干旱脅迫下大蒜葉綠素合成基因家族鑒定分析

王紫彤, 周倩怡, 田 潔,b,①

(青海大學(xué): a. 農(nóng)林科學(xué)院 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, b. 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海 西寧 810016)

大蒜(AlliumsativumLinn.)為百合科(Liliaceae)蔥屬(AlliumLinn.)植物，又稱胡蒜、蒜。大蒜栽培歷史悠久，具有重要的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，是青海省露地主栽蔬菜之一[1,2]。大蒜作為一種淺根性作物，耐旱性較弱[3,4]，而青海東部農(nóng)業(yè)區(qū)易發(fā)生旱災(zāi)，并且春季和夏季是大蒜生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，也是旱災(zāi)發(fā)生的高頻時(shí)期[5]，因此在高原大蒜生產(chǎn)過程中，干旱脅迫對(duì)大蒜的正常生長(zhǎng)、產(chǎn)品品質(zhì)以及經(jīng)濟(jì)效益均造成不利影響。在干旱生長(zhǎng)環(huán)境中，大蒜葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能，尤其是光合特性會(huì)發(fā)生一系列變化[6]，且干旱脅迫影響大蒜葉綠素的合成，抑制葉綠體的發(fā)育，從而使大蒜的光合效率降低，生長(zhǎng)遲緩[7]。

葉綠素生物合成是一個(gè)涉及多步反應(yīng)且十分復(fù)雜的過程，有多種酶和基因參與[8]。目前已有研究證實(shí)擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕的葉綠素生物合成大致需要15步反應(yīng)，包含起催化作用的17種酶和27種編碼基因[9]。葉綠素合成的第1步是由L-谷氨酰-tRNA合成原卟啉Ⅸ，其中的編碼基因HEMA、HEMB、GSA、HEMC、HEMD、HEME、HEMF和HEMG已從擬南芥[8]和水稻(OryzasativaLinn.)[10]中分離獲得；第2步由原卟啉Ⅸ合成葉綠素，相關(guān)催化酶基因有CHLD、CHLH、CHLI、CHLM、CRD1、DVR、POR、CHLG和CAO[11]，已在大麥(HordeumvulgareLinn.)[11]、煙草(NicotianatabacumLinn.)[12]和玉米(ZeamaysLinn.)[13]等植物中被鑒定得到。葉綠素合成基因家族成員雖已在模式植物和一些禾本科(Poaceae)作物中鑒定到并進(jìn)行了功能分析，但對(duì)于一些追求高品質(zhì)、高產(chǎn)量的經(jīng)濟(jì)作物來說，對(duì)其葉綠素合成基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析，探究其調(diào)控機(jī)制是亟待解決的問題。

葉綠素合成基因在逆境脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。黃蔚[14]發(fā)現(xiàn)，極端溫度條件下，芹菜(ApiumgraveolensLinn.)的17個(gè)葉綠素合成基因分別通過顯著上調(diào)或下調(diào)其表達(dá)水平應(yīng)答環(huán)境溫度的變化。李翠[15]將釀酒酵母5-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶基因(YHem1)轉(zhuǎn)入番茄(LycopersiconesculentumMill.)，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的HEMA、HEMB和GSA基因通過上調(diào)或下調(diào)表達(dá)來應(yīng)答脅迫。張修德等[16]認(rèn)為，聚乙二醇(PEG)模擬的干旱能夠誘導(dǎo)蘋果(MaluspumilaMill.)組培苗HEMA基因表達(dá)量增加，從而抵御干旱脅迫。目前，對(duì)于逆境脅迫下大蒜葉綠素合成的研究多集中于生理指標(biāo)[17,18]，大蒜中葉綠素合成基因家族成員尚未被鑒定，相關(guān)基因家族成員的功能和作用機(jī)制尚未完全清晰。

本研究基于前期干旱脅迫大蒜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(未公布)，篩選出響應(yīng)干旱脅迫的大蒜葉綠素合成基因家族，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析其在干旱脅迫下的表達(dá)情況，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行綜合鑒定和分析，以期為進(jìn)一步研究大蒜葉綠素合成基因家族的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，并為大蒜在干旱脅迫下提高光合效率、延緩衰老和增強(qiáng)適應(yīng)性等方面提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為青海省特色大蒜品種‘樂都紫皮大蒜’(‘Ledu Purple Skin Garlic’)，選取蒜瓣較飽滿、大小均勻、表面光滑、色澤光亮且已經(jīng)解除休眠的大蒜鱗莖，于2021年3月播種在栽培基質(zhì)為珍珠巖、蛭石和草炭(體積比1∶1∶2)的盆(口徑12 cm、底徑9 cm、高12 cm)中，每盆栽種1個(gè)鱗莖，共60盆。然后置于植物光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：晝溫25 ℃，夜溫15 ℃，光照時(shí)間14 h·d-1，光照度12 000 lx，空氣相對(duì)濕度70%左右。培養(yǎng)至大蒜幼苗期(株高10 cm左右)時(shí)進(jìn)行干旱脅迫處理。

1.2 方法

1.2.1 干旱脅迫處理 參照鐵原毓等[19]的方法通過停止?jié)菜M(jìn)行人工控水，保持空氣相對(duì)濕度30%，參照楊彥會(huì)等[20]的方法控制土壤相對(duì)濕度為45%～55%，其他培養(yǎng)條件不變。各處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別于處理0(CK)、3、6、9、12和15 d取樣。每個(gè)重復(fù)取長(zhǎng)勢(shì)均勻的5株大蒜植株上部的幼嫩葉片，取樣后立即放入液氮中冷凍，然后置于-80 ℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 葉片總RNA的提取 利用TRNzol Universal總RNA提取試劑〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取大蒜葉片總RNA，采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，利用TGem微量分光光度計(jì)(OSE-260)〔天根生化科技(北京)有限公司〕檢測(cè)總RNA質(zhì)量。

1.2.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 上述RNA樣品交由北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序。首先構(gòu)建葉片cDNA文庫(kù)，庫(kù)檢合格后進(jìn)行Illumina HiSeq測(cè)序。測(cè)序片段經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(raw reads)，過濾后得到clean reads，基于此測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.4 葉綠素合成基因篩選 將由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的 大蒜unigenes序列與NR、NT、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋，獲得unigenes的蛋白功能注釋信息后，參考張少平等[21]的方法篩選被注釋的葉綠素合成基因。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析 對(duì)不同干旱脅迫時(shí)間大蒜葉綠素合成基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的FPKM值(每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以FPKM值大于0.3作為基因表達(dá)的閾值，統(tǒng)計(jì)FPKM值大于0.3的unigenes，分析其在不同干旱脅迫時(shí)間的表達(dá)水平和表達(dá)模式，使用TBtools軟件繪制大蒜葉綠素合成基因表達(dá)熱圖，篩選unigenes表達(dá)量較高的葉綠素合成基因家族進(jìn)行后續(xù)的鑒定與分析。

1.2.6 qRT-PCR分析 為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，同時(shí)進(jìn)一步分析篩選到的葉綠素合成基因的表達(dá)情況，采集不同干旱脅迫時(shí)間的大蒜葉片進(jìn)行qRT-PCR分析。按照HonorTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天津諾禾致源生物信息科技有限公司)說明書合成cDNA。從大蒜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出的unigenes表達(dá)量較高的葉綠素合成基因家族中，隨機(jī)選取1個(gè)unigene進(jìn)行驗(yàn)證，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物后交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1，然后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。

表1 大蒜葉綠素合成基因家族部分unigenes的引物序列及其退火溫度

qRT-PCR反應(yīng)體系總體積為20.0 μL，包括SYBR Green Master Mix(天津諾禾致源生物信息科技有限公司)10.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.6 μL、100 ng·μL-1cDNA 1.0 μL、ddH2O 7.8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、相應(yīng)溫度退火30 s(退火溫度見表1)、72 ℃延伸150 s，共35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。選取大蒜CYP基因作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用ExPASy網(wǎng)站中的ProtParam在線工具(https:∥www.expasy.org/resources/protparam/)預(yù)測(cè)大蒜葉綠素合成基因家族unigenes編碼氨基酸序列的理論相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶系數(shù)和總平均親水性等。

1.2.8 氨基酸序列多重比對(duì)及進(jìn)化樹分析 將大蒜葉綠素合成基因家族unigenes編碼氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過BLAST比對(duì)，選擇相似性高且已在其他植物中鑒定到的葉綠素合成基因編碼氨基酸序列，使用Mega X的最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為重復(fù)1 000次。通過Evolview(https:∥www.evolgenius.info/evolview/)對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.9 保守基序分析 使用在線分析軟件MEME(https:∥meme-suite.org/meme/tools/meme)對(duì)不同大蒜葉綠素合成基因家族unigenes編碼的氨基酸序列分別進(jìn)行保守基序分析，基序的最大數(shù)量設(shè)置為3～5，將得到的meme.xml文件放入TBtools進(jìn)行結(jié)構(gòu)可視化，并繪制圖形。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

采用SPSS 25.0軟件中的Duncan’s新復(fù)極差法(p<0.05)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析[22]，采用Origin 2021軟件繪制圖表。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉綠素生物合成基因的篩選

從大蒜轉(zhuǎn)錄組序列中篩選出160個(gè)與葉綠素合成相關(guān)的unigenes，經(jīng)鑒定被注釋為17個(gè)葉綠素合成基因家族(表2)。其中被注釋數(shù)量最多的是AsHEMG基因家族，共有43個(gè)unigenes。在L-谷氨酰-tRNA到原卟啉Ⅸ的合成途徑中，σ-氨基酮戊酸(ALA)的合成是葉綠素合成過程中一個(gè)重要的控制點(diǎn)[23]，編碼的基因家族為AsHEMA和AsGSA，分別注釋到5和2個(gè)unigenes。從原卟啉Ⅸ到葉綠素的合成途徑中，金屬離子插入原卟啉Ⅸ是葉綠素合成過程中另一個(gè)重要的分支點(diǎn)[24]，編碼的基因家族為AsCHLH、AsCHLI和AsCHLD，分別注釋到7、6和5個(gè)unigenes。

表2 大蒜葉綠素合成基因的篩選信息

2.2 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析

干旱脅迫下大蒜葉綠素合成基因家族unigenes表達(dá)熱圖見圖1。結(jié)果顯示：17個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族unigenes響應(yīng)干旱脅迫的模式大致分為2種：AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO基因家族unigenes在干旱脅迫6 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量明顯增加，達(dá)到峰值，積極響應(yīng)干旱脅迫；而AsHEMC、AsHEMD、AsHEME、AsHEMF、AsHEMG、AsCHLH、AsCHLM、AsCRD、AsDVR、AsPOR和AsCHLG基因家族unigenes在干旱脅迫下的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較低，且響應(yīng)干旱脅迫的變化趨勢(shì)和模式不明顯。因此，后續(xù)的鑒定和分析將在AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO基因家族中進(jìn)行。

圖1 干旱脅迫下大蒜葉綠素合成基因家族unigenes表達(dá)(FPKM值大于0.3)熱圖

2.3 qRT-PCR分析

為了證實(shí)上述6個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族在干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可信性和真實(shí)性，從這6個(gè)基因家族中各隨機(jī)選取1個(gè)unigene進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果(圖2)顯示：AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO這6個(gè)基因家族成員的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本吻合，均于干旱脅迫6 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高。除AsHEMB和AsCHLI基因家族成員外，剩余4個(gè)基因家族成員均在干旱脅迫6 d時(shí)與其他干旱脅迫時(shí)間差異顯著。這表明RNA-Seq數(shù)據(jù)具有準(zhǔn)確性和可靠性，可對(duì)這6個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族進(jìn)行后續(xù)鑒定分析。

2.4 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

上述6個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族32個(gè)unigenes編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)見表3。結(jié)果顯示：32個(gè)unigenes編碼序列的氨基酸殘基數(shù)為104～773，理論相對(duì)分子質(zhì)量為11 978～84 411，理論等電點(diǎn)為pI 4.78至pI 9.86，其中同一家族中各成員的理論等電點(diǎn)相對(duì)接近，例如：AsCHLI家族成員的理論等電點(diǎn)為pI 4.80至pI 5.75，整體較低；而AsCAO家族成員的理論等電點(diǎn)為pI 7.33至pI 9.86，整體較高。不穩(wěn)定指數(shù)為24.66～60.13，其中8個(gè)成員的不穩(wěn)定指數(shù)高于40，屬不穩(wěn)定蛋白，AsCAO家族中有4個(gè)成員屬于不穩(wěn)定蛋白，在6個(gè)家族中穩(wěn)定性最差；AsHEMB和AsGSA家族的全部成員均為穩(wěn)定蛋白。脂溶系數(shù)為80.04～104.59。除AsGSA家族外，其余5個(gè)家族成員的總平均親水性均為負(fù)值，即AsGSA家族成員為親水蛋白，其余5個(gè)家族成員為疏水蛋白。由此可以看出，這6個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族成員氨基酸序列的理化性質(zhì)存在一定差異，但同一家族成員氨基酸序列的理化性質(zhì)較相似。

2.5 進(jìn)化樹與保守基序分析

大蒜AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO基因家族unigenes與其他植物葉綠素合成基因編碼氨基酸序列的進(jìn)化樹見圖3。結(jié)果顯示：上述6個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族unigenes與石刁柏(AsparagusofficinalisLinn.)、玉簪〔Hostaplantaginea(Lam.) Aschers.〕、小麥(TriticumaestivumLinn.)、狗尾草〔Setariaviridis(Linn.) Beauv.〕、粗柄象腿蕉〔Enseteventricosum(Welw.) Cheesman〕、石斛(DendrobiumnobileLindl.)和芋〔Colocasiaesculenta(Linn.) Schott.〕等植物的葉綠素合成基因編碼氨基酸序列聚為6類，各類中大蒜AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO家族成員首先聚在一起，保守性較強(qiáng)。其中，AsHEMA家族成員與登錄號(hào)XP_020262418.1(石刁柏)和QPO14976.1(玉簪)序列的同源性相對(duì)較高；AsHEMB家族的8個(gè)成員也比較保守，可進(jìn)一步分為2個(gè)小類，AsHEMB01、AsHEMB03和AsHEMB08聚為一個(gè)小類，與登錄號(hào)XP_034590070.1(狗尾草)和XP_037445707.1(小麥)序列的同源性較高，AsHEMB02、AsHEMB04、AsHEMB05、AsHEMB06和AsHEMB07聚為另一個(gè)小類；AsGSA家族成員與登錄號(hào)RRT65413.1(粗柄象腿蕉)和XP_020693590.1(石斛)序列的同源性較高；AsCHLD家族成員與登錄號(hào)XP_020268622.1(石刁柏)序列的同源性較高；AsCHLI家族成員與登錄號(hào)XP_020273053.1(石刁柏)序列的同源性也較高；AsCAO家族可進(jìn)一步劃分為AsCAO01和AsCAO06以及AsCAO02、AsCAO03、AsCAO04和AsCAO05 2個(gè)小類，其中AsCAO01和AsCAO06與登錄號(hào)QPO14978.1(玉簪)、MQL79406.1(芋)和XP_015614086.1(水稻)序列的同源性較高。

: qRT-PCR; : RNA-Seq.

表3 大蒜葉綠素合成基因家族unigenes編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)1)

Ao: 石刁柏Asparagus officinalis Linn.; As: 大蒜Allium sativum Linn.; At: 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.; Bn: 歐洲油菜Brassica napus Linn.; Bro: 蕓薹Brassica rapa var. oleifera de Candolle; Caa: 辣椒Capsicum annuum Linn.; Ce: 芋Colocasia esculenta (Linn.) Schott.; Cha: 藜Chenopodium album Linn.; Cs: 墨蘭Cymbidium sinense (Jackson ex Andr.) Willd.; Dn: 石斛Dendrobium nobile Lindl.; Ep: 畫眉草Eragrostis pilosa (Linn.) Beauv.; Ev: 粗柄象腿蕉Ensete ventricosum (Welw.) Cheesman; Hp: 玉簪Hosta plantaginea (Lam.) Aschers.; Ku: 獨(dú)葉草Kingdonia uniflora Balf. F. et W. W. Smith; Mb: 野蕉Musa balbisiana Colla; Nt: 煙草Nicotiana tabacum Linn.; Os: 水稻Oryza sativa Linn.; Pc: 黃連木Pistacia chinensis Bunge; Pha: 蝴蝶蘭Phalaenopsis aphrodite H. G. Reichenbach; Pm: 稷Panicum miliaceum Linn.; Poa: 銀白楊Populus alba Linn.; Rc: 蓖麻Ricinus communis Linn.; Sb: 高粱Sorghum bicolor (Linn.) Moench; Sig: 粟Setaria italica var. germanica (Mill.) Schred.; Sv: 狗尾草Setaria viridis (Linn.) Beauv.; Ta: 小麥Triticum aestivum Linn.; Vp: 香莢蘭Vanilla planifolia Andrews; Vv: 葡萄Vitis vinifera Linn.

上述6個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族unigenes編碼氨基酸序列的保守基序及其結(jié)構(gòu)分別見圖4、圖5和圖6。結(jié)果顯示：AsHEMA、AsGSA和AsCHLD家族成員氨基酸序列所含的保守基序一致且排列位置也相似，說明同一家族中的成員高度保守；AsHEMB、AsCHLI和AsCAO家族相對(duì)保守，部分家族成員存在差異。AsHEMB家族中，AsHEMB01和AsHEMB08的保守基序與其他6個(gè)成員存在差異，這與構(gòu)建的進(jìn)化樹的分析結(jié)果基本一致，AsHEMB01和AsHEMB08與登錄號(hào)XP_034590070.1(狗尾草)和XP_037445707.1(小麥)序列在進(jìn)化上同源性更高；AsCHLI家族中，AsCHLI05和AsCHLI06與登錄號(hào)XP_020273053.1(石刁柏)序列的同源性更高，而這2條序列均含有AsCHLI家族成員中的motif1、motif2、motif3和motif4這4個(gè)保守基序，推測(cè)這4個(gè)保守基序在進(jìn)化上有更為重要的作用；AsCAO家族中，AsCAO01和AsCAO06的序列最長(zhǎng)，含有的保守基序數(shù)量也較多，與登錄號(hào)QPO14978.1(玉簪)序列的同源性更高。

圖4 大蒜葉綠素合成基因家族unigenes編碼氨基酸序列的保守基序

圖6 大蒜AsCHLI和AsCAO基因家族unigenes編碼氨基酸序列的保守基序結(jié)構(gòu)

3 討 論

葉綠素作為參與植物光合作用的重要色素，在捕獲光能和電子傳遞過程中起著十分重要的作用[25]。葉綠素合成基因與植物葉色變化和光合特性密切相關(guān)。例如：玉簪葉綠素合成酶基因的表達(dá)量控制葉綠素含量，玉簪HEMA、POR和CAO的過量表達(dá)促進(jìn)其葉片的光合作用[26]；小麥CHLI基因[27]，花葉矢竹(Pseudosasajaponica‘Akebonosuji’)的PORB和CAO基因[28]以及水稻的YGL1、CHLD和CHLI基因[29]在葉片呈色或葉色異變過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。葉綠素合成基因的轉(zhuǎn)錄不僅與植物自身生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)有關(guān)，還受植物所處的外界環(huán)境調(diào)控。Liu等[30]發(fā)現(xiàn)，水分虧缺條件下，水稻的HEMA和CHLH基因顯著下調(diào)；Wang等[31]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫導(dǎo)致辣椒的HEMA1、HEMB和CHLH基因的表達(dá)量以及葉綠素含量均顯著降低。這些研究結(jié)果說明植物的光合作用對(duì)環(huán)境條件非常敏感，參與葉綠素合成的關(guān)鍵酶及其編碼基因會(huì)受到逆境脅迫的影響。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下大蒜葉片變黃，總?cè)~綠素含量顯著降低[6]，但干旱脅迫是否對(duì)大蒜葉綠素合成基因具有調(diào)控作用目前還未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過挖掘干旱脅迫下大蒜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選鑒定得到17個(gè)大蒜葉綠素合成基因家族；并通過分析各基因家族unigenes在不同干旱脅迫時(shí)間的響應(yīng)模式，發(fā)現(xiàn)AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO基因家族unigenes在干旱脅迫下表達(dá)模式相似，總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均在脅迫6 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。推測(cè)這6個(gè)基因家族unigenes在大蒜干旱脅迫響應(yīng)中具有協(xié)同調(diào)控作用。

進(jìn)一步對(duì)AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO基因家族的32個(gè)unigenes進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)葉綠素合成基因家族unigenes編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)存在一定差異，但同一家族成員氨基酸序列的理化性質(zhì)較相似。從進(jìn)化樹可以看出：這6個(gè)大蒜基因家族的成員基本上都各自緊密地聚類在一起，具有較高的保守性和相似性，同時(shí)與其他植物葉綠素合成基因也具有一定的同源性，推測(cè)他們具有相似或相近的生物學(xué)功能。結(jié)合RNA-Seq和qRT-PCR的結(jié)果，這6個(gè)葉綠素合成基因家族的成員在應(yīng)答干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。其中，HEMA基因作為葉綠素合成限速步驟(ALA的合成)中第1步反應(yīng)的催化酶基因，是植物葉綠素合成起點(diǎn)的關(guān)鍵基因[24,32]。HEMA基因家族能夠參與植物對(duì)逆境的響應(yīng)。張修德等[16]分析蘋果MdHEMA1基因的啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn)，MdHEMA1基因的轉(zhuǎn)錄受干旱脅迫等逆境的誘導(dǎo)。除了HEMA基因家族，HEMB和CHLI也是葉綠素響應(yīng)逆境的重要調(diào)控基因家族。孟昭娟[33]發(fā)現(xiàn)弱光逆境下，番茄HEMB基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，葉綠素合成水平明顯降低。Bhor等[34]將黃瓜(CucumissativusLinn.)CHLI基因家族成員沉默，不僅導(dǎo)致葉綠素含量下降，還使其防御相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。此外，雖然不同基因家族成員的功能具有多樣性，但同源性較高的基因家族或成員往往對(duì)植物具有類似的調(diào)控作用。本研究中，AsHEMA05與石刁柏和玉簪相關(guān)基因的同緣性較高，AsHEMB01、AsHEMB03和AsHEMB08與小麥相關(guān)基因的同緣性較高，AsCHLD05、AsCHLD06、AsCHLI03和AsCHLI04與石刁柏相關(guān)基因的同緣性較高，AsCAO01和AsCAO06與玉簪相關(guān)基因的同緣性較高，說明同為單子葉植物的大蒜與小麥、石刁柏和玉簪的親緣關(guān)系較近。

綜上所述，本研究首次鑒定了大蒜葉綠素合成基因家族成員，發(fā)現(xiàn)大蒜AsHEMA、AsHEMB、AsGSA、AsCHLD、AsCHLI和AsCAO基因家族在響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，這將為解析干旱脅迫下大蒜的葉綠素合成基因的功能和作用機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。