茶樹CsbHLH024和CsbHLH133轉(zhuǎn)錄因子功能鑒定

劉任堅，王玉源，劉少群，舒燦偉，孫彬妹，鄭鵬*

茶樹和轉(zhuǎn)錄因子功能鑒定

劉任堅1，王玉源1，劉少群1，舒燦偉2，孫彬妹1，鄭鵬1*

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室/群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642

茶樹葉片毛狀體含有多種次生代謝產(chǎn)物，在茶葉外觀質(zhì)量以及茶樹響應(yīng)生物和非生物脅迫方面起著重要作用。通過雙熒光分子互補（BiFC）試驗、GUS活性染色試驗以及過表達試驗對茶樹葉片毛狀體相關(guān)候選基因和的功能進行鑒定。結(jié)果表明，CsbHLH024/CsbHLH133和CsTTG1蛋白在植物中能夠相互作用，并且它們的啟動子能夠在葉片組織中驅(qū)動下游基因的表達。進一步將它們分別過表達到野生型擬南芥Col和對應(yīng)的擬南芥純合突變體中，發(fā)現(xiàn)它們能夠影響擬南芥葉片毛狀體的形成，恢復(fù)突變體的表型，并引起毛狀體相關(guān)基因表達水平的變化。本研究為進一步揭示茶樹葉片毛狀體形成的分子調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

茶樹；毛狀體形成；；；分子調(diào)控

植物毛狀體是從表皮細胞發(fā)育而來，主要由單細胞或多細胞組成[1-5]。毛狀體主要分布在植物的葉片、莖、葉柄、花瓣、種皮等組織[6]。在不同植物中，毛狀體的形態(tài)和功能各不相同。毛狀體按照形態(tài)和功能，可分為有分支毛狀體和無分支毛狀體、有腺毛狀體和無腺毛狀體，后者是用來區(qū)分毛狀體的常用標準[1]。植物毛狀體一般與葉片的水分和濕潤性有關(guān)[7-8]，在抵抗生物和非生物脅迫方面起著重要作用。其中，有腺毛狀體通過產(chǎn)生、儲存和分泌多種次生代謝產(chǎn)物，如生物堿、尼古丁、萜烯類物質(zhì)等，增強植物的抗蟲性從而抵抗生物脅迫[9-11]；而無腺毛狀體能夠增強植物對極端溫度、干旱、紫外線輻射等非生物脅迫的抗性[12]，保障植物在逆境條件下仍能正常生長發(fā)育。此外，植物有腺毛狀體分泌出來的次生代謝產(chǎn)物在食品和制藥行業(yè)中均得到應(yīng)用[13-14]。植物毛狀體在形成過程中受到一系列相關(guān)基因的調(diào)控，且分泌腺毛狀體和非分泌腺毛狀體在形成調(diào)控上具有顯著差異。在番茄和青蒿中，分泌腺毛狀體形成的調(diào)控機制相似。其中，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）可以通過降解茉莉酸信號傳導(dǎo)抑制子，釋放HD-Zip IV型轉(zhuǎn)錄因子，從而促進有腺毛狀體的形成；并且MYB和HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子在有腺毛狀體形成的過程中起著主要調(diào)控作用[15]。擬南芥的毛狀體屬于單細胞非分泌腺毛狀體，其形成的分子調(diào)控機制已經(jīng)十分清晰，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要通過一系列正向調(diào)控因子[MYB23/GLABRA1（GL1）、ENHANCER OF GLABRA3/GLABRA3（EGL3/GL3）和TRANSPARENT TESTA GLABRA 1（TTG1）]結(jié)合形成復(fù)合蛋白，激活誘導(dǎo)表皮細胞中（）基因的表達，從而促進擬南芥毛狀體的形成[16]。棉花毛狀體的發(fā)育過程和基因調(diào)控模式與擬南芥的相似，其中，、、（）、（Knotted related homeobox）和（Teosinte branched1/cycloidea/）等基因能夠參與棉花毛狀體發(fā)育的起始和伸長階段[17-19]。黃瓜毛狀體屬于多細胞非分泌腺毛狀體，目前已有一些與毛狀體形成相關(guān)的基因被克隆，如、和的突變體均表現(xiàn)為無毛[20-21]；Liu等[22]發(fā)現(xiàn)CsGL3、TRIL、MICT、TBH和CsGL1等編碼HD-Zip蛋白的基因可能是黃瓜表皮細胞分化和毛狀體發(fā)育的主要調(diào)控因子。此外，水稻表皮毛相關(guān)的基因也曾被報道。和（擬南芥的同源基因）可以抑制擬南芥毛狀體的發(fā)育，但無法影響水稻表皮毛的形成[23]；并且克隆出來的是否與水稻表皮毛形成相關(guān)還不清楚[24]。

茶樹[(L.) O. Kuntze]是多年生常綠木本植物，主要包括中國種（var.）和阿薩姆種（var.）兩個栽培品種[25]。茶樹毛狀體主要分布在葉片、嫩莖和子房中，并且作為茶樹葉片的主要特征物之一，毛狀體是茶組植物系統(tǒng)分類的重要依據(jù)[26]。茶樹葉片上的毛狀體又稱為“毫”，由單細胞組成，屬于不分支非分泌腺毛狀體，其體內(nèi)含有茶氨酸、茶多酚、咖啡堿、萜烯類等次生代謝物[27]。這些次生代謝產(chǎn)物均與茶葉的品質(zhì)和風味相關(guān)[28-30]。然而，Cao等[31]通過代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，毛狀體對茶葉的生化品質(zhì)沒有明顯的貢獻，或許僅有助于提高茶樹對生物和非生物脅迫的抗性和茶葉外觀質(zhì)量。茶樹葉片上的毛狀體不僅可以通過減少葉片水分流失，降低葉片表面溫度和反射外界光，降低茶樹遭受高溫、干旱和過度太陽輻射的風險[32-34]，還可以阻礙昆蟲在茶樹葉片上產(chǎn)卵、附著和取食[35-37]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，一些與疾病相關(guān)的信號基因以及抗草食動物和抗非生物脅迫的多肽在茶樹葉片毛狀體中特異轉(zhuǎn)錄，這也表明毛狀體可能具有增強茶樹物理和化學(xué)防御的功能[27]。近年來，也有報道有關(guān)茶樹葉片毛狀體形成的研究。Yue等[38]對有毛狀體和無毛狀體茶樹品種的葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選出21?599個差異表達基因，其中發(fā)現(xiàn)參與植物信號傳導(dǎo)和纖維素合成的相關(guān)基因可能對茶樹毛狀體的形成起著重要作用。Sun等[39]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹的表達水平與毛狀體密度相關(guān)，并且在擬南芥中過表達該基因，可以增加擬南芥葉片毛狀體的密度。茶樹葉片毛狀體的形成十分復(fù)雜，其分子調(diào)控機制仍需進一步研究。

在植物中，Basic helix-loop-helix（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子在葉片毛狀體的形成和生長發(fā)育過程中起著重要作用。課題組前期對茶樹bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族進行全面和系統(tǒng)的鑒定與分析，依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹和基因表達模式分析結(jié)果，初步篩選出與毛狀體形成相關(guān)的候選基因和[40]。本研究擬通過雙熒光分子互補（BiFC）試驗、GUS活性染色和基因過表達試驗對候選基因的功能進行鑒定，為研究茶樹葉片毛狀體形成的分子調(diào)控機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用本氏煙草（）和野生型擬南芥Col（）種子為實驗室保存，擬南芥突變體材料[salk_019114C（）和salk_118201C（）]從AraShare平臺（https://www.arashare.cn/index）購買。

1.2 載體構(gòu)建

依據(jù)（ID號：TEA008168.1）、（ID號：TEA033721.1）和（ID號：TEA000080.1）的CDS序列以及載體酶切位點，使用CE Design V1軟件設(shè)計同源重組引物（表1），下劃線部分為載體的酶切位點。以白葉單叢的cDNA為模板，使用PrimeSTAR酶進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，連接到對應(yīng)的線性化載體上，轉(zhuǎn)化至DH5后進行鑒定并測序，將陽性克隆提取質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

1.3 BiFC試驗

將和的CDS序列（去除終止密碼子）分別構(gòu)建到pSPYNE-35S/pUC-SPYNE（YNE）載體上，將的CDS序列（去除終止密碼子）構(gòu)建到pSPYCE-35S/pUC-SPYCE（YCE）載體上，以空白載體為對照，使用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101。用侵染液（10?mmol·L-1MgCl2，10?mmol·L-1MES，200?μmol·L-1AS，pH為5.6，現(xiàn)配現(xiàn)用）將收集后的菌體重懸至OD值為0.4～0.6，活化2?h后，將YNE/YNE- CsbHLH024/YNE-CsbHLH133、YCE/YCE-CsTTG1和細胞核marker（35S::NLS::Dsred）按體積比1∶1∶1混合，使用無針頭注射器將菌液從葉片下表皮注射到本氏煙草中，黑暗保濕培養(yǎng)24?h，再正常培養(yǎng)48?h后，用生物顯微鏡BX53（OLYMPUS，日本）進行觀察和拍照。

表1 載體引物序列

1.4 花序浸漬法侵染擬南芥花序

將和的CDS序列（去除終止密碼子）構(gòu)建到PBI121-GFP載體上，將和的啟動子片段構(gòu)建到CP013-GUS載體上，使用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101。用侵染液（2.1?g·L-1MS，50?g·L-1蔗糖，0.5?g·L-1MES，100?μL·L-1Silwet L-77，pH為5.7，現(xiàn)配現(xiàn)用）將收集后的菌體重懸至OD值為0.6～1.0，活化2?h后，將擬南芥的花序（去除已成熟的角果）完全浸泡在侵染液中，侵染1～3?min后，再將植株水平放置在黑色托盤中，置于22℃黑暗條件下保濕1?d，然后轉(zhuǎn)移至正常環(huán)境下培養(yǎng)，直至種子完全成熟后收集T0代種子。將T0代種子播種在1/2 MS篩選培養(yǎng)基（卡那霉素篩選質(zhì)量濃度50?μg·mL-1）上，篩選兩周后，將綠色植株移栽到土中，并提取植株葉片基因組DNA進行PCR擴增，將能夠擴增出目的基因片段的植株培養(yǎng)，并收集T1代種子，將T1代種子再次播種在1/2 MS篩選培養(yǎng)基上，篩選兩周后，將綠色植株移栽到土中，培養(yǎng)收集T2代種子備用。

1.5 GUS活性染色試驗

將T2代種子播種在土中生長，期間采集以下樣品：第一片真葉、子葉期植株、蓮座葉期植株和抽薹期植株，使用北京酷來搏科技有限公司的GUS染色試劑盒（CODE：SL7160）對植株不同組織進行染色，在顯微鏡下觀察染色情況。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Adobe Illustrator 2020軟件對圖片進行優(yōu)化，使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsbHLH024/CsbHLH133與CsTTG1之間的蛋白互作

bHLH轉(zhuǎn)錄因子通常與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用共同調(diào)控植物的生長發(fā)育以及次生代謝產(chǎn)物的合成。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CsbHLH024/CsbHLH133和CsTTG1在酵母系統(tǒng)中能夠相互作用；并且在不同發(fā)育葉片組織中的表達模式與和一致[40]。BiFC試驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)CsbHLH024-nYFP+cYFP-CsTTG1和CsbHLH133-nYFP+cYFP-CsTTG1的本氏煙草葉片中的細胞核會激發(fā)出強烈的黃色熒光，而單獨轉(zhuǎn)入其中任一基因的本氏煙草葉片中的細胞核均無法激發(fā)出黃色熒光（圖1）。表明CsbHLH024/CsbHLH133和CsTTG1蛋白在植物中能夠相互作用。

2.2 CsbHLH024和CsbHLH133啟動子驅(qū)動表達分析

為進一步確定和的表達部位，將候選基因啟動子構(gòu)建到CP013載體上，并且將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，利用花序浸漬法侵染擬南芥，通過抗生素篩選以及PCR擴增鑒定出轉(zhuǎn)基因株系（圖2-A），并對這些株系部分T2代植株進行GUS活性染色試驗。結(jié)果顯示，pro-CsbHLH024和pro-CsbHLH133能夠在擬南芥第一片真葉和蓮座葉上驅(qū)動的表達，將葉片染成藍色。其中，在子葉期，pro-CsbHLH024能在擬南芥下胚軸驅(qū)動的表達，將下胚軸染成藍色，pro-CsbHLH133能在擬南芥子葉和下胚軸驅(qū)動的表達，將子葉和下胚軸染成藍色；在抽薹期，pro-CsbHLH024和pro-CsbHLH133能夠在擬南芥蓮座葉和莖生葉上驅(qū)動的表達，將葉片染成藍色（圖2-B）。這表明啟動子pro-CsbHLH024和pro-CsbHLH133可能是在葉片組織中啟動和的表達。

表2 定量引物序列

注：比例尺=50?μm。Bright：明場通道；DsRed：紅色熒光通道；YFP：黃色熒光通道；Merged：融合通道

2.3 異源過表達CsbHLH024和CsbHLH133

為了進一步確定基因功能，在野生型擬南芥Col上進行了過表達試驗。其中，篩選出23株OE-和13株OE-轉(zhuǎn)基因植株（圖3-A）。測定和觀察3個OE-（OE--4，OE--7和OE--9）和3個OE-（OE--5，OE--19和OE--25）轉(zhuǎn)基因株系T2代植株的相關(guān)基因表達量和毛狀體表型。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達量顯著高于野生型對照（圖3-B）。相對野生型植株，OE-和OE-轉(zhuǎn)基因株系第一、二片真葉中間部位毛狀體分布較少（圖3-C），統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)基因株系第一、二片真葉上的毛狀體數(shù)量均顯著少于野生型植株（圖3-D）。進一步測定轉(zhuǎn)基因株系中毛狀體相關(guān)基因的表達量，發(fā)現(xiàn)相對于野生型植株，除了和外，其他毛狀體相關(guān)基因的表達量在轉(zhuǎn)基因株系中均顯著降低。其中，表達量在OE--4和OE--7轉(zhuǎn)基因株系中顯著上升；在OE--4和OE--7轉(zhuǎn)基因株系中顯著降低；的表達量在3個OE-株系中均顯著上調(diào)（圖3-E）。上述結(jié)果表明，在野生型在OE--9轉(zhuǎn)基因株系中，表達量降低，表達量升高；而和擬南芥中分別過表達和，會導(dǎo)致大部分與毛狀體形成相關(guān)基因的表達下調(diào)，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株上的葉片毛狀體數(shù)量減少。

注：A. 轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測。本試驗使用的是2?000?bp DNA Maker，水作為空白對照，Wild type（WT）-Col作為陰性對照，陽性對照為CP013-Pro-CsbHLH024/Pro-CsbHLH133-GUS質(zhì)粒。B. GUS活性染色結(jié)果。First true leaf：第一片真葉；Cotyledon：子葉期；Rosette leaf：蓮座葉；Bolting stage：抽薹期

2.4 CsbHLH024和CsbHLH133互補擬南芥突變體

互補擬南芥突變體也是驗證異源基因功能的重要試驗。在和突變體純合材料中進行基因互補試驗，篩選出12株-35S:和16株-35S:轉(zhuǎn)基因植株（圖4-A）。測定和觀察3個-OE-（-OE--4，-OE--10和-OE--11）和3個-OE-（-OE--13，-OE--15和-OE--16）轉(zhuǎn)基因株系的基因表達量和毛狀體表型。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達基因在對應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系中的表達量均顯著高于原突變體純合子材料（圖4-B）。相對原突變體植株，轉(zhuǎn)基因株系第一、二片真葉中間部位毛狀體分布增多（圖4-C）；統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)基因株系第一二片真葉上毛狀體的數(shù)量均顯著多于原突變體植株（圖4-D）。進一步測定轉(zhuǎn)基因株系中、毛狀體相關(guān)基因的表達量，發(fā)現(xiàn)相對于原突變體植株，-OE-和-OE-轉(zhuǎn)基因株系中毛狀體相關(guān)基因的表達變化并沒有明顯的規(guī)律性。其中，在3個-OE-轉(zhuǎn)基因株系中，幾乎所有的毛狀體相關(guān)基因的表達量都顯著降低；而在3個-OE-轉(zhuǎn)基因株系中，負調(diào)控基因的表達量顯著下調(diào)，正調(diào)控基因的表達量顯著升高（圖4-E）。結(jié)果表明，在和中分別過表達和，其表型得到恢復(fù)，植株第一、二片真葉上毛狀體數(shù)量增多，并且毛狀體相關(guān)基因的表達量也受到影響。

注：A. 轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測。本試驗使用5?000?bp DNA Maker，水作為空白對照，WT-Col作為陰性對照，陽性對照為PBI121-CsbHLH024/CsbHLH133-GFP質(zhì)粒。B. T2代轉(zhuǎn)基因植株目的基因表達情況。C. 毛狀體表型觀察。觀察部位是第一二片真葉。D. 毛狀體數(shù)量統(tǒng)計。數(shù)據(jù)是用平均值±標準差（n=24）來表示，采用Student’s test與陰性對照Col進行顯著性分析（**，P<0.01）。E. 擬南芥毛狀體相關(guān)基因在T2代轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況?；虮磉_量數(shù)據(jù)是用平均值±標準差來表示，采用Student’s test與陰性對照Col進行顯著性分析（**，P<0.01）

注：A. 轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測。本試驗使用2?000?bp DNA Maker，水作為空白對照，WT（Salk_118201C和Salk_019114C）作為陰性對照，陽性對照為PBI121- CsbHLH024/CsbHLH133-GFP質(zhì)粒。B. T2代轉(zhuǎn)基因植株目的基因表達情況。C. 毛狀體表型觀察。觀察部位是第一、二片真葉。D. 毛狀體數(shù)量統(tǒng)計。數(shù)據(jù)是用平均值±標準差（n=36）來表示，采用Student’s test與陰性對照gl3和egl3進行顯著性分析（**，P<0.01）。E. 擬南芥毛狀體相關(guān)基因在T2代轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況。基因表達量數(shù)據(jù)是用平均值±標準差來表示，采用Student’s test與陰性對照gl3和egl3進行顯著性分析（**，P<0.01）

3 討論

茶樹葉片毛狀體能夠提高茶葉的外觀質(zhì)量，增強茶樹抵抗病蟲害的抗性。前人研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在毛狀體的形成過程中起到重要作用[42-46]，然而bHLH轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控茶樹葉片毛狀體的形成還尚未清晰。本研究通過一系列的分子生物學(xué)手段對毛狀體形成相關(guān)候選基因和的功能進行鑒定。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子通常與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同調(diào)控植物生長發(fā)育過程。課題組前期對茶樹基因的功能進行研究，發(fā)現(xiàn)過表達該基因可提高擬南芥毛狀體的密度[39]；在4個不同發(fā)育階段葉片組織中的表達模式與和的一致，并且在酵母系統(tǒng)中，CsbHLH024/CsbHLH133可以與CsTTG1相互作用[40]。本研究通過BiFC試驗進一步驗證它們之間的互作關(guān)系。結(jié)果顯示，CsbHLH024/CsbHLH133在植物中也可以與CsTTG1相互作用（圖1）。在擬南芥中，AtTTG1也能夠與AtEGL3或AtGL3相互作用[45-46]。這表明CsbHLH024和CsbHLH133可能是通過與CsTTG1相互作用，共同參與調(diào)控茶樹葉片毛狀體的形成。茶樹毛狀體主要分布在葉片、嫩莖和子房中。本研究通過GUS活性染色試驗初步鑒定出候選基因的表達部位。結(jié)果顯示，Pro-CsbHLH024和Pro-CsbHLH133主要是在葉片組織中驅(qū)動下游的表達（圖2）。這表明和可能是在葉片組織中轉(zhuǎn)錄翻譯，并發(fā)揮功能。

茶樹是多年生木本植物，它的外植體離體再生率較低，并且茶樹組織中富含茶多酚，多酚類物質(zhì)能夠抑制農(nóng)桿菌的活性，導(dǎo)致茶樹遺傳轉(zhuǎn)化效率很低[47]。目前很難在茶樹本體上進行轉(zhuǎn)基因試驗進而直接驗證基因的功能。因此，本研究在野生型擬南芥Col中進行了基因過表達試驗，對候選基因的功能進行鑒定。結(jié)果顯示，在野生型擬南芥分別過表達和，其后代轉(zhuǎn)基因株系的第一、二片真葉表面的毛狀體數(shù)量顯著少于野生型植株，并且這些轉(zhuǎn)基因株系中大部分毛狀體相關(guān)基因的表達量下降。Szymanski等[48]在擬南芥中過表達，也發(fā)現(xiàn)其在一定程度上導(dǎo)致葉片毛狀體數(shù)量的減少。這一結(jié)果可能是由于擬南芥毛狀體調(diào)控途徑中存在著負反饋調(diào)節(jié)機制；并且在異源物種中進行基因過表達試驗，由于物種間基因調(diào)控機制存在差異，一些基因往往無法發(fā)揮其應(yīng)有的功能。此外，也有部分研究發(fā)現(xiàn)，過表達株系表型與擬南芥突變體表型一致，過表達株系沒有導(dǎo)致功能獲得，而是功能缺失[49-50]。因此，本研究還在對應(yīng)的擬南芥純合突變體上進行了基因互補試驗。結(jié)果顯示，在和突變體材料中過表達和，其表型得到恢復(fù)，轉(zhuǎn)基因株系第一、二片真葉上毛狀體數(shù)量增多，但毛狀體相關(guān)基因表達水平的變化并沒有明顯的規(guī)律性，這可能是由于擬南芥毛狀體的形成是由多個調(diào)控因子共同調(diào)控的，基因之間存在功能冗余[16]。上述結(jié)果表明，和能夠影響葉片毛狀體的形成、數(shù)量以及相關(guān)基因的表達水平。但是，具體的調(diào)控機制還需要進一步探究。

[1] Werker E. Trichome diversity and development [J]. Adv Bot Res, 2000, 31: 1-35.

[2] Serna L, Martin C. Trichomes: different regulatory networks lead to convergent structures [J]. Trends Plant Sci, 2006, 11(6): 274-280.

[3] Schilmiller A, Last R, Pichersky E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds [J]. Plant J, 2008, 54(4): 702-711.

[4] Ishida T, Kurata T, Okada K, et al. A genetic regulatory network in the development of trichomes and root hairs [J]. Annu Rev Plant Biol, 2008, 59: 365-386.

[5] 曹敏, 張璐, 高新梅, 等. 植物表皮毛發(fā)育分子調(diào)控機制的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(10): 4231-4235.

Cao M, Zhang L, Gao X M, et al. Advances in molecular regulation of plant trichome development [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2013, 41(10): 4231-4235.

[6] Wagner G, Wang E, Shepherd R. New approaches for studying and exploiting an old protuberance, the plant trichome [J]. Ann Bot, 2004, 93(1): 3-11.

[7] Fernandez V, Sancho-Knapik D, Guzman P, et al. Wettability, polarity, and water absorption of holm oak leaves: effect of leaf side and age [J]. Plant Physiol, 2014, 166(1): 168-180.

[8] Svetlikova P, Hajek T, Tesitel J. Hydathodetrichomes actively secreting water from leaves play a key role in the physiology and evolution of root-parasitic rhinanthoid Orobanchaceae [J]. Ann Bot, 2015, 116(1): 61-68.

[9] Dayan F, Duke S. Trichomes and root hairs: natural pesticide factories [J]. Pesticide Outlook, 2003, 14(4): 175. doi:10.1039/b308491b.

[10] Bleeker P, Mirabella R, Diergaarde P, et al. Improved herbivore resistance in cultivated tomato with the sesquiterpene biosynthetic pathway from a wild relative [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(49): 20124-20129.

[11] Luu V, Weinhold A, Ullah C, et al. O-acyl sugars protect a wild tobacco from both native fungal pathogens and a specialist herbivore [J]. Plant physiology, 2017, 174(1): 370-386.

[12] Yamasaki S, Murakami Y. Continuous UV-B irradiation induces endoreduplicationand trichome formation in cotyledons, and reduces epidermal cell division and expansion in the first leaves of pumpkin seedlings (Duch.×.Duch.) [J]. Environmental Control in Biology, 2014, 52(4): 203-209.

[13] Weathers P, Arsenault P, Covello P, et al. Artemisinin production in: studies in planta and results of a novel delivery method for treating malaria and other neglected diseases [J]. Phytochem Rev, 2011, 10(2): 173-183.

[14] Mellon J, Zelaya C, Dowd M, et al. Inhibitory effects of gossypol, gossypolone, and apogossypolone on a collection of economically important filamentous fungi [J]. J Agric Food Chem, 2012, 60(10): 2740-2745.

[15] Chalvin C, Drevensek S, Dron M, et al. Genetic control of glandular trichome development [J]. Trends Plant Sci, 2020, 25(5): 477-487.

[16] Schellmann S, Hulskamp M. Epidermal differentiation: trichomes inas a model system [J]. Int J DevBiol, 2005, 49(5/6): 579-584.

[17] 楊君, 馬峙英, 王省芬. 棉花纖維品質(zhì)改良相關(guān)基因研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(22): 4310-4322.

Yang J, Ma S Y, Wang S F. Advances in studies on genes related to cotton fiber quality improvement [J]. Chinese Agricultural Sciences, 2016, 49(22): 4310-4322.

[18] 唐凱. 棉花磷脂酶D基因家族的分子特征及其GhPLDα1功能分析[D]. 北京: 清華大學(xué), 2017.

Tang K. Molecular characterization of phospholipase D gene family and functional analysis of GhPLDα1 in cotton [D]. Beijing: Tsinghua University, 2017.

[19] Shi Y H, Zhu S W, Mao X Z, et al. Transcriptome profiling, molecular biological, and physiological studies reveal a major role for ethylene in cotton fiber cell elongation [J]. Plant Cell, 2006, 18(3): 651-664.

[20] Chen C, Liu M, Jiang L, et al. Transcriptome profiling reveals roles of meristem regulators and polarity genes during fruit trichome development in cucumber (L.) [J]. J Exp Bot, 2014, 65(17): 4943-4958.

[21] Pan Y, Bo K, Cheng Z, et al. The loss-of-functionmutation in cucumber is due to LTR-retrotransposon insertion in a class IV HD-ZIP transcription factor genethat is epistatic over[J]. BMC Plant Biology, 2015, 15: 302. doi: 10.1186/s12870-015-0693-0.

[22] Liu X, Bartholomew E, Cai Y, et al. Trichome-related mutants provide a new perspective on multicellular trichome initiation and development in cucumber (L) [J]. Front Plant Sci, 2016, 7: 1187. doi: 10.3389/fpls.2016.01187.

[23] Zheng K, Tian H, Hu Q, et al. Ectopic expression of R3 MYB transcription factor genein Arabidopsis, but not rice, affects trichome and root hair formation [J]. Sci Rep, 2016, 6: 19254. doi: 10.1038/srep19254.

[24] Qin B, Tang D, Huang J, et al. Rice OsGL1-1 is involved in leaf cuticular wax and cuticle membrane [J]. Mol Plant, 2011, 4(6): 985-995.

[25] Ming T, Bartholomew B. Theaceae [J]. Flora China, 2007, 12: 366-478.

[26] 陳亮, 虞富蓮, 童啟慶. 關(guān)于茶組植物分類與演化的討論[J]. 茶葉科學(xué), 2000, 20(2): 89-94.

Chen L, Yu F L, Tong Q Q. Discussion on the classification and evolution of tea plants [J]. Journal of Tea Science, 2000, 20(2): 89-94.

[27] Li P, Xu Y, Zhang Y, et al. Metabolite profiling and transcriptome analysis revealed the chemical contributions of tea trichomes to tea flavors and tea plant defenses [J]. J Agric Food Chem, 2020, 68(41): 11389-11401.

[28] Zhu M, Li N, Zhao M, et al. Metabolomic profiling delineate taste qualities of tea leaf pubescence [J]. Food Res Int, 2017, 94: 36-44.

[29] Wei C, Yang H, Wang S, et al. Draft genome sequence ofvar.provides insights into the evolution of the tea genome and tea quality [J]. PNAS, 2018, 115(18): E4151-E4158.

[30] Gilbert N. The science of tea's mood-altering magic [J]. Nature, 2019, 566(7742): S8-S9.

[31] Cao H, Li J, Ye Y, et al. Integrative transcriptomic and metabolic analyses provide insights into the role of trichomes in tea plant () [J]. Biomolecules, 2020, 10(2): 311. doi: 10.3390/biom10020311.

[32] Barman T, Baruah U, Saikia J. Seasonal changes in metabolic activities of drought tolerant and susceptible clones of tea (L.) [J]. Journal of Plantation Crops, 2008, 36(3): 259-264.

[33] Konrad W, Burkhardt J, Ebner M, et al. Leaf pubescence as a possibility to increase water use efficiency by promoting condensation [J]. Ecohydrology, 2015, 8(3): 480-492.

[34] Das S, Zaman A, Borchetia S, et al. Genetic relationship in tea germplasms with drought contrasting traits [J]. Plant Breeding and Biotechnology, 2016, 4(4): 484-494.

[35] 楊麗麗, 鄭高云, 梁麗云, 等. 茶樹抗病蟲機制的研究進展[J]. 福建茶葉, 2008(2): 8-11.

Yang L L, Zheng G Y, Liang L Y, et al. Research progress on resistance mechanism to disease and insect in tea plant [J]. Tea in Fujian, 2008(2): 8-11.

[36] Dutta M. Morphological resistance of certain tea clones to red spider mite () in tea [J]. Journal of Entomology and Zoology Studies, 2015, 4(3): 454-457.

[37] Bandyopadhyay T, Gohain B, Bharalee R, et al. Molecular landscape of helopeltis theivora induced transcriptome and defense gene expression in tea [J]. Plant molecular biology reporter, 2015, 33(4): 1042-1057.

[38] Yue C, Cao H, Chen D, et al. Comparative transcriptome study of hairy and hairless tea plant () shoots [J]. J Plant Physiol, 2018, 229: 41-52.

[39] Sun B, Zhu Z, Liu R, et al.() regulates leaf trichome density in tea[J]. Nordic Journal of Botany, 2020, 38(1): 1-10.

[40] Liu R, Wang Y, Tang S, et al. Genome-wide identification of the tea plant bHLH transcription factor family and discovery of candidate regulators of trichome formation [J]. Sci Rep, 2021, 11(1): 10764. doi: 10.1038/s41598-021-90205-7.

[42] Rerie W, Feldmann K, Marks M. Thegene encodes a homeo domain protein required for normal trichome development in[J]. Genes Dev, 1994, 8(12): 1388-1399.

[43] Luo D, Oppenheimer D. Genetic control of trichome branch number in: the roles of the FURCA loci [J]. Development, 1999, 126(24): 5547-5557.

[44] Payne C, Zhang F, Lloyd A. GL3 encodes a bHLH protein that regulates trichome development inthrough interaction with GL1 and TTG1 [J]. Genetics, 2000, 156(3): 1349-1362.

[45] Zhang F, Gonzalez A, Zhao M, et al. A network of redundant bHLH proteins functions in all TTG1-dependent pathways of[J]. Development, 2003, 130(20): 4859-4869.

[46] Zhao M, Morohashi K, Hatlestad G, et al. The TTG1-bHLH-MYB complex controls trichome cell fate and patterning through direct targeting of regulatory loci [J]. Development, 2008, 135(11): 1991-1999.

[47] Mondal T, Bhattacharya A, Laxmikumaran M, et al. Recent advances of tea () biotechnology [J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2004, 76(3): 195-254.

[48] Szymanski D, Jilk R, Pollock S, et al. Control ofexpression inleaves and trichomes [J]. Development, 1998, 125(7): 1161-1171.

[49] Boeglin M, Fuglsang A, Luu D, et al. Reduced expression ofnucleoporin gene affects auxin response in[J]. BMC Plant Biol. 2016, 16: 2. doi: 10.1186/s12870-015-0695-y.

[50] 張晨光. 蘋果核孔蛋白MdNup54/62調(diào)控開花和高溫脅迫響應(yīng)功能研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2021.

Zhang C G. Study on the function of apple nuclear pore protein MDNUP54/62 in regulation of flowering and heat stress response [D]. Yangling: Northwest A&F University, 2021.

Functional Identification ofandTranscription Factors in Tea Plants

LIU Renjian1, WANG Yuyuan1, LIU Shaoqun1, SHU Canwei2, SUN Binmei1, ZHENG Peng1*

1. College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. College of Agriculture, South China Agricultural University/Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control/Integrative Microbiology Research Center, Guangzhou 510642, China

Tea plant leaf trichomes contain various secondary metabolites and play an important role in the tea appearance quality as well as the response of tea plants to biotic and abiotic stresses. In this study, the function of leaf trichome-related genesandwere analyzed using Bimolecular Fluorescent Complimentary (BiFC), GUS staining and overexpression experiments. The results show that CsbHLH024/CsbHLH133 and CsTTG1 could interact in plants, and their promoters could drive downstream gene expression in leaf tissues. They were further transformed into wild(Col) and corresponding homozygous mutants, respectively to get overexpression lines. Both genes could affect the leaf trichome formation in, restore the phenotype of the mutants, and induce the expression levels of trichome-related genes. This study provided a theoretical basis for further research on the molecular regulation mechanism of trichome formation in tea leaves.

tea plant, trichome formation,,, molecular regulation

S571.1

A

1000-369X(2022)03-347-11

2021-12-18

2022-01-03

廣州市科技計劃項目（202102020290）、廣東省自然科學(xué)基金項目（2018A030313089、2021A1515012091）

劉任堅，男，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種與分子生物學(xué)研究。*通信作者：zhengp@scau.edu.cn

（責任編輯：趙鋒）