臺灣含笑變異株群‘中山含笑’的形態(tài)特征和遺傳變異分析

殷云龍, 王芝權, 楊 穎, 劉向東, 於朝廣

〔江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京 210014〕

木蘭科(Magnoliaceae)含笑屬(MicheliaLinn.)植物有80余種，主要分布于亞洲熱帶、亞熱帶，中國約有70種，主要產(chǎn)于中國西南部至東部[1]，其主要分類特征為花腋生、花藥側向開裂和具柄雄蕊明顯[2,3]。含笑屬種類均為常綠喬木或灌木，花色有白色、黃色、紫色和紅色等，形態(tài)多樣性豐富，是中國南方地區(qū)極具開發(fā)潛力的觀賞植物，也是北亞熱帶區(qū)域普遍引種的常綠園林綠化樹種[4,5]，因此，含笑屬植物的引種和利用一直備受關注，已經(jīng)成為植物育種創(chuàng)新的熱點樹種之一[2,6,7]。例如：龔洵等[3,8]以云南含笑(M.yunnanensisFranch. ex Finet et Gagnep.)和灰?guī)r含笑(M.calcicolaC. Y. Wu)為親本，從雜交群體中選育出‘雛菊含笑’(‘Chujuhanxiao’)等9個新品種；邵文豪等[9]以樂昌含笑(M.chapensisDandy)和紫花含笑(M.crassipesY. W. Law)為親本，從雜交群體中選育出新品種‘夢緣’(‘Mengyuan’)；毛常麗等[10]從球花含笑(M.sphaeranthaC. Y. Wu ex Z. S. Yue)與云南含笑的雜交群體中選育出新品種‘晚春含笑’(‘Wanchunhanxiao’)。近年來，雖然含笑屬植物的雜交育種研究取得了一定進展，但是能推廣應用的品種仍然十分缺乏。

臺灣含笑〔M.compressa(Maxim.) Sarg.〕又名臺灣白蘭花、烏心石和黃心樹，為木蘭科含笑屬常綠喬木，原產(chǎn)于臺灣地區(qū)，為該地區(qū)主要用材樹種之一，株高可達20 m、胸徑達1 m[11]。早在20世紀80年代初，江蘇省中國科學院植物研究所就成功地對臺灣含笑進行了引種馴化[11]。與同一地點栽培的含笑屬其他樹種相比，臺灣含笑的抗寒性優(yōu)于深山含笑(M.maudiaeDunn)和樂昌含笑等種類[12,13]；且與同一地點栽培的其他常綠闊葉樹種相比，臺灣含笑的耐寒性優(yōu)于香樟〔Cinnamomumcamphora(Linn.) Presl〕、石楠(PhotiniaserrulataLindl.)、乳源木蓮(ManglietiayuyuanensisLaw)、山杜英〔Elaeocarpussylvestris(Lour.) Poir.〕、白楠〔Phoebeneurantha(Hemsl.) Gamble〕和石櫟〔Lithocarpusglaber(Thunb.) Nakai〕等常綠闊葉樹種[11]，是在江蘇南北過渡地帶(北緯31°～35°)具有應用潛力的耐寒常綠闊葉樹種。然而，與花朵碩大、色彩艷麗的常見木蘭科觀賞樹種相比，臺灣含笑花型較小、花被片淡黃色、觀花特性不明顯，限制了其推廣應用。

‘中山含笑’(Michelia‘Zhongshanhanxiao’)是在臺灣含笑嫁接苗自然授粉子代的育苗過程中發(fā)現(xiàn)的表型顯著變異子代，其觀賞價值明顯優(yōu)于臺灣含笑母樹及其表型無變異子代，但是目前對‘中山含笑’的遺傳背景并不清楚。SSR分子標記具有多態(tài)性高、種屬間通用性良好等優(yōu)點，目前已廣泛用于雜種鑒定、遺傳圖譜構建、指紋圖譜分析等相關領域[14-16]，例如：王紫陽等[17]篩選出7對SSR引物對‘中山杉’品種具有較高的鑒別率，段豪等[18]采用SSR分子標記構建了落羽杉種質資源的指紋圖譜，袁金玲等[19]基于SSR分子標記對叢生竹雜交種進行準確鑒定，分析雜種與親本間的遺傳關系，并構建指紋圖譜。作者在對‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代進行表型特征觀察的基礎上，采用SSR分子標記技術對他們的遺傳變異和遺傳多樣性以及親緣關系進行了分析，以期為含笑屬觀賞樹種的新品種培育奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

江蘇省中國科學院植物研究所于1982年從福建省引進了臺灣含笑實生苗1株，通過嫁接擴繁成無性系(共7株)后定植于南京中山植物園內(nèi)，并培育成單一基因型的臺灣含笑母樹，平均株高15 m，平均胸徑30 cm，目前均已開花結實，具有較好的生態(tài)適應性和觀賞價值。

于2015年秋季采集母樹的成熟種子，脫去外種皮后用濕沙層積儲藏，翌年春季播種育苗。2016年9月，從當年育成的2萬余株臺灣含笑實生苗群體中發(fā)現(xiàn)18株表型明顯變異的單株，占實生苗總數(shù)的0.09%；2017年春季對全部實生苗進行移栽，株距和行距均為50 cm。2018年，少數(shù)表型變異子代單株開始開花，初步觀察發(fā)現(xiàn)這些單株具有生長快、枝葉茂密、葉片大而厚實、花大量多、花香濃郁、耐熱、耐寒等特點，觀賞價值明顯高于表型無變異子代，為此，參照鵝掌楸屬(LiriodendronLinn.)種質‘優(yōu)酉’(‘Youyou’)的命名[20]將表型變異子代株群命名為‘中山含笑’，18株單株依次編號為Z601至Z618，并據(jù)此擴繁成無性系。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)觀察和表型性狀測定 分別于2019年與2020年的2月底至3月初，對‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代的物候期進行記錄，并對樹干、枝、葉和花等器官的形態(tài)指標進行觀測。對開花早、生長量大和性狀優(yōu)良的3株‘中山含笑’(Z602、Z608、Z615)以及7株母樹和36株表型無變異子代進行形態(tài)特征變異統(tǒng)計分析。

用鋼圍尺(精度1 mm)在樹干距地面0.1和1.3 m處分別測量地徑和胸徑；用布魯萊斯測高器(德國卡爾萊斯公司，精度0.1 m)和量桿(精度1 cm)測量樹高；用量桿分別測量樹冠東西向和南北向的投影直徑，二者平均值即冠幅。在各單株高1.5～2.0 m處的朝南方向選取大小基本一致的枝條，利用直尺(精度1 mm)測量枝條上所有葉片的葉長(葉梗至葉尖的長度)和葉寬(葉最寬處的寬度)，從而獲得葉長和葉寬的測量值范圍。于盛花期，在各單株高1.5～2.0 m處的朝南方向統(tǒng)計單枝著花數(shù)；采用目測法對花色進行判定；隨機采集5朵盛開的花朵，統(tǒng)計花被片數(shù)量，并利用直尺測量花被片長度(花被片基部至頂端的長度)和花被片寬度(花被片最寬處的寬度)，從而獲得花被片長度和寬度的測量值范圍。

1.2.2 SSR分子標記分析 2020年5月，以‘中山含笑’18株單株(Z601至Z618)和1株臺灣含笑母樹(M)及其表型無變異子代的3株單株(N1至N3)為樣株，每株采集3～5枚幼嫩葉片，于-80 ℃冰箱中保存，用于SSR分子標記分析。

1.2.2.1 DNA提取 使用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)提取嫩葉基因組DNA，并用Colibri超微量分光光度計(德國Berthold公司)檢測提取的基因組DNA的濃度和純度，用EB緩沖液將基因組DNA稀釋至10 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存、備用。

1.2.2.2 SSR引物篩選 依據(jù)目前已公布的木蘭科植物北美鵝掌楸〔Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.〕[21]、深山含笑[22,23]、阿希氏木蘭(MagnoliaasheiWeath.)[24]、西疇含笑(MicheliacoriaceaHung T. Chang et B. L. Chen)[25]、火力楠(MicheliamacclureiDandy)[26]和灰木蓮(ManglietiaconiferaDandy)[27]的SSR標記分析結果，挑選出62對通用性較高的引物，以‘中山含笑’Z601、Z605、Z609、Z613和Z617的基因組DNA為模板進行引物初篩。

PCR反應體系總體積15.0 μL，包括2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL、10.0 μmol·L-1正向和反向引物各0.9 μL、模板DNA 1.0 μL及雙蒸水4.7 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共10個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.5 ℃；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共20個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。每個樣本重復擴增3次，擴增產(chǎn)物于4 ℃保存。

在擴增產(chǎn)物中加入1.5 μL溴酚藍染液，混合均勻后，用質量體積分數(shù)8%SDS-PAGE進行電泳分離及銀染。篩選出5對擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富及重復性高的引物，用于遺傳多樣性分析。5對引物序列如下：MMA72-F為5′-TTTTCCACCCCTCTCGAATA-3′，MMA72-R為5′-CCATTATGCTGGGGTGTCTT-3′；M02-F為5′-CAGCTCCCATTTTCTGTCGC-3′，M02-R為5′-TCTGCAGATCAAGGCCTTGG-3′；M23-F為5′-GTTCTCCACAAAGCTTGGCG-3′，M23-R為5′-CGTCCCCATCTTTCCTGTCC-3′；MA3-7-F為5′-CATGCTAACCCATCTAGTCACG-3′，MA3-7-R為5′-TCCCAATACCCATCCCAGTA-3′；MA3-12-F為5′-AGCCCAAGGAGACAACAGAA-3′，MA3-12-R為5′-GGGTTTCTTCGCATGTTGTT-3′。

1.2.2.3 PCR擴增和毛細管電泳 在每對引物正向引物的5′端添加熒光基團合成熒光引物，其中引物MMA72和M02進行FAM修飾，引物M23、MA3-7和MA3-12進行HEX修飾，熒光引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以上述22株樣株的基因組DNA為模板，在遮光條件下，按照前述反應體系和程序進行擴增。擴增產(chǎn)物由上海捷瑞生物工程有限公司進行毛細管電泳熒光檢測，步驟為：PCR擴增產(chǎn)物先用雙蒸水稀釋10倍，再用HIDI(已混合ROX500)稀釋10倍，95 ℃變性3 min，立即冰水浴，最后用ABI 3730XL遺傳分析儀(美國ThermoFisher公司)進行檢測。每個擴增產(chǎn)物重復檢測4次。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

2 結果和分析

2.1 ‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代的形態(tài)特征比較

對‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代的整株、葉片和花形態(tài)特征進行觀測，結果見圖1和表1。

從形態(tài)(圖1)上看，與母樹相似，‘中山含笑’也為常綠喬木，分枝多，呈塔狀或圓錐狀；供試‘中山含笑’為4年生幼樹，最早在第3年始花，早于表型無變異子代(4年生表型無變異子代暫未始花)；花期2月至3月，果期10月至11月。其葉革質，倒卵狀橢圓形或狹倒卵形，先端急短尖，葉正面深綠色且有光澤，葉背面淡綠色，葉面積明顯大于母樹和表型無變異子代?！猩胶Α_花多且芳香，單花腋生，花明顯大于母樹；花被片8～14枚，呈螺旋狀排列，倒卵形；雌蕊群綠色，柱頭帶紫紅色；雄蕊群黃綠色，基部紫色，雄蕊數(shù)量45～48枚，長8.0～14.0 mm。

由表1可見：‘中山含笑’Z602、Z608和Z615的株高、地徑、胸徑和冠幅分別是表型無變異子代的1.41～1.55、2.49～2.97、2.79～3.16和2.38～2.74倍；葉長和葉寬分別是表型無變異子代的1.40～2.04和1.50～2.17倍。并且，‘中山含笑’的葉長和葉寬以及花被片的長度和寬度均大于母樹，花被片的長度和寬度分別是母樹的3.50～4.53和4.33～7.00倍。母樹和表型無變異子代的葉片大小無明顯差異?！猩胶Α膯沃χ〝?shù)和花被片數(shù)與母樹和表型無變異子代相似，但其花被片顏色與母樹有差異，為乳白色，近基部帶淡紫色或紫色，而母樹的花被片為淡黃白色，近基部帶深紫色。

綜上所述，‘中山含笑’的整株、葉片和花在形狀上與母樹和表型無變異子代相似，但其葉片和花大小卻發(fā)生了顯著變化。

Z602,Z608,Z615: ‘中山含笑’單株 Individuals of Michelia ‘Zhongshanhanxiao’; M： 臺灣含笑母樹Mother tree of M. compressa (Maxim.) Sarg.; N： 臺灣含笑表型無變異子代Progeny without phenotypic variation of M. compressa.

表1 ‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代的形態(tài)特征差異1)

2.2 ‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代的遺傳變異分析

2.2.1 基于SSR分子標記的多態(tài)性分析 對‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代進行SSR標記分析，5對引物擴增條帶的多態(tài)性分析見表2。由表2可見：5對SSR引物從22株單株基因組DNA中共檢測出16個等位基因，其中，引物MMA72、M02和MA3-7的觀測等位基因數(shù)均為4，引物M23和MA3-12的觀測等位基因數(shù)均為2；有效等位基因數(shù)為1.4～2.4，平均值為1.9。觀測雜合度為0.364～0.818，5個引物的觀測雜合度由大到小依次為MMA72和MA3-7、M02、M23、MA3-12；期望雜合度為0.304～0.589，由大到小依次為MA3-7、MMA72、M02、M23、MA3-12。Shannon’s多樣性指數(shù)為0.474～1.031，平均值為0.777。Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.298～0.575，平均值為0.446。總體上看，引物MA3-12的遺傳變異指標均最小，而引物MA3-7的遺傳變異指標均最大。

表2 5對SSR引物擴增條帶的多態(tài)性分析

2.2.2 基因分型分析 對‘中山含笑’單株與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代進行SSR標記分析，5對SSR引物在22株樣株中的擴增條帶長度見表3。

母樹和表型無變異子代的3株單株的擴增結果完全一致，但與‘中山含笑’18株單株的擴增結果存在一定差異。其中，引物MMA72、M02、M23、MA3-7和MA3-12在表型無變異子代中檢測到的等位基因數(shù)分別為1、2、1、1和1，但在‘中山含笑’18株單株中檢測到的等位基因數(shù)分別為4、3、2、4和2，表明‘中山含笑’的等位基因數(shù)高于表型無變異子代。

MMA72和MA3-7引物對應的位點在‘中山含笑’18株單株中為雜合位點；M02引物對應的位點在‘中山含笑’8株單株中為雜合位點，M23引物對應的位點在‘中山含笑’10株單株中為雜合位點，MA3-12引物對應的位點在‘中山含笑’8株單株中為雜合位點。

引物MMA72、M23、MA3-7和MA3-12在母樹和表型無變異子代中的擴增產(chǎn)物長度分別為212、181、187和182 bp，而在‘中山含笑’18株單株中除均可擴增出長度一致的條帶外，還可擴增出長度分別為214～228、174、211～226和158 bp的另一條帶。引物M02在母樹和表型無變異子代的擴增產(chǎn)物長度均為140和150 bp，而在‘中山含笑’18株單株中除均可擴增出長度140 bp的條帶外，其中8株單株還能擴增出長度為142或159 bp的另一條帶。

表3 5對SSR引物在‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代中的擴增條帶長度

總之，除含有與母樹相同的等位基因外，‘中山含笑’18株單株還含有來源于母樹之外的等位基因。

2.2.3 遺傳多樣性分析 ‘中山含笑’與臺灣含笑表型無變異子代的遺傳多樣性分析見表4。結果表明：‘中山含笑’的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度分別為表型無變異子代的2.50、1.67、3.44和4.06倍，Shannon’s多樣性指數(shù)是表型無變異子代的5.73倍，Nei’s基因多樣性指數(shù)是表型無變異子代的4.74倍。總之，‘中山含笑’的遺傳多樣性明顯高于表型無變異子代。

2.2.4 遺傳一致度和遺傳距離分析 對‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代進行遺傳一致度和遺傳距離分析，結果見表5。

結果表明：母樹和3株表型無變異子代單株的遺傳一致度均為1.000、遺傳距離均為0.000，3株表型無變異子代間的遺傳一致度也均為1.000、遺傳距離也均為0.000，表明母樹與表型無變異子代間無遺傳差異。

‘中山含笑’18株單株間的遺傳距離變化范圍為0.000～0.539，平均值為0.241；其中，Z602與Z605、Z606與Z613和Z614間的遺傳一致度均為1.000，遺傳距離均為0.000，說明Z602與Z605、Z606與Z613和Z614間均無遺傳差異；Z607與Z608、Z608與Z617間的遺傳距離最大(0.539)，說明這2組單株間的遺傳差異最大。

‘中山含笑’18株單株與母樹的遺傳距離變化范圍為0.192～0.399，平均值為0.288；其中Z610與母樹間的遺傳距離最小，Z616與母樹間的遺傳距離最大?！猩胶Α鲉沃昱c母樹間的遺傳距離總體上小于‘中山含笑’單株間的遺傳距離，說明‘中山含笑’與母樹具有部分相近的遺傳組成；其中，Z610與母樹的遺傳差異最小，Z616與母樹的遺傳差異最大。

表4 ‘中山含笑’和臺灣含笑表型無變異子代的遺傳多樣性分析

表5 ‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代間的遺傳一致度和遺傳距離1)

2.3 ‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代的遺傳關系分析

為進一步探討‘中山含笑’與臺灣含笑母樹及其表型無變異子代的遺傳關系，根據(jù)上述22份樣本的遺傳一致度采用UPGMA法進行聚類分析，結果見圖2。在遺傳一致度為0.50處，供試的22份樣本分為2組，其中，母樹和3個表型無變異子代單株聚為Ⅰ組，‘中山含笑’18個單株聚為Ⅱ組。在遺傳一致度為0.64處，Ⅱ組分為4個亞組，其中，‘中山含笑’Z608單獨聚為Ⅱ1亞組；Z602、Z605、Z603、Z606、Z613、Z614和Z610聚為Ⅱ2亞組；Z607、Z617、Z609、Z618、Z611和Z615聚為Ⅱ3亞組；Z601、Z612、Z604和Z616聚為Ⅱ4亞組。

由此可見，母樹和表型無變異子代具有極為緊密的遺傳關系，而‘中山含笑’18個單株與母樹和表型無變異子代的遺傳關系較遠；在‘中山含笑’18個單株中，Z608與其他17株單株的遺傳關系較遠。

Z601-Z618: ‘中山含笑’單株Individuals of Michelia ‘Zhongshanhanxiao’; M: 臺灣含笑母樹Mother tree of M. compressa (Maxim.) Sarg.; N1-N3: 臺灣含笑表型無變異子代單株Individuals of progeny without phenotypic variation of M. compressa.

3 討論和結論

SSR標記分析結果表明：臺灣含笑3個表型無變異子代在5個位點上與臺灣含笑母樹的基因分型完全一致，表明母樹與表型無變異子代擁有高度相似的遺傳基礎。由于供試的母樹是由同一株臺灣含笑實生苗經(jīng)采穗嫁接繁殖的無性系，攜帶完全相同的遺傳信息，其不同單株之間花粉傳播并授粉產(chǎn)生的子代屬于同一基因型的自交子代；而表型無變異子代的葉片形態(tài)與母樹高度相似，因而，推測表型無變異子代為母樹通過自由授粉產(chǎn)生的自交后代。在母樹的SSR標記分析中，5個位點中有4個為純合位點，其自交子代在這4個位點上不會產(chǎn)生遺傳分化，因此，表型無變異子代單株也具有這4個純合位點；但M02引物對應的位點在母樹和表型無變異子代單株中均為雜合位點，由于取樣單株數(shù)量較少，并不能確定該位點是否存在遺傳分化，因此，后續(xù)將通過擴大表型無變異子代樣本的數(shù)量，進一步確定該位點的遺傳分化程度。

從2萬余株臺灣含笑自由授粉子代中僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)表型明顯變異的單株(即‘中山含笑’)，產(chǎn)生這種變異的概率較低，僅0.09%，推測由臺灣含笑母樹自交產(chǎn)生這種變異的可能性不大。通過SSR標記分析，5個SSR引物在‘中山含笑’不同單株中的擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)等位基因的雜合性，即‘中山含笑’18株單株除攜帶母樹的遺傳信息外，還各自含有來源于母樹之外的遺傳信息；加之在表型特征上‘中山含笑’供試單株的葉片和花明顯大于母樹，且長勢也明顯高于同齡的表型無變異子代，開花的株齡早于表型無變異子代，因此，推測‘中山含笑’為臺灣含笑與木蘭科其他植物的種間雜交后代。

聚類分析結果顯示：‘中山含笑’18株單株可以分成4個亞組，其中Z608獨立成為1個亞組，另外17株單株聚為另3個亞組；其中，在Ⅱ2亞組的7株單株中，Z602與Z605、Z606與Z613和Z614單株間的遺傳一致度均為1.000，說明Z602與Z605、Z606與Z613和Z614間除具有相同的母本臺灣含笑的遺傳信息外，也各自具有相同父本的遺傳信息?！猩胶Α?8株單株與母樹和表型無變異子代可以明顯聚為2組，說明‘中山含笑’與臺灣含笑有較遠的遺傳關系，且‘中山含笑’18株單株聚為不同的亞組，說明有些單株的父本可能屬于木蘭科不同種類，特別是Z608的父本可能更為特殊。有關‘中山含笑’不同單株父本的研究將通過雜交實驗進一步驗證。

在本研究中，從62對來自木蘭科其他植物的SSR標記中篩選出5對SSR引物，分別來自深山含笑、灰木蓮和阿希氏木蘭，應用于本研究中均具有優(yōu)良的通用性，加之本研究選用高分辨率的熒光毛細管電泳基因分型技術，使用5對SSR引物共擴增出16個等位基因，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。因此，使用這5對SSR引物基本能反映‘中山含笑’與母樹和表型無變異子代的遺傳差異。

臺灣含笑在江蘇地區(qū)具有良好的耐寒性和生態(tài)適應性，是值得大力推廣應用的園林綠化樹種[11-13,28-30]。‘中山含笑’是臺灣含笑在遷地保育條件下產(chǎn)生的變異子代，不僅其生態(tài)適應性得到進一步加強，而且在生長和觀賞特征上表現(xiàn)出明顯的超親優(yōu)勢，具有廣闊的應用前景，因此，從品種創(chuàng)新的目的出發(fā)，應進一步弄清其遺傳背景，全面了解其生物學特征，并開展繁育和栽培技術等方面的研究。