CYP2D6基因在結(jié)直腸癌細胞侵襲和遷移中的作用及調(diào)控機制研究

黃明 江明鳳 邱黎清

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是常見消化道惡性腫瘤之一，全球癌癥流行病學數(shù)據(jù)庫（GLOBOCAN）2018數(shù)據(jù)顯示，每年全球CRC新發(fā)病例數(shù)近1 800 000，死亡病例數(shù)超過800 000，居惡性腫瘤第3位[1-2]。越來越多的研究顯示，多種遺傳及表觀遺傳上的異常和積累與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。目前通常采用以手術(shù)切除、放療和化療為主的綜合治療，但預后較差，很多患者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移，而對于這些患者尚缺乏有效的治療手段[4]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移導致的并發(fā)癥仍是CRC患者死亡的主要原因，N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的5年總生存率僅為10.9%[5]。因此，CRC轉(zhuǎn)移過程的分子機制亟待深入探索且意義重大。

其中DNA甲基化修飾、組蛋白翻譯后修飾是CRC表觀遺傳的主要調(diào)控機制并日益受到關(guān)注[6-9]。細胞色素P450酶系（cytochrome P450,CYP）是人體中最重要的Ⅰ相藥物代謝酶[10]。CYP等位基因的多態(tài)性與CRC的發(fā)生、侵襲、遷移密切相關(guān)[11-12]。作為CYP家族成員之一，CYP2D6基因主要表達于肝臟及一些肝外器官（如腦和腸），盡管其含量僅占肝臟CYP總量的1.3%～4.3%，但其介導了肝臟中近20%處方藥的代謝（超過160種）[13-14]。然而，CYP2D6基因是否參與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的報道較少。因此，本研究旨在探討CYP2D6基因在CRC細胞侵襲和遷移中的作用，并對其調(diào)控機制進行初步分析。

1 材料和方法

1.1 材料 本實驗所用CRC組織及其配對的正常組織來源于2018年6月至2019年7月杭州市腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)的CRC患者。CRC組織取自原發(fā)癌灶，配對的正常組織取自距癌灶邊緣5 cm以上的正常結(jié)直腸組織，最終收集28對組織標本并立即保存于RNAlaterTMSOLUTION中用于mRNA分析。納入標準：（1）患者年齡≥18周歲，男女不限；（2）經(jīng)組織病理學檢查明確診斷為CRC；（3）患者為新發(fā)病例，尚未接受手術(shù)、化療或靶向治療等治療；（4）能夠獲得足夠的新鮮腫瘤組織標本。排除標準：（1）患者缺乏病理診斷；（2）非CRC新發(fā)患者；（3）無法通過手術(shù)獲得足夠的新鮮腫瘤組織標本；（4）無法獲得隨訪信息的患者；（5）研究者認為其他不適合入組的患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準[批件號：（HZCH-2018）快審第（009）號]，所有患者均簽署知情同意書。

CRC細胞系HT29和SW480購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器 RNAlaterTMSOLUTION（AM7020）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RNAsimple總RNA提取試劑盒（DP419）購自中國天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRR036A）和 Real Time SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒（DRR420A）購自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；總RNA提取試劑盒（AP-MN-MSRNA-250G）購自美國愛思進生物技術(shù)有限公司；OPTI-MEMI（1×）（31985-062） 購自美國 Gibco公司；Matrigel matrix基質(zhì)膠（356234）購自美國BD公司；DMSO（D5879）、DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-2'-deoxycytidine（DAC）（A3656）、anti-CYP2D6（QC12317）一抗購自美國Sigma-Aldrich公司；組蛋白去乙?；敢种苿?Vorinostat（SAHA）（S1047）購自美國 Selleck Chemicals公司；Lipofectamine3000Reagen（tL3000-015）購自美國 Invitrogen公司；anti-GAPDH（AM1020b）一抗購自蘇州百遠生物科技有限公司；FDbio-Femto ECL Ki（tFD8030）購自杭州弗德生物科技有限公司；RIPA裂解液（P0013B）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（ST505）、蛋白酶抑制劑 Leupeptin（SG2012）、蛋白酶抑制劑 Pepstatin A（SG2016）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）彩色濃縮膠試劑盒（BP108）、10%SDS-PAGE預混分離膠試劑盒（BP114）均購自上海鉑萊生物科技有限公司；Goat anti-Rabbit二抗（7074P2）和Goat anti-Mouse二抗（7076P2）均購自美國Cell Signaling公司。引物、pcDNA3.1-CYP2D6質(zhì)粒和pcDNA3.1空載質(zhì)粒均由上海生工生物工程有限公司合成。

IX51型電子顯微鏡購自日本Olympus公司；CO2培養(yǎng)箱、1300系列Ⅱ級A2型生物安全柜、高速冷凍離心機FRESCO 17均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；細胞計數(shù)儀Countstar IC1000購自深圳亨睿生物科技有限公司；熒光定量PCR儀ABI 7500及配套分析軟件均購自美國ABI公司；Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)購自美國Bio-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)GenoSens1500購自上海勤翔科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析 利用公開的數(shù)據(jù)庫OncomineTM對已公開的Microarray數(shù)據(jù)進行分析，比較CRC組織和正常組織中CYP2D6基因 mRNA表達水平的變化。閾值設(shè)定：P≤0.05，F(xiàn)old Change：2；Gene Rank：all；DATA TYPE：mRNA。

1.3.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理 將HT29和SW480細胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基分別為McCoy's 5A和Leibovitz's L-15，各添加10%FBS和1×青霉素鏈霉素。選擇對數(shù)生長期的HT29和SW480細胞，HT29細胞接種量為每孔3×106個細胞，SW480細胞接種量為每孔2.5×106個細胞，分別接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后，每種培養(yǎng)的細胞分為4組，第一組為DMSO組，細胞培養(yǎng)液中加入0.1%DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；第二組為甲基化抑制組（DAC組），細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為5 μmol/L的DAC，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；第三組為乙?；种平M（SAHA組），細胞培養(yǎng)液中先加入0.1%DMSO，培養(yǎng)24 h后，細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為1 μmol/L的SAHA繼續(xù)培養(yǎng)48 h；第四組為甲基化和乙?；p抑制組（DAC+SAHA組），細胞培養(yǎng)液中先加入終濃度為5 μmol/L的DAC培養(yǎng)24 h，再加入終濃度為1 μmol/L的SAHA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 組織及細胞總RNA提取 取28對CRC組織及其配對的正常組織各約20～50 mg，剪碎，用液氮充分研磨后，加入1 ml的裂解液，隨后轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，組織RNA提取按照RNAsimple總RNA提取試劑盒的操作說明書操作。分別收集各組細胞，按照總RNA提取試劑盒的操作說明書提取細胞RNA。測定組織樣本及細胞樣本RNA濃度，用PrimeScriptTMRT Master Mix進行逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，進行熒光定量PCR。

1.3.4 CRC組織和各組細胞CYP2D6基因mRNA表達水平的檢測 采用熒光定量PCR法。將組織樣本及細胞樣本的cDNA，用Real Time SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒檢測對應(yīng)基因的mRNA表達水平。定量引物序列如下，CYP2D6-F：3'-TTCCTCAGGCTGCTGGAC-5'；CYP2D6-R：3'-CGCTGGGATATGCAGGAG-5'；內(nèi)參 PPIB-F：3'-TGTGGTGTTTGGCAAAGTTC-5'；PPIB-R：3'-GTTTATCCCGGCTGTCTGTC-5'。10 μl體系中包含以下組分：Real Time SYBR Premix Ex TaqTM（2×）5 μl，引物（2 μmol/L）各 0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 3 μl。PCR 參數(shù)為：預變性 95 ℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火、延伸60℃ 30 s共40循環(huán)；熔解曲線 95℃ 15 s，60℃ 1 min，Ramp increment 0.3℃，95℃ 15 s。檢測CRC組織和各組細胞CYP2D6基因mRNA表達水平。

1.3.5 各組細胞CYP2D6蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法。用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）消化處理過的細胞，加入等體積完全培養(yǎng)液，1 000 r/min，室溫離心5 min，棄上清液；加入1 ml冰PBS清洗，1 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清液。將細胞置于6 cm的細胞皿中并加入60 μl預冷過的RIPA裂解液[臨用前加入 Leupeptin（終濃度 0.5 μg/ml）、PMSF（終濃度 1 mmol/ml）和 Pepstatin A（終濃度 0.7 μg/ml）]，混勻后置于冰上裂解30 min，每隔10 min充分震蕩1次。13 000 r/min，4℃離心30 min，取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，具體操作參見試劑盒操作說明書。測定濃度后，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）將濃度調(diào)整為 3 μg/μl，沸水變性10 min，進行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，去除封閉液，加入anti-CYP2D6一抗及anti-GAPDH一抗，4℃孵育過夜。次日回收一抗，1×TBST洗滌10 min×3次。然后分別加入 Goat anti-Rabbit二抗和Goat anti-Mouse二抗，室溫孵育2 h，繼續(xù)用1×TBST洗滌10 min×3次。等體積混勻FDbio-Femto ECL Kit試劑盒中的A液和B液，滴加到PVDF膜上孵育2 min，將PVDF膜放凝膠成像系統(tǒng)里進行曝光，檢測DAC和SAHA分別及聯(lián)合處理后HT29和SW480細胞的CYP2D6蛋白表達水平。

1.3.6 轉(zhuǎn)染實驗 將對數(shù)生長期的HT29細胞以50%的密度接種于6孔板中，根據(jù)Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染實驗。取潔凈EP管，每 120 μl OPTI-MEMⅠ加入 3 μl Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜置5 min。另取潔凈EP管，每 125 μl OPTI-MEMⅠ加入轉(zhuǎn)染終濃度為1 μg的pcDNA3.1-CYP2D6質(zhì)粒和pcDNA3.1空載質(zhì)粒，混勻，分別和轉(zhuǎn)染試劑溶液混勻，室溫孵育15 min。將孵育結(jié)束后的混合溶液每孔250 μl加入細胞中，輕輕搖晃均勻，將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CYP2D6基因質(zhì)粒的HT29細胞作為實驗組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的HT29細胞作為對照組。將兩組細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后替換為新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.3.7 Transwell細胞侵襲實驗 收集實驗組和對照組細胞，將細胞重懸稀釋至 1×105個/ml，吸取 100 μl的細胞懸液加入Transwell上室中（事先鋪好終濃度為 250 μg/ml的 Matrigel matrix膠），下室加入 600 μl完全培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隔天Transwell上室換成100 μl無血清培養(yǎng)液，下室加入600 μl完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出Transwell上室，棄盡培養(yǎng)液，用棉棒擦去Matrigel matrix膠和聚酯膜上表面的細胞，取出上室，用多聚甲醛固定，室溫放置15 min；結(jié)晶紫溶液染色，室溫放置15 min；顯微鏡下拍照記錄上室細胞數(shù)量變化。

1.3.8 細胞劃痕試驗 在6孔板中接種實驗組和對照組細胞，細胞數(shù)為6×106個；待細胞鋪滿板底后，用200 μl的槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致；吸棄細胞培養(yǎng)液，用PBS洗孔板2次，洗去劃痕產(chǎn)生的細胞碎片；加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄；將6孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按0、12 h拍照記錄；根據(jù)收集圖片，分析并統(tǒng)計細胞遷移能力。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用Prism 6統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，28對CRC組織標本結(jié)果分析采用配對Wilcoxon符號秩和檢驗，細胞實驗數(shù)據(jù)分析采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2D6基因在CRC組織的表達水平 Oncomine數(shù)據(jù)庫中Microarray數(shù)據(jù)顯示見圖1，CRC組織CYP2D6基因的表達水平顯著低于正常組織（P＜0.05）。為確認數(shù)據(jù)庫所得的結(jié)論，本研究將28對CRC組織及其配對的正常組織進行熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，CRC組織CYP2D6基因mRNA表達水平明顯低于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中CRC組織與非配對的正常組織中CYP2D6基因的表達水平

圖2 CRC組織及其配對的正常組織中CYP2D6基因的表達情況（a：CRC組織及其配對的正常組織中CYP2D6基因mRNA的表達水平；b：CYP2D6基因在28對患者CRC組織及其配對的正常組織中表達水平比較）

2.2 表觀遺傳藥物對CRC細胞CYP2D6基因及蛋白表達水平變化的比較 結(jié)果顯示，經(jīng)DAC處理后，與DMSO組比較，HT29和 SW480細胞 CYP2D6基因mRNA和CYP2D6蛋白表達水平均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。經(jīng)SAHA處理后，與DMSO組比較，HT29和SW480細胞CYP2D6基因mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CYP2D6蛋白表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DAC+SAHA組與DMSO組、DAC組和SAHA組相比，HT29和SW480細胞CYP2D6基因mRNA和CYP2D6蛋白表達水平均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 表觀遺傳藥物DAC、SAHA處理CRC細胞CYP2D6基因mRNA和CYP2D6蛋白表達水平的比較（a：藥物處理各組后HT29和SW480細胞CYP2D6基因mRNA表達水平b：藥物處理各組后HT29和SW480細胞CYP2D6蛋白表達電泳圖；c：藥物處理各組后HT29細胞CYP2D6蛋白灰度分析圖；d：藥物處理各組后SW480細胞CYP2D6蛋白灰度分析圖）

2.3 CYP2D6基因過表達細胞侵襲和遷移能力變化的比較 劃痕實驗結(jié)果顯示，CYP2D6基因過表達后，HT29細胞的遷移能力明顯弱于對照組（圖4a，插頁）；Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HT29細胞過表達CYP2D6基因后下室側(cè)膜上細胞數(shù)量明顯低于對照組（圖4b，插頁）。

圖4 CYP2D6基因過表達細胞侵襲和遷移能力變化的比較（a：劃痕實驗；b：Transwell細胞侵襲實驗）

3 討論

CRC是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率排名第3位，但死亡率排名第2位[15]。由于缺乏有效的治療手段，晚期CRC患者的死亡率很高，轉(zhuǎn)移是CRC患者復發(fā)和死亡的主要原因[15-16]。CRC的轉(zhuǎn)移進程受遺傳學和表觀遺傳學的有序及綜合調(diào)控[17-18]。CRC轉(zhuǎn)移的發(fā)生及調(diào)控機制一直是CRC研究的熱點和焦點。

CYP2D6是CYP家族中重要的藥物代謝酶，已有越來越多的研究顯示，其基因的多態(tài)性與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，如肺癌[19]、乳腺癌[20]、膀胱癌[21]、前列腺癌[22]等。本研究初步明確了CYP2D6基因與CRC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)：第一，CRC組織中的CYP2D6基因表達水平明顯低于正常組織；第二，CYP2D6基因的過表達可抑制CRC細胞的侵襲和遷移。

DNA甲基化是研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機制之一。已有研究表明，作為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，DAC可逆轉(zhuǎn)DNA的甲基化過程[23]。本研究結(jié)果顯示，DAC處理后HT29和SW480細胞CYP2D6基因表達水平明顯增加，暗示CRC患者CYP2D6基因表達水平的降低可能與甲基化有關(guān)。

組蛋白的乙?；揎検墙M蛋白翻譯后修飾的主要形式之一，而在腫瘤中，組蛋白的乙?；揎椡嬖诋惓：臀蓙y。SAHA作為去乙酰化酶抑制劑，可有效抑制組蛋白去乙酰化酶的活性，進而調(diào)控組蛋白的乙?；揎梉24]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)SAHA處理后，HT29和SW480細胞內(nèi)CYP2D6基因的表達水平和CRC細胞的轉(zhuǎn)移能力并無明顯變化，但與SAHA聯(lián)合處理后，CYP2D6的表達水平比DAC單獨處理有明顯升高。上述結(jié)果表明CYP2D6基因的表達主要受DNA甲基化的調(diào)控，組蛋白乙酰化修飾具有一定的協(xié)同效應(yīng)，其具體的作用機理仍有待進一步深入研究。

上述兩個表觀遺傳藥物處理CRC細胞后，CRC細胞CYP2D6基因低表達情況逆轉(zhuǎn)，劃痕實驗和Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，HT29細胞過表達CYP2D6基因后可顯著降低細胞的侵襲能力和遷移能力。

綜上所述，本研究首次提出并初步確認了CYP2D6基因在CRC細胞中具有抑制細胞轉(zhuǎn)移作用，并初步明確了細胞內(nèi)CYP2D6基因的表達受表觀遺傳修飾的調(diào)控。