5株假臭草來(lái)源內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化檸檬烯產(chǎn)物分析

梁佩芳，楊道茂

（1.開(kāi)封大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，河南 開(kāi)封 475000；2.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

單萜類物質(zhì)主要存在于揮發(fā)油中，有止痛、抑菌、作昆蟲信息素及昆蟲驅(qū)避劑等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、香料等方面［1］。單萜類化合物由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，一直是理想的生物轉(zhuǎn)化底物。細(xì)菌、真菌、酵母菌和植物細(xì)胞等都可以充當(dāng)生物催化劑角色完成對(duì)檸檬烯［2］、α-蒎烯和β-蒎烯［3］的轉(zhuǎn)化工作，在已報(bào)道的微生物催化劑中，細(xì)菌占41%，真菌占33%［4］。比如：在細(xì)菌中，假單胞屬細(xì)菌（Pseudomonas sp.）能以D-檸檬烯為唯一碳源和能源轉(zhuǎn)化合成紫蘇醇［5-6］，繼而進(jìn)一步氧化成紫蘇醛和紫蘇酸［7-8］。在真菌中，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum 152b）可以將R-（+）-檸檬烯和S-（-）-檸檬烯轉(zhuǎn)化為R-（+）-α-terpineol和limonene-1,2-diol［9］；指狀青霉（Penicillium digitatum）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）可以將（+）-檸檬烯分別轉(zhuǎn)化為α-萜品醇（α-terpineol）［10］和紫蘇酸［11-12］；白曲霉可以轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯，主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為異辣薄荷酮［13］。

除了從細(xì)菌和真菌菌種庫(kù)中篩選具有生物轉(zhuǎn)化劑功能的微生物外，近年來(lái)植物內(nèi)生真菌在生物催化領(lǐng)域的作用開(kāi)始受到重視，并且已經(jīng)有利用植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化單萜化合物的文獻(xiàn)報(bào)道。比如從海藻Bostrychia radicans分離到的內(nèi)生真菌Botryosphaeria sp.能將外消旋樟腦轉(zhuǎn)化為6-endo-羥基樟腦、6-exo-羥基樟腦、5-exo-羥基樟腦、5-endo-羥基樟腦、3-exo-羥基樟腦和8-羥基樟腦［14］?；鹁嫠桑≒inus taeda）來(lái)源的植物內(nèi)生真菌Phomopsis sp.能轉(zhuǎn)化1%的檸檬烯合成0.536 g/L香芹酮和2.08 g/L檸檬烯-1,2-二醇，如果用柑橘皮提取物為底物則生成2.10 g/L檸檬烯-1,2-二醇［15］。因此，無(wú)論從理論還是從實(shí)踐上看，用植物內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化單萜類化合物具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)選取無(wú)環(huán)單萜的月桂烯、單環(huán)單萜的（+）-檸檬烯和（-）-檸檬烯為代表，以假臭草來(lái)源的5株內(nèi)生真菌作為測(cè)試菌株，采用GC-MS手段分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，以期為工業(yè)生物催化尋找合適的微生物菌種。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與材料

試劑：（+）-檸檬烯、（-）-檸檬烯（日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社），（1S,2S,4R）-（+）-二戊烯-1,2-二醇（Sigma-Aldrich公司），無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚均為分析純（國(guó)藥試劑有限公司）。

儀器：ZQZY-75CN振蕩培養(yǎng)箱（上海支楚儀器有限公司）；XH-C旋渦混合器（金壇市白塔新寶儀器廠）；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；H1650醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；Angilent 8860 GC System-5977B GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀器（帶G4513A自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫科技有限公司），色譜柱為安捷倫HP-5ms Ultra Inert（30 m×250μm×0.25μm）。

材料：5株假臭草來(lái)源植物內(nèi)生真菌（PS01、PS06、PS07、PS10、PL14）由華僑大學(xué)王奇志博士饋贈(zèng)，經(jīng)鑒定為子囊菌門［Ascomycota（Berk.）Caval.-Sm.］鏈格孢屬（Alternaria Nees）［16］。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法

氣相色譜升溫程序設(shè)置：在60℃下保持1 min，以20℃/min升溫到300℃，保持13 min。其余系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣口溫度為250℃，空氣流量為1.0 mL/min，分流比為5∶1，氦氣為載氣，進(jìn)樣量為1μL。質(zhì)譜儀參數(shù)：離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，質(zhì)量掃描范圍（m/z）為60～800 amu。

1.2.2 檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取8.7 g的檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶解于脫水乙酸乙酯中，并稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用1.2.1所述的檢測(cè)方法檢測(cè)其峰面積，并做峰面積-濃度關(guān)系圖。

1.2.3 菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯

5株真菌對(duì)檸檬烯的轉(zhuǎn)化過(guò)程參考文獻(xiàn)［17］并略作調(diào)整。5株真菌分別以（＋）-檸檬烯和（-）-檸檬烯為底物，在相同條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。具體實(shí)驗(yàn)步驟：挑取一接種環(huán)的菌絲，接種到盛有50 mL無(wú)菌沙保氏培養(yǎng)基（10 g蛋白胨，40 g葡萄糖，1000 mL蒸餾水，pH值為4.0～6.0）的250 mL錐形瓶中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)6 d；然后在每瓶培養(yǎng)基中加入0.5 mL底物［V（底物）∶V（乙醇）=1∶1，各底物最終體積分?jǐn)?shù)為0.5%］，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d，完成轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，過(guò)濾發(fā)酵液，取濾液3 mL并用等體積乙酸乙酯萃取，將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉脫水，最后取有機(jī)相1 mL進(jìn)行TLC和GC-MS檢測(cè)，其中檸檬烯-1,2-二醇的含量由峰面積按照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算而得。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照總離子流（Total Ion Chromatography,TIC）圖中檸檬烯-1,2-二醇信號(hào)峰的峰面積與樣品濃度的關(guān)系，作標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，檸檬烯-1,2-二醇的峰面積-質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=129 971.734X-15 963.437，R2=0.992。其中：Y為峰面積，X為檸檬烯-1,2-二醇質(zhì)量濃度（g/L），檢測(cè)范圍為8.700～0.086 g/L。

2.2 底物為（+）-檸檬烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

該5株菌轉(zhuǎn)化（＋）-檸檬烯的產(chǎn)物的TIC圖如圖2所示。

由圖2可知，該5株內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化（＋）-檸檬烯的共同主要產(chǎn)物為峰2（檸檬烯-1,2-二醇），其中PS01、PS06還多了一個(gè)峰1（環(huán)氧檸檬烯）。檸檬烯轉(zhuǎn)化生成檸檬烯-1,2-二醇的代謝路線是檸檬烯的C—1,2位先環(huán)氧化，生成環(huán)氧檸檬烯中間代謝產(chǎn)物，然后環(huán)氧檸檬烯生成檸檬烯-1,2-二醇，屬于已知的6條檸檬烯代謝路線之一［18］，因此圖2的代謝產(chǎn)物符合檸檬烯的轉(zhuǎn)化機(jī)理，是檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

由圖2中PS07、PS10、PL14的TIC圖可以看出，環(huán)氧檸檬烯的信號(hào)較弱或檢測(cè)不出，可能是已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化為檸檬烯-1,2-二醇的緣故。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與M.C.J.Bier等［19］報(bào)道的結(jié)果相一致，作者利用內(nèi)生真菌Phomopsis sp.轉(zhuǎn)化D-檸檬烯，其主要產(chǎn)物也是檸檬烯-1,2-二醇（2.08 g/L）。

積分圖2中的峰2信號(hào)峰面積，再代入檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出5株菌轉(zhuǎn)化（＋）-檸檬烯所得檸檬烯-1,2-二醇產(chǎn)物質(zhì)量濃度，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：檸檬烯-1,2-二醇質(zhì)量濃度最高為2.275 g/L，由PS07菌株轉(zhuǎn)化而得；其質(zhì)量濃度最低為0.341 g/L，由PS01菌株轉(zhuǎn)化而得。PS01轉(zhuǎn)化得到的檸檬烯-1,2-二醇產(chǎn)物濃度低的緣故在于其前體物質(zhì)環(huán)氧檸檬烯濃度較高。

圖2 內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯后的有機(jī)相TIC圖

圖3 5株菌轉(zhuǎn)化（+）-檸檬烯生成的檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度

2.3 底物為（-）-檸檬烯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

該5株菌轉(zhuǎn)化（-）-檸檬烯的產(chǎn)物的TIC圖如圖4所示。由圖4可知，內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化（-）-檸檬烯后，其主要產(chǎn)物均為檸檬烯-1,2-二醇，中間代謝產(chǎn)物環(huán)氧檸檬烯的信號(hào)較弱或檢測(cè)不到。對(duì)比圖2和圖4表明，這5株內(nèi)生真菌均能轉(zhuǎn)化（＋）-或（-）-檸檬烯生成檸檬烯-1,2-二醇，推測(cè)該5株植物內(nèi)生真菌的加氧酶對(duì)底物無(wú)立體特異性要求。

圖4 生物轉(zhuǎn)化（-）-檸檬烯后的有機(jī)相TIC圖

按照2.2的處理方法，得出5株菌轉(zhuǎn)化（-）-檸檬烯后生成檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度，如圖5所示。由圖5可知，除了PS07轉(zhuǎn)化（-）-檸檬烯生成的檸檬烯-1,2-二醇濃度最高達(dá)到2.179 g/L外，其余4株菌株轉(zhuǎn)化后生成檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度均在0.9～1.5 g/L之間。

圖5 5株菌轉(zhuǎn)化（-）-檸檬烯生成檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度

對(duì)比該5株內(nèi)生真菌對(duì)（+）-檸檬烯和（-）-檸檬烯的轉(zhuǎn)化結(jié)果，得出如下結(jié)論：一是PS07菌株對(duì)手性底物轉(zhuǎn)化均能保持2.0 g/L以上的產(chǎn)物濃度，有進(jìn)一步研究的價(jià)值；二是PL14、PS10和PS06對(duì)（+）-檸檬烯和（-）-檸檬烯轉(zhuǎn)化生成的檸檬烯-1,2-二醇含量差異不大，可能該3株菌相關(guān)的加氧酶對(duì)底物無(wú)特異性要求，這也與PS07的結(jié)果相一致；三是PS01菌株更加偏好（-）-檸檬烯，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物濃度從（+）-檸檬烯為底物的0.34 g/L提高到（-）-檸檬烯為底物的0.94 g/L。目前有關(guān)植物內(nèi)生真菌來(lái)源加氧酶與底物特異性的報(bào)道較少，還有待進(jìn)一步研究。

3 討論

5株假臭草來(lái)源內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化（＋）-檸檬烯時(shí)，菌株P(guān)S01和PS06主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為檸檬烯環(huán)氧化合物和檸檬烯-1,2-二醇，PS07、PS10和PL14的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為檸檬烯-1,2-二醇。檸檬烯-1,2-二醇質(zhì)量濃度最高可達(dá)2.275 g/L，由PS07菌株轉(zhuǎn)化而得；最低為0.341 g/L，由PS01菌株轉(zhuǎn)化而得。生物轉(zhuǎn)化（-）-檸檬烯時(shí)，5株菌的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均為檸檬烯-1,2-二醇。除了PS07轉(zhuǎn)化后檸檬烯-1,2-二醇質(zhì)量濃度最高達(dá)到2.179 g/L外，其余4株菌株轉(zhuǎn)化后檸檬烯-1,2-二醇質(zhì)量濃度均在0.9～1.5 g/L之間。

5株假臭草來(lái)源內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化（＋）-檸檬烯、（-）-檸檬烯均能生成不同濃度的檸檬烯-1,2-二醇，檸檬烯-1,2-二醇具有非常明顯的對(duì)CD4＋和CD8＋T淋巴細(xì)胞的促炎活性的抑制活性、潛在的抗癌活性，誘蟲特性等，并可以用作飲料、口香糖、明膠和布丁的調(diào)味劑。檸檬烯-1,2-二醇價(jià)格是$11 500/kg，而底物檸檬烯價(jià)格僅為$34/L，利用生物轉(zhuǎn)化獲取檸檬烯-1,2-二醇具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。該生物轉(zhuǎn)化工藝的最新報(bào)道是采用睡蓮科炭疽菌（Colletotrichum nymphaeae）CBMAI 0864，用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方式，檸檬烯-1,2-二醇產(chǎn)量可以達(dá)到4.19 g/L［20］，通過(guò)一系列工藝優(yōu)化手段，在7.5 L規(guī)模的發(fā)酵罐中檸檬烯-1,2-二醇含量達(dá)到7.8 g/L［21］。因此，生物轉(zhuǎn)化（＋）-檸檬烯生產(chǎn)檸檬烯-1,2-二醇工藝，其產(chǎn)物的產(chǎn)量離工業(yè)化生產(chǎn)還有較大的距離，還需要繼續(xù)從高耐受底物和產(chǎn)物菌株篩選、發(fā)酵工藝優(yōu)化、產(chǎn)物提取分離工藝改良［22］等角度進(jìn)行深入研究。