培養(yǎng)0、1、3、6、9、12、15 d 的秸稈-菌群混合培養(yǎng)液測(cè)定其pH、菌液濃度OD和纖維素酶活性。pH 采用電位計(jì)法測(cè)定。菌液濃度用OD表征，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。纖維素酶活性（底物為纖維素）采用Ghose（1987）的方法測(cè)定。

1.2.3 黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群的群落組成和碳源利用特征 利用PowerSoil DNA 試劑盒（MoBio Laboratories Inc.，CA，USA）提取協(xié)同降解菌群的總DNA，采用NanoDrop ND-2000（Thermo Fisher Scientific，USA）測(cè)定其濃度和質(zhì)量。以提取的DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序（Li et al.，2021）。細(xì)菌引物為515F（5′-GTGCCAGCMG CCGCGG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′），真菌引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3′）。采用Biolog ECOPLATE（包含31 種單一碳源和1 個(gè)水空白）測(cè)定微生物碳源利用水平（Fan et al.，2016）。

1.2.4 協(xié)同降解菌群中單菌株的分離和鑒定 采用無(wú)菌水梯度稀釋協(xié)同降解菌群，制成10～10濃度的菌懸液，涂布在添加了制霉素的R2A（Bai et al.，2015）固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。挑取合適的單菌落進(jìn)行劃線(xiàn)分離，通過(guò)4～5 代的劃線(xiàn)純化得到單菌株。挑取分離純化的單菌株制備菌懸液進(jìn)行菌落PCR，選用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)細(xì)菌的16S rDNA 基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，根據(jù)同源性在GenBank 中尋找相似性最大菌株的基因序列。使用MEGA 5 軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并用Bootstrap 對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行1 000 次可信度分析。利用高通量測(cè)序獲得菌群的群落組成。

1.2.5 純化單菌株的纖維素降解能力測(cè)定 挑取分離純化的單菌株于滅菌的R2A 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃和200 r·min轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)24 h 制備菌懸液，吸取5 μL 菌懸液點(diǎn)斑在剛果紅-纖維素培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落周?chē)欠裼型该魉馊?，并用直尺測(cè)量水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），每個(gè)單菌株設(shè)置3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 個(gè)皿。

1.2.6 種子測(cè)試 將協(xié)同降解菌群接種至液體專(zhuān)化缺碳培養(yǎng)基中，在30 ℃和200 r·min轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)，直至菌懸液在600 nm 處的吸光值（OD）大于1.0，用無(wú)菌水將菌懸液稀釋成OD值分別為0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 的不同濃度（分別簡(jiǎn)稱(chēng)為OD 0.2、OD 0.4、OD 0.6、OD 0.8 和OD 1.0）。將表面消毒的黃瓜種子（75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3 次，3%次氯酸鈉浸泡8 min，無(wú)菌水沖洗6 次）置于不同OD值的菌懸液中浸泡8 h，以無(wú)菌水為對(duì)照（CK），將浸泡后的種子置于鋪有雙層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿6 粒，分別加入7 mL無(wú)菌水，在28 ℃和70%～80%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)。試驗(yàn)共6 個(gè)處理，每個(gè)處理5 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 個(gè)皿。

培養(yǎng)3 d 后統(tǒng)計(jì)黃瓜種子的發(fā)芽率，用萬(wàn)分之一天平測(cè)定鮮質(zhì)量。采用EPSON EXPERSSION 4900 型掃描儀掃描黃瓜種子苗根系，然后用Win RHIZO 軟件進(jìn)行分析，獲得總根長(zhǎng)、根體積、根表面積。采用Image J 測(cè)定胚軸長(zhǎng)和莖長(zhǎng)。統(tǒng)計(jì)種子活力指數(shù)。

采用EPSON EXPERSSION 4900 型掃描儀掃描黃瓜幼苗根系和葉片，然后用Win RHIZO 軟件進(jìn)行分析，獲得總根長(zhǎng)、根體積、根表面積、根尖數(shù)和最大真葉的葉面積。采用直尺測(cè)量株高，采用數(shù)碼游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗，采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)，采用SAPD 儀測(cè)定最大真葉的葉綠素含量。

將黃瓜幼苗的地上部和地下部自莖底端分開(kāi)后，分別用萬(wàn)分之一天平測(cè)定鮮質(zhì)量，然后在105 ℃的烘箱中殺青30 min 后，85 ℃烘干直至恒重，再測(cè)定干質(zhì)量。

式中TDW、SDW 和RDW 分別表示全株干質(zhì)量、地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量，PH 和SD 分別表示株高和莖粗（Sun et al.，2020）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用EXCEL 2016 和SPSS 23.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及方差分析，采用Tukey’HSD 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜秸稈的降解特性與協(xié)同降解菌群的特征

黃瓜秸稈的降解率、木質(zhì)纖維素含量及秸稈-菌群混合培養(yǎng)液的OD、pH、纖維素酶活性的變化如圖1 所示。在15 d 的培養(yǎng)過(guò)程中，秸稈干質(zhì)量在培養(yǎng)0～6 d 迅速下降，6 d 時(shí)秸稈降解率達(dá)到73.3%；此后，秸稈干質(zhì)量的下降速率變慢，培養(yǎng)15 d 時(shí)秸稈降解率為80.7%。木質(zhì)纖維素組分（特別是纖維素）含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)與黃瓜秸稈干質(zhì)量基本一致。培養(yǎng)15 d 時(shí)，協(xié)同降解菌群對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別是78.8%、74.7%和49.4%。表明協(xié)同降解菌群能夠通過(guò)降解木質(zhì)纖維素組分有效降解黃瓜秸稈。

圖1 黃瓜秸稈降解特性與協(xié)同降解菌群特征隨時(shí)間的變化

在降解黃瓜秸稈的過(guò)程中，協(xié)同降解菌群與秸稈的混合培養(yǎng)液pH 在0～12 d 持續(xù)上升，且0～1 d 的上升速率最快，培養(yǎng)12 d 時(shí)達(dá)最高（8.79），隨后開(kāi)始下降。培養(yǎng)液pH 的上升可能是由于在協(xié)同降解菌群降解黃瓜秸稈的過(guò)程中產(chǎn)生了堿性物質(zhì)所致。OD反映了培養(yǎng)液中微生物的密度。在協(xié)同降解菌群降解黃瓜秸稈過(guò)程中，其OD在培養(yǎng)1 d 后便急劇增加，此后平穩(wěn)上升并于培養(yǎng)6 d 后達(dá)到最大值（2.192），隨后開(kāi)始緩慢下降。這說(shuō)明，當(dāng)以黃瓜秸稈為唯一碳源時(shí)，協(xié)同降解菌群在短期內(nèi)（＜ 1 d）就能迅速大量繁殖并降解大部分黃瓜秸稈。與OD的變化特征相似，纖維素酶活性在培養(yǎng)0～9 d 呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（其中0～6 d 上升迅速），培養(yǎng)9 d 后達(dá)到酶活性高峰（0.110 4 IU），此后呈緩慢下降趨勢(shì)。

綜上所述，黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群的生長(zhǎng)繁殖情況與秸稈干質(zhì)量、木質(zhì)纖維素組分含量、培養(yǎng)液pH 和纖維素酶活性的變化具有一致性和關(guān)聯(lián)性：培養(yǎng)0～6 d 協(xié)同菌群繁殖迅速，pH 和纖維素酶活性迅速上升，而秸稈干質(zhì)量及纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量迅速減少，使得秸稈降解率迅速上升；后期協(xié)同降解菌群生長(zhǎng)緩慢，各個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)也相應(yīng)變緩。

微生物碳源利用水平可以反映秸稈降解過(guò)程中微生物對(duì)不同碳源的利用程度。由表1 可知，協(xié)同降解菌群可以利用31 種碳源中的23 種，只有8種（L-Arginine、i-Erythritol、2-Hydroxy Benzoic Acid、4-Hydroxy Benzoic Acid、α-Cyclodextrin、Glycogen、Itaconic Acid 和α-Keto Butyric Acid）不能被利用。從六大類(lèi)碳源物質(zhì)水平上看，黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群可以利用碳水化合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)、羧酸類(lèi)、酰胺/胺類(lèi)和聚合物類(lèi)的絕大部分。總體來(lái)看，黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群的碳源利用多樣性較高但具有一定的特異性，因本試驗(yàn)是以黃瓜秸稈為唯一碳源進(jìn)行篩選，由此推測(cè)黃瓜秸稈中只含有碳水化合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)、羧酸類(lèi)、酰胺/胺類(lèi)和聚合物類(lèi)五大類(lèi)碳源物質(zhì)。

表1 協(xié)同降解菌群的碳源利用特征

2.2 黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群的群落組成和單菌株特性

在門(mén)水平下，協(xié)同降解菌群的優(yōu)勢(shì)群落（相對(duì)豐富度＞ 1%）為擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、異常球菌門(mén)（Deinococcota）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteriota）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobiota）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）和蛭弧菌門(mén)（Bdellovibrionota）等8個(gè)門(mén)。優(yōu)勢(shì)群落的占比達(dá)到97.88%，其中擬桿菌門(mén)占比最高，達(dá)64.36%（圖2-A）。在屬水平下，協(xié)同降解菌群的優(yōu)勢(shì)群落（相對(duì)豐富度＞ 1%）為、、、、、、、、、、和等12 個(gè)屬，在整個(gè)群落中占比達(dá)到97.88%（圖2-B）。

圖2 協(xié)同降解菌群的群落組成和分離單菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

從協(xié)同降解菌群中分離出33 個(gè)單菌株，基于16S rDNA 測(cè)序和BLAST 同源性比對(duì)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2-C）。絕大多數(shù)的菌株與相似性最高的菌株同源性≥ 97%，但是菌株2-7 和4-24 與相似性最高的菌株同源性分別只有94%和95%（屬于新種屬）。絕大多數(shù)菌株分別屬于、、、、、、，、、、、、、、、、、、、、、和。

在剛果紅-纖維素培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈表明單菌株具有降解纖維素的能力，水解圈直徑與菌落直徑比值（D/d）的大小可表示菌株降解纖維素能力的強(qiáng)弱。本試驗(yàn)共篩選出33 個(gè)單菌株，其中有15個(gè)單菌株產(chǎn)生水解圈，具有降解纖維素的能力（表2）。其中編號(hào)1-3 和5-33 的2 個(gè)菌株降解能力明顯高于其他菌株。由此可知，在黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群中，并非所有的菌株都具有降解纖維素的能力，其他的菌株可能發(fā)揮協(xié)同降解的間接作用或者參與下一步的物質(zhì)分解。

表2 協(xié)同降解菌群中單菌株的纖維素降解能力

2.3 黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的影響

種子苗鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)和活力指數(shù)是反映種子苗生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)。不同OD的協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜種子苗鮮質(zhì)量和根系相關(guān)指標(biāo)的影響如圖3 所示。當(dāng)OD為0.4 和0.6 時(shí)，協(xié)同降解菌群會(huì)顯著增加黃瓜種子苗的鮮質(zhì)量，較CK 分別提高13.4%和16.0%。協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜種子苗的胚軸長(zhǎng)無(wú)影響，但在OD為0.6 和1.0 時(shí)顯著提高了總根長(zhǎng)，較CK 分別提高14.6%和21.2%。在所有OD處理下，協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜種子苗根體積和根表面積無(wú)顯著影響。雖然協(xié)同降解菌群在OD為0.6 和1.0 時(shí)顯著提高了種子的活力指數(shù)，但OD達(dá)到0.4 后所有OD處理間均無(wú)顯著差異。綜上所述，當(dāng)協(xié)同降解菌群的OD達(dá)到0.4時(shí)，能夠增加種子苗鮮質(zhì)量、總根長(zhǎng)和活力指數(shù)，對(duì)黃瓜種子苗具有很好的促生作用。

圖3 協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜種子苗生長(zhǎng)的影響

株高、莖粗、葉片數(shù)、最大葉面積和葉綠素含量是反映幼苗地上部生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)。不同OD的協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響如圖4。除OD 0.2 外，其他OD處理下的株高和莖粗均顯著高于CK，且各處理間的株高和莖粗無(wú)顯著差異。黃瓜幼苗的葉片數(shù)、最大葉面積、地上部鮮質(zhì)量和地上部干質(zhì)量在OD處理間表現(xiàn)出了與株高和莖粗相似的趨勢(shì)。表明當(dāng)OD達(dá)到0.4 時(shí)，協(xié)同降解菌群就能夠?qū)S瓜幼苗地上部生長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用。但是，所有OD處理的黃瓜幼苗葉片葉綠素含量均顯著低于CK，這可能是因?yàn)閰f(xié)同降解菌群處理下葉片生長(zhǎng)快，其葉面積擴(kuò)張使得葉綠素含量相對(duì)較低。由于OD達(dá)到0.4 后，所有OD處理下協(xié)同降解菌群顯著增加了幼苗地上部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，說(shuō)明雖然OD處理的幼苗葉片葉綠素含量低，但并未對(duì)植物光合產(chǎn)生不利影響。總根長(zhǎng)、根體積、根表面積和根尖數(shù)是反映黃瓜幼苗地下部生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo)。除了OD 0.2和OD 0.8，其他濃度的菌液均顯著促進(jìn)了總根長(zhǎng)的增加，其中OD 0.4 的總根長(zhǎng)增加最多，比CK 增加了57.3%。所有OD處理下的協(xié)同降解菌群均顯著增加了根體積，且OD達(dá)到0.4 后顯著增加了根表面積。值得注意的是，與CK 相比，僅OD 0.4處理顯著增加了幼苗根尖數(shù)，增幅為79.0%；地下部鮮質(zhì)量最大值也出現(xiàn)在OD 0.4 處理中。鮮質(zhì)量和干質(zhì)量是幼苗葉片光合和根系吸收水分與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，壯苗指數(shù)反映了幼苗的整體質(zhì)量，是對(duì)幼苗質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)判的關(guān)鍵指標(biāo)。整體來(lái)看，當(dāng)OD達(dá)到0.4 后，所有OD處理間的幼苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和壯苗指數(shù)均顯著高于CK，且各OD處理間的干質(zhì)量和壯苗指數(shù)無(wú)顯著差異。綜合考慮，當(dāng)OD達(dá)到0.4 時(shí)，協(xié)同降解菌群能夠?qū)S瓜幼苗地下部生長(zhǎng)和整體質(zhì)量起到明顯的促進(jìn)作用。

圖4 協(xié)同降解菌群對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，多菌株混合培養(yǎng)對(duì)秸稈的降解效果顯著優(yōu)于單菌株，不同菌株會(huì)分泌不同的纖維素酶系，多個(gè)酶系協(xié)同作用共同加快秸稈的降解（郭夏麗 等，2010；Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019）。本試驗(yàn)篩選的協(xié)同降解菌群能夠高效降解黃瓜秸稈（圖1），且對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率高于前人（Zheng et al.，2020；Chu et al.，2021）的研究結(jié)果。這主要是因?yàn)楸驹囼?yàn)以黃瓜秸稈為唯一碳源，采用專(zhuān)化缺碳培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)持續(xù)繼代直接篩選協(xié)同降解菌群，而不是用單菌株人工構(gòu)建復(fù)合菌群，有利于保持不同菌株的自然協(xié)同關(guān)系，避免菌株間產(chǎn)生拮抗作用。雖然前人報(bào)道了較多的人工組裝復(fù)合菌系（Jawed et al.，2019；Suksong et al.，2019；Zheng et al.，2020；Chu et al.，2021），但相關(guān)研究基本都是針對(duì)大田作物秸稈，而鮮見(jiàn)關(guān)于蔬菜秸稈協(xié)同降解菌群的研究報(bào)道。

瓜類(lèi)作物秸稈的組成結(jié)構(gòu)與糧食作物秸稈（如水稻秸稈、玉米秸稈等）明顯不同，其養(yǎng)分含量較高，且組成比糧食作物秸稈更復(fù)雜。降解纖維素類(lèi)物質(zhì)的酶類(lèi)是一組酶，其相互配合、協(xié)同作用，最后表現(xiàn)為秸稈降解率的提升。本試驗(yàn)篩選獲得的黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群在門(mén)、屬水平下種類(lèi)豐富，優(yōu)勢(shì)群落既包括擬桿菌、變形菌、放線(xiàn)菌和厚壁菌等常見(jiàn)菌屬，也包括異常球菌、疣微菌、髕骨細(xì)菌和蛭弧菌等稀有菌屬（圖2-A、2-B）。由于本試驗(yàn)的協(xié)同降解菌群對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率都相對(duì)較高（圖1），因此推斷自然篩選的協(xié)同菌群更有利于發(fā)揮不同菌株間的協(xié)同作用，同時(shí)有利于保持菌群的穩(wěn)定性。本試驗(yàn)從黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群中分離出的33 個(gè)單菌株中有近一半（15 個(gè)）的單菌株具有降解纖維素的能力，說(shuō)明有些菌株雖然沒(méi)有分解纖維素的能力，但是可能參與秸稈降解的后續(xù)物質(zhì)變化過(guò)程或者維持協(xié)同菌群的穩(wěn)定性。需要注意的是，不同菌株纖維素的降解圈只能表明對(duì)該底物的降解能力，而對(duì)自然界中復(fù)雜底物的降解率與不同纖維素降解菌所產(chǎn)生的分解酶的配比、活性及適宜底物、所在環(huán)境條件都有關(guān)聯(lián)。

種子試驗(yàn)和幼苗試驗(yàn)均表明，當(dāng)黃瓜秸稈協(xié)同降解菌群的OD達(dá)到0.4 時(shí)，就能夠?qū)S瓜種子苗和幼苗生長(zhǎng)及質(zhì)量相關(guān)指標(biāo)起到明顯的改善效果（圖3、4）。當(dāng)協(xié)同降解菌群OD超過(guò)0.4 時(shí)，對(duì)黃瓜種子苗和幼苗的促生效果并沒(méi)有進(jìn)一步增加，表明此密度的降解菌群已占領(lǐng)了種子根系的最大表面積和有效位點(diǎn)，并發(fā)揮最大效能。因此，本試驗(yàn)篩選的協(xié)同降解菌群不僅能夠高效降解黃瓜秸稈，而且對(duì)黃瓜生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。根據(jù)前人的研究報(bào)道，能夠起到促根壯秧效果的微生物種類(lèi)繁多，如（Kloepper et al.，2004）、（Fu et al.，2017）、（Hu et al.，2019）和（Prathibha &Siddalingeshwara，2013）等，而這些菌也正是本試驗(yàn)篩選獲得的能夠協(xié)同降解黃瓜秸稈的菌種（圖2-C）。

總體來(lái)看，本試驗(yàn)基于自然協(xié)同的原理篩選獲得的協(xié)同降解菌群不僅能夠高效降解黃瓜秸稈，而且對(duì)黃瓜生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)效果。采用較低濃度（OD=0.4）的菌懸液，即可獲得較好的促生 效果。