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    狂犬病凍干滅活疫苗澄清與濃縮工藝的建立

    2022-06-21 09:15:14崔松奇張文芳劉興剛饒瀟君李曉靜
    畜禽業(yè) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:狂犬病毒聚醚中空

    崔松奇,張文芳,劉興剛,李 娥,饒瀟君,張 娜,李曉靜

    (豪威生物科技有限公司,天津 301700)

    0 引言

    狂犬病是由狂犬病毒引起的一種人獸共患傳染病,臨床癥狀表現(xiàn)為恐水、恐光、狂躁不安等[1]??袢《究筛腥救?、貓、狐貍等溫血動物,人一旦感染,致死率幾乎100%[2]。據(jù)估計,狂犬病流行于全球150多個國家,每年造成約59 000人死亡,其中95%的病例發(fā)生在非洲和亞洲[3],其中亞洲占56%,非洲占44%。大多數(shù)死亡(84%)都發(fā)生在農(nóng)村地區(qū),其主要原因是對于犬狂犬病監(jiān)管力度不足,特別是農(nóng)村從犬傳染給人的事件時有發(fā)生[4]。我國狂犬病全年都有流行,但相對集中于夏秋季節(jié),主要是農(nóng)民、學(xué)生、散居兒童發(fā)病較多[5]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)建議將犬類狂犬病疫苗接種率提高至70%[6],能有效阻止狂犬病毒的傳播。大規(guī)模犬類免疫接種也是消除人類狂犬病的根本措施[7]。因此探索狂犬病毒獸用疫苗制備工藝,研制安全高效價的獸用疫苗,從源頭控制,以切斷動物散毒途徑,對控制人感染狂犬病病毒事件的發(fā)生具有重大意義。

    1 材料

    連續(xù)流離心機:GL-21M型,購自湘儀公司。

    紫外分光光度計:BIOWAVE DNA,購自英國WPA公司。

    10寸0.45 μm孔徑聚醚砜材質(zhì)濾芯及套筒:購自Millipore公司。

    10寸6~40 μm和0.45~2 μm孔徑的雙級玻璃纖維材質(zhì)濾芯及套筒:購自PALL公司。

    狂犬病毒液:由本公司產(chǎn)車間提供。

    實驗動物:昆明系小鼠,11~13 g,購自北京實驗動物中心。

    中空纖維柱(500 k、750 k膜孔徑)及切向流濃縮夾具:聚醚砜材質(zhì),0.5 m2膜面積,購自GE公司。

    超濾膜堆(100 k、300 K膜孔徑)及切向流濃縮夾具:Millipore公司,Pellicon2 盒式濾器,改良聚醚砜材料,0.5 m2膜面積膜堆。

    檢驗用強毒狂犬病固定毒巴黎株:代號AV2011,代次,21代,規(guī)格 0.1 g,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。

    狂犬病參考疫苗標準品:Rabies Vaccine(Inactivated)CRS,European Pharmacopoeia。

    2 方法

    2.1 澄清試驗

    1)利用連續(xù)流離心機,在13 000 r/min轉(zhuǎn)速下,采取50 mL/min的進液量,對20 000 mL狂犬病毒液進行連續(xù)離心澄清。

    2)使用10寸0.45 μm膜孔徑聚醚砜材質(zhì)濾芯對20 000 mL狂犬病毒液進行過濾澄清。

    3)使用10寸6~40 μm和0.45~2 μm膜孔徑的雙級玻璃纖維材質(zhì)濾芯對20 000 mL狂犬病毒液進行過濾澄清。

    4)記錄每種澄清方式的處理量以及澄清時間。

    5)采集澄清前和澄清后病毒液樣品進行病毒含量測定,采用小鼠腦內(nèi)接種法測定LD50。

    6)使用紫外分光光度計對澄清前和澄清后病毒液樣品進行蛋白含量的測定。用紫外分光光度計檢測樣品在260 nm和280 nm波長下的吸收值,通過公式計算總蛋白含量。

    2.2 濃縮試驗

    1)分別采用500 k、750 k膜孔徑中空纖維和100 k、300 k膜孔徑超濾膜堆對澄清的狂犬病毒液進行濃縮,濃縮至原體積的1/50,收集濃縮后病毒液。

    2)采集濃縮前和濃縮后病毒液樣品以及透過液進行病毒含量測定、蛋白含量測定。

    3)采集濃縮前和濃縮后病毒液樣品以及透過液,使用終濃度為1/4000的β-丙內(nèi)酯滅活狂犬病毒,使用NIH(National Institutes of Health)法進行濃縮前樣品、濃縮后樣品、透過液的效力檢測。

    3 試驗結(jié)果

    3.1 澄清試驗結(jié)果

    3.1.1 澄清前后抗原病毒含量測定結(jié)果

    澄清前后抗原病毒含量測定結(jié)果如表1所示??梢钥闯觯AЮw維和聚醚砜材質(zhì)濾芯澄清前后病毒含量差異不顯著,而離心方式由于耗時太長澄清前后病毒含量下降顯著。這表明玻璃纖維和聚醚砜材質(zhì)濾芯對病毒蛋白具有低吸附率和低攔截率。

    表1 病毒含量測定結(jié)果 單位:LD50/0.03 mL

    3.1.2 澄清前后抗原蛋白含量測定結(jié)果

    澄清前后抗原蛋白含量測定結(jié)果如表2所示??梢钥闯?,3種澄清方式澄清前后蛋白含量差異不顯著,這表明3種澄清方式均具有低蛋白攔截的特性。由于3種方式澄清液的澄清度差異也不顯著,這表明在澄清度方面,這3種方式均能達到要求。

    表2 蛋白含量測定結(jié)果 單位:μg/mL

    3.1.3 各種澄清方式澄清時間比較

    各種澄清方式澄清時間如表3所示。可以看出,這3種澄清方式只有玻璃纖維材質(zhì)濾芯才能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的要求,而離心方式和聚醚砜材質(zhì)濾芯過濾方式都存在耗時太長的缺點。

    表3 澄清時間

    綜上所述,由于雙級玻璃纖維材質(zhì)濾芯蛋白吸附少、澄清效率高,建議選擇雙級玻璃纖維材質(zhì)濾芯作為狂犬病滅活疫苗下游生產(chǎn)工藝的澄清設(shè)備。

    3.2 超濾濃縮試驗結(jié)果

    3.2.1 濃縮前后病毒含量測定結(jié)果(小鼠腦內(nèi)接種法)

    濃縮前后病毒含量測定結(jié)果如表4所示??梢钥闯?,500 k膜孔徑中空纖維、750 k膜孔徑中空纖維、100 k膜孔徑膜堆濃縮后病毒含量比濃縮前提高了1.0個滴度,300 k膜孔徑膜堆濃縮前后病毒含量無顯著變化;從濾出液的檢驗可以看出,500 k膜孔徑中空纖維、750 k膜孔徑中空纖維、100 k膜孔徑膜堆,這三種濃縮方式可以有效攔截病毒蛋白,300 k膜孔徑膜堆不能有效攔截病毒蛋白。

    表4 濃縮前后病毒含量測定 單位:LD50/0.03 mL

    3.2.2 濃縮前后抗原效價測定結(jié)果

    濃縮前后抗原效價測定結(jié)果如表5所示??梢钥闯?,采用750 k膜孔徑中空纖維濃縮后的抗原,其效價均要高于500 k膜孔徑中空纖維和100 k膜孔徑膜堆,表明750 k膜孔徑中空纖維濃縮效率高,病毒損失少;300 k膜孔徑膜堆濾出液和濃縮前樣品效價相差不顯著,說明300 k膜孔徑膜堆不能有效攔截狂犬病毒蛋白。

    表5 濃縮前后抗原效價測定 單位:IU

    3.2.3 各種濃縮方式雜蛋白去除效果比較

    各種濃縮方式雜蛋白去除效果比較如表6所示??梢钥闯?,500 K和750 K膜孔徑中空纖維切向流超濾雜蛋白去除率優(yōu)于100 K膜包切向流超濾約10%;300 K膜包由于不能有效截留病毒蛋白,所以濃縮后的蛋白含量要遠遠低于其他三組。

    表6 雜蛋白去除效果比較

    綜上所述,由于750 K膜孔徑中空纖維能夠完全截留狂犬病毒蛋白,濃縮效率高、病毒損失少、雜蛋白去除效果好,建議選擇750 k膜孔徑的中空纖維作為狂犬病滅活疫苗下游生產(chǎn)工藝的濃縮設(shè)備。

    4 討論

    選擇澄清的目的是除去細胞碎片等大顆粒物質(zhì),選擇澄清設(shè)備的要求是具有低蛋白吸附率、速度快、澄清度好。連續(xù)流離心機離心法雖然對雞胚尿囊液的一次處理量在100萬mL以上,但是連續(xù)流離心機澄清溶液的澄清度與澄清的速度成反比,澄清速度越快,澄清后溶液的澄清度越差。聚醚砜材質(zhì)濾芯多用于澄清度較好溶液的澄清和除菌過濾,而對于溶液中含有大量的細胞碎片和血清來說,過濾過程中易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象。究其原因聚醚砜材質(zhì)濾芯屬于表面過濾,過濾過程中所有大于膜孔徑的雜質(zhì)很快就堵塞了膜孔徑,因此這種材質(zhì)的濾芯無法滿足澄清度差的溶液工業(yè)化的澄清需要。雙級玻璃纖維材質(zhì)濾芯屬于深層過濾、漸進結(jié)構(gòu),第一級膜孔徑的范圍6~40 μm,第二級膜孔徑的范圍0.45~2 μm,這樣的構(gòu)造使得不同分子量大小的雜質(zhì)被分級攔截,這就是玻璃纖維材質(zhì)濾芯容污能力強的原因。通過比較聚醚砜材質(zhì)濾芯、雙級玻璃纖維材質(zhì)濾芯和連續(xù)流離心機,可以看出,無論是低蛋白吸附率還是澄清度方面,這三種方式均能達到要求,但由于離心方式和聚醚砜材質(zhì)濾芯過濾方式耗時長、容污能力差,所以最終選定玻璃纖維材質(zhì)濾芯作為澄清設(shè)備。

    切向流濃縮系統(tǒng)有兩種:一種是盒式膜即膜包濃縮系統(tǒng),另一種是中空纖維管系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)均是以切向流方式進行濃縮的,盒式膜由于具有篩網(wǎng),當料液流經(jīng)篩網(wǎng)時,形成湍流效應(yīng),湍流效應(yīng)的存在,使得透過流速增加,提高了濃縮效率,但也增大了對目的蛋白的剪切力;中空纖維系統(tǒng)由于不具有篩網(wǎng),所以在相同流速下中空纖維系統(tǒng)產(chǎn)生的剪切力要比盒式膜小的多[8]。因此,盒式膜適合于性質(zhì)穩(wěn)定,能耐受機械損傷的料液,這樣可以在高流速下運行,從而提高濃縮效率。而對于那些不耐受機械損傷的物質(zhì),更適合用中空纖維管系統(tǒng)進行濃縮。狂犬病毒只能耐受比較弱的剪切力,因為狂犬病毒分子表面的糖蛋白在剪切力作用下很容易脫落。而糖蛋白不但與病毒吸附和病毒毒力有關(guān),而且是唯一能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的表面抗原,所以糖蛋白的脫落勢必導(dǎo)致狂犬病毒免疫原性的降低。從4批病毒液濃縮的效果來看,使用中空纖維濃縮病毒液的效價平均要高于膜包濃縮病毒液效價1~2 IU。該試驗的結(jié)果證明了中空纖維在濃縮過程中對狂犬病毒的剪切力更小。

    5 結(jié)論

    狂犬病滅活疫苗下游工藝采取玻璃纖維材質(zhì)濾芯和750 k膜孔徑的中空纖維,進行澄清和濃縮,濃縮抗原經(jīng)過β-丙內(nèi)酯2℃~8℃滅活后進行凝膠過濾純化,純化抗原加入凍干保護劑冷凍干燥,突破了狂犬病凍干滅活疫苗下游工藝規(guī)模化生產(chǎn)的瓶頸,該生產(chǎn)工藝通過驗證可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)。

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