硅藻通過消化道淋巴系統(tǒng)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)兔體內(nèi)的途徑

杜宇坤，劉景建，康曉東，余仲昊，鄭冬云，石河，徐曲毅，任建軍，劉超，趙建

1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 法醫(yī)病理學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510442；4.常州大學(xué)城鄉(xiāng)礦山研究院，江蘇 常州213164

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，水中尸體的死亡原因鑒定是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中最常見，也是最復(fù)雜的問題之一[1-2]。硅藻檢驗(yàn)被認(rèn)為是診斷溺死的可靠方法。溺水過程中，硅藻隨溺液被吸入肺中，部分硅藻穿過肺泡-毛細(xì)血管屏障進(jìn)入肺血管，并隨血流循環(huán)到達(dá)肺、肝、腎等器官[3-5]。因此，在肺、肝、腎等器官中發(fā)現(xiàn)硅藻被認(rèn)為是診斷溺死的支持性證據(jù)。

然而，硅藻檢驗(yàn)診斷溺死的可靠性存在爭議，主要是在非溺死者尸體的肺和肝、腎等器官中也可發(fā)現(xiàn)硅藻[6-10]。這些硅藻在生前已經(jīng)進(jìn)入體內(nèi)，消化道是其可能的來源之一[5,11]。某些食物，特別是貝類，含有大量的硅藻[5]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，硅藻可通過消化道屏障進(jìn)入體循環(huán)而到達(dá)組織器官，而且肺組織和心血中發(fā)現(xiàn)的硅藻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙或者肝血竇直徑，說明硅藻可能并不是經(jīng)過消化道靜脈系統(tǒng)進(jìn)入體循環(huán)?？紤]到毛細(xì)淋巴管的通透性較大，蛋白質(zhì)、細(xì)菌、異物等很容易通過胞吞作用進(jìn)入。因此，硅藻可能是通過消化道的淋巴系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)[11-12]。

本研究通過對(duì)實(shí)驗(yàn)兔灌胃模擬硅藻進(jìn)入消化道的過程，分析實(shí)驗(yàn)兔的淋巴液、肺、肝、腎組織中的硅藻含量和大小，探討硅藻是否通過淋巴液進(jìn)入體內(nèi)以及其在肺、肝、腎的分布。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本及分組

20只新西蘭大白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，精神狀態(tài)良好，飲食正常，在處理實(shí)驗(yàn)前12 h 僅喂食超純水，分為實(shí)驗(yàn)組（10 只，編號(hào)A1～A10）和對(duì)照組（10 只，編號(hào)B1～B10）。本研究通過常州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)2021002）。

提取廣州市區(qū)段珠江水樣作為灌胃硅藻樣本。植物油200 mL 用于使淋巴液呈乳白色[13]。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)組處理：使用50 mL 注射器吸取植物油10 mL和珠江水樣20 mL 灌胃。灌胃30 min 后采用七氟烷吸入麻醉，麻醉完全后使用組織剪沿腹中線打開腹腔，找到腸系膜根部，可見充滿乳白色淋巴液的淋巴管（圖1）[14]。使用采集玻璃針吸取可見的淋巴液，依次提取肝、腎、肺，提取的樣本置于-30°C 保存待檢。

圖1 植物油灌胃后淋巴液顯乳白色（箭頭）Fig.1 Lymph appears milky white after gavage with vegetable oil（Arrow）

對(duì)照組處理：使用50 mL 注射器吸取植物油10 mL和超純水20 mL 進(jìn)行灌胃。處理及取材同實(shí)驗(yàn)組。

硅藻檢驗(yàn)：使用微波消解-掃描電子顯微鏡法進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)[15]。取每只實(shí)驗(yàn)兔的全部淋巴液及肺、肝、腎組織各2 g 置于消解管中，加入8 mL 65%濃硝酸溶液（德國Merck 公司）和1 mL 30%過氧化氫溶液（德國Merck 公司），置于Multiwave 7000 微波消解儀（奧地利Anton Paar 公司）中進(jìn)行微波消解。消解完成后使用HL-6 多聯(lián)真空抽濾儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）抽濾消解液并制作電子顯微鏡樣品座，置于Phenom XL G2 臺(tái)式掃描電子顯微鏡（荷蘭PhenomWorld 公司）下觀察。記錄硅藻含量、大小和種類（分類到屬）。

取灌胃水樣、超純水及植物油各3 份，每份2 mL，按上述方法進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算硅藻含量（各組樣本硅藻含量均值）和硅藻大?。ǜ鹘M樣本所有檢出完整硅藻的長徑和短徑平均值），數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，使用SPSS 24.0軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但不具有方差齊性，選擇F檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布也不具有方差齊性，選擇秩和檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的淋巴液硅藻陽性率和硅藻種類進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 硅藻含量

超純水、植物油中未檢出硅藻。從表1可見，實(shí)驗(yàn)組淋巴液硅藻陽性率為100%（10/10），對(duì)照組淋巴液中硅藻陽性率為30%（3/10）。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的淋巴液硅藻陽性率比較時(shí)，總樣本量n＜40，故選用Fisher精確性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組陽性率高于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的淋巴液和水樣間硅藻含量不符合正態(tài)分布，故選擇秩和檢驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組淋巴液硅藻含量高于對(duì)照組（P＜0.05），水樣硅藻含量高于實(shí)驗(yàn)組淋巴液（P＜0.05）。

表1 淋巴液與水樣中的硅藻含量Tab.1 The concentration of diatoms of lymph and water sample

實(shí)驗(yàn)組中，在A4、A6、A9 3例肺樣本中分別檢出2、1、1 個(gè)硅藻，在A3、A6 2例肝樣本中各檢出1 個(gè)硅藻，腎樣本中未檢出硅藻。對(duì)照組中，在B4、B9 2例肺樣本中分別檢出1、2 個(gè)硅藻，在B2、B4、B7 3例肝樣本中各檢出1 個(gè)硅藻；腎樣本中未檢出硅藻。

2.2 硅藻種類

實(shí)驗(yàn)組淋巴液中檢出冠盤藻、圓篩藻、小環(huán)藻、直鏈藻、菱形藻、針桿藻、橋彎藻和舟型藻共8 類硅藻，其中中心綱占74.4%、羽紋綱占25.6%；對(duì)照組淋巴液中檢出冠盤藻、圓篩藻和小環(huán)藻共3 種硅藻，全部為中心綱；水樣中檢出冠盤藻、圓篩藻、小環(huán)藻、直鏈藻、菱形藻、針桿藻、橋彎藻和舟型藻共8 種硅藻，其中中心綱占88.7%，羽紋綱占11.3%。實(shí)驗(yàn)組淋巴液與水樣的硅藻種類比較時(shí)，n≥40 且所有的T≥5，故選用Pearson χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，硅藻種類之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組的中心綱硅藻比例低于水樣，羽紋綱硅藻高于水樣（表2）。

表2 淋巴液與水樣的硅藻種類Tab.2 Diatom types in the lymph and water sample（%）

實(shí)驗(yàn)組中，肺樣本中僅檢出冠盤藻，肝樣本中檢出冠盤藻和小環(huán)藻，腎樣本中未檢出硅藻。對(duì)照組中，肺樣本中分別檢出圓篩藻和冠盤藻，肝樣本中檢出冠盤藻，腎樣本中未檢出硅藻。

2.3 硅藻大小

對(duì)照組淋巴液、實(shí)驗(yàn)組淋巴液和水樣中檢出硅藻大小如表3 所示。實(shí)驗(yàn)組淋巴液中硅藻長徑長于對(duì)照組和水樣（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組淋巴液中硅藻短徑長于對(duì)照組（P＜0.05），而與水樣中硅藻短徑之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組淋巴液與水樣的硅藻大小相關(guān)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布且方差不齊，秩和檢驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組淋巴液的中心綱硅藻直徑與水樣相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而羽紋綱硅藻的長徑和短徑與水樣相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組淋巴液中羽紋綱硅藻長徑長于中心綱硅藻，而短徑短于中心綱硅藻（P＜0.05）。

表3 淋巴液與水樣中硅藻大小Tab.3 The size of diatoms in lymph and water sample [M（P25～P75），μm]

3 討論

硅藻在非溺死尸體組織中的檢出，使其診斷溺死的價(jià)值備受爭議[6-9]。法醫(yī)學(xué)者們一直努力找到非溺死尸體組織中硅藻的來源。HüRLIMANN 等[4,6,16-17]研究結(jié)果表明，硅藻可隨食物進(jìn)入消化道而被攝入體內(nèi)。張平萍的研究[11]也取得相似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)肺和心血中硅藻的直徑可大于100 μm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙或者肝血竇直徑。因此，這些較大的硅藻并非通過肝靜脈系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)。而毛細(xì)淋巴管基膜不完整，內(nèi)皮細(xì)胞薄且連接疏松，是液體和大分子物質(zhì)迅速通過的主要途徑，考慮硅藻可能通過淋巴系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)[11-12，18]。

本研究從腸系膜根部淋巴管中提取淋巴液進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組淋巴液的硅藻陽性率、含量、長徑、短徑與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組淋巴液中發(fā)現(xiàn)的硅藻種類與灌胃水樣中的硅藻種類一致，說明灌胃水樣的硅藻進(jìn)入了淋巴液。實(shí)驗(yàn)組淋巴液中的硅藻含量低于水樣（P＜0.05），這是因?yàn)槲改c道的黏膜屏障阻擋了大部分的硅藻，僅有少量硅藻可以通過屏障進(jìn)入淋巴液[19]。硅藻類型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組淋巴液中羽紋綱硅藻的比例高于水樣（P＜0.05），這說明羽紋綱硅藻更容易進(jìn)入淋巴管。其原因可能是實(shí)驗(yàn)組淋巴液中羽紋綱硅藻與中心綱硅藻比較，其長徑更長，短徑更短，當(dāng)毛細(xì)淋巴管腔擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞連接處張開時(shí)，形態(tài)更細(xì)長的硅藻更容易通過內(nèi)皮細(xì)胞的間隙進(jìn)入淋巴液[18]。實(shí)驗(yàn)組淋巴液中硅藻的長徑高于水樣，原因是實(shí)驗(yàn)組淋巴液中的中心綱硅藻占74.4%，較水樣低，以直徑5～30 μm 的冠盤藻、圓篩藻和小環(huán)藻為主；而形狀細(xì)長的羽紋綱占比25.6%，較水樣高，菱形藻、針桿藻等長徑分布在30～80 μm。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各有5 個(gè)肺和肝組織樣本檢出了少量硅藻，這部分硅藻可能是在實(shí)驗(yàn)兔生前進(jìn)入體內(nèi)的。實(shí)驗(yàn)組肺、肝、腎組織的硅藻含量沒有顯著增加，其原因可能是從灌胃到提取淋巴液的時(shí)間較短，而淋巴液流速較慢，硅藻沒有足夠的時(shí)間隨淋巴液回流進(jìn)入體循環(huán)[5,18]。

綜上所述，硅藻可以通過消化道淋巴系統(tǒng)進(jìn)入體內(nèi)，這可能是非溺死尸體組織器官內(nèi)含有硅藻的原因之一，但是這并不能成為否定硅藻診斷溺死價(jià)值的證據(jù)。因?yàn)橄赖钠琳献饔脤?dǎo)致僅有少量硅藻可以進(jìn)入組織器官，非溺死尸體組織器官的硅藻含量低于溺死尸體，通過量化分析仍然可以根據(jù)硅藻檢驗(yàn)結(jié)果診斷溺死[5,10]。