丁酸梭菌對(duì)主要商業(yè)飼用益生菌抑制作用的研究

王紹斌，張海鵬，高映紅，王 配，肖明霞，王乙茹，PHOUTHAPANE Vanhnaseng，程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2.玉溪市紅塔區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 玉溪 653100；3.昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司，昆明 650200；4.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 達(dá)州 635001；5.老撾農(nóng)林部畜牧與水產(chǎn)局，老撾 萬象 6644）

自2020年7月1日我國(guó)飼料工業(yè)全面禁用以促生長(zhǎng)為目的的藥物飼料添加劑以來，單一及復(fù)合飼用益生菌“替抗”的應(yīng)用效果與評(píng)估技術(shù)受到行業(yè)高度關(guān)注[1-3]。近年來，具有調(diào)控腸道菌群功效的飼用益生菌丁酸梭菌（Clostridium butyricum）成為行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)[4-6]。大量動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示[7-13]，飼糧單一添加丁酸梭菌對(duì)腸道多種有害菌具有顯著抑制作用，有助于畜禽生長(zhǎng)性能的改善。據(jù)此，研發(fā)人員為進(jìn)一步提升飼喂單一丁酸梭菌的應(yīng)用效果，初步開展了丁酸梭菌與其他主要商業(yè)益生菌的復(fù)合益生菌產(chǎn)品研發(fā)。現(xiàn)有研究顯示：僅有3篇?jiǎng)游镲曫B(yǎng)試驗(yàn)報(bào)道丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌[14-15]、地衣芽孢桿菌[16]的復(fù)合益生菌的飼喂效果優(yōu)于單一飼用丁酸梭菌；相反，更多的飼養(yǎng)試驗(yàn)顯示，與單一飼用丁酸梭菌比，丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌[17-18]、地衣芽孢桿菌[19]、凝結(jié)芽孢桿菌[20]或釀酒酵母[21]的復(fù)合益生菌，未能進(jìn)一步改善動(dòng)物生產(chǎn)性能。以上矛盾的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果提示，排除試驗(yàn)動(dòng)物、養(yǎng)殖條件、試驗(yàn)設(shè)計(jì)等因素的干擾，丁酸梭菌與其他商業(yè)益生菌可能存在拮抗效應(yīng)。

鑒于動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)易受試驗(yàn)動(dòng)物品種、日齡、養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生條件、試驗(yàn)因素及處理組設(shè)計(jì)等干擾[3,22-23]，建立客觀、標(biāo)準(zhǔn)的體外丁酸梭菌與其他商業(yè)益生菌復(fù)配效果的評(píng)估技術(shù)，有助于高效研發(fā)丁酸梭菌的復(fù)合益生菌產(chǎn)品。據(jù)此，本研究創(chuàng)新采用體外牛津杯抑菌試驗(yàn)法，探究丁酸梭菌對(duì)其他商業(yè)飼用益生菌可能的抑制作用，以便篩選出丁酸梭菌與其他商業(yè)飼用益生菌的復(fù)配方案，為穩(wěn)定動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果、保障養(yǎng)殖應(yīng)用效果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌

丁酸梭菌，從云南西雙版納茶花雞養(yǎng)殖場(chǎng)分離，經(jīng)鑒定命名為丁酸梭菌YNAU 5738，用于本次抑菌性能試驗(yàn)評(píng)估。

本試驗(yàn)6個(gè)指示菌，包括凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulansATCC 7050）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、屎腸球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、糞腸球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、 產(chǎn) 朊 假 絲 酵 母（Candida utiliBNCC336517），購(gòu)買自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 牛津杯抑菌試驗(yàn)

1.2.1 丁酸梭菌及指示菌的培養(yǎng)

（1）RCM 培養(yǎng)基：酵母膏3.0 g、牛肉膏10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖5.0 g、可溶性淀粉1.0 g、NaCl 5.0 g、三水合乙酸鈉3.0 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、蒸餾水1 000 mL。RCM 培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)丁酸梭菌24 h[24]。

（2）LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL。LB培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌24 h[22]。

（3）MRS培養(yǎng)基：酵母膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、NaCl 2.5 g、葡萄糖20.0 g、番茄汁50 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂1.0 g、蒸餾水1 000 mL。MRS培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌24 h[22]。

（4）凝結(jié)芽孢桿菌采用改良MRS培養(yǎng)基，參考柳成東等[25]的方法。

1.2.2 指示菌涂布平板制備

指示菌涂布平板采用MRS培養(yǎng)基，121 ℃滅菌30 min后冷卻，至50 ℃左右倒入培養(yǎng)皿15～20 mL。凝固后待水分干燥即可涂布。

1.2.3 指示菌液稀釋涂布

將以上培養(yǎng)24 h的6個(gè)指示菌的菌液，每個(gè)吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管中，進(jìn)行梯度稀釋至10-3，涂布。每個(gè)指示菌涂3 個(gè)培養(yǎng)皿（3次平行測(cè)定）。

1.2.4 牛津杯抑菌測(cè)定

為了評(píng)估與比較丁酸梭菌對(duì)6個(gè)指示菌的抑菌作用及效果，每個(gè)指示菌吸取200 μL涂布1個(gè)培養(yǎng)皿，并在每個(gè)培養(yǎng)皿中放置1個(gè)牛津杯，在牛津杯加入200 μL 的丁酸梭菌菌液，隨后置于恒溫箱37.5 ℃培養(yǎng)。除凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)48 h 外，其余5 個(gè)指示菌均培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ）的最大值與最小值，以二者的平均值確定抑菌圈直徑。

1.2.5 抑菌作用判定方法

當(dāng)前丁酸梭菌抑菌作用尚無統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)本次抑菌試驗(yàn)所測(cè)的抑菌直徑數(shù)據(jù)，制定以下抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)：不敏感，DIZ=7.8 mm；低敏感，7.8 mm＜DIZ≤10.0 mm；中敏感，10.0 mm＜DIZ≤12.0 mm；高敏感，DIZ＞12.0 mm。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

抑菌圈直徑數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。為了區(qū)分丁酸梭菌對(duì)不同指示菌的抑菌效果，對(duì)6 個(gè)指示菌之間的抑菌圈直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較，P＜0.05 表示統(tǒng)計(jì)差異顯著。依據(jù)顯著性差異區(qū)分4個(gè)區(qū)間的抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸梭菌對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑制作用達(dá)到“高敏感”（DIZ＞12.0 mm），對(duì)地衣芽孢桿菌的抑制作用為“中敏感”（10.0 mm＜DIZ≤12.0 mm），對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”（7.8 mm＜DIZ≤10.0 mm），對(duì)屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母的抑制作用均判定為“不敏感”（DIZ=7.8 mm）。見表1和圖1。

表1 丁酸梭菌對(duì)6個(gè)商業(yè)飼用益生菌的抑菌圈直徑（DIZ） mm

圖1 丁酸梭菌對(duì)6個(gè)商業(yè)飼用益生菌的抑制作用

3 討 論

我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《飼料添加劑品種目錄（2013）》列出了34 個(gè)在畜禽、水產(chǎn)飼料中允許應(yīng)用的飼用益生菌[22,26]。除丁酸梭菌外，當(dāng)前我國(guó)飼料工業(yè)中應(yīng)用與推廣較多的商業(yè)飼用益生菌包括凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、糞腸球菌及屎腸球菌[22]。目前，單一飼用丁酸梭菌改善畜禽、水產(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)性能的研究已有大量報(bào)道[27-30]，但關(guān)于丁酸梭菌和其他商業(yè)益生菌復(fù)合飼用的研究較少，且飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果并不一致[14-21]。為了提高復(fù)合益生菌的研發(fā)效率及飼用效果的穩(wěn)定性，本研究從體外抑菌試驗(yàn)著手，重點(diǎn)分析丁酸梭菌與其他6 個(gè)商業(yè)飼用益生菌之間可能存在的拮抗作用。

3.1 丁酸梭菌與凝結(jié)芽孢桿菌具有拮抗效應(yīng)

本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑制作用達(dá)到“高敏感”，表明丁酸梭菌與凝結(jié)芽孢桿菌之間具有拮抗效應(yīng)。目前，僅有的1篇文獻(xiàn)對(duì)虹鱒魚飼養(yǎng)試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，單一飼喂7.35×106cfu·g-1（全價(jià)配合飼料）丁酸梭菌顯著改善了虹鱒魚增重和飼料轉(zhuǎn)化率；然而，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與凝結(jié)芽孢桿菌的復(fù)合益生菌組（7.35×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.40×106cfu·g-1凝結(jié)芽孢桿菌）反而使虹鱒魚增重和飼料轉(zhuǎn)化率略有降低，差異不顯著[20]。由此可見，本研究體外試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了樊英等[20]的試驗(yàn)結(jié)果。此外，盡管樊英等[20]檢測(cè)了虹鱒魚腸道菌群“門”水平的數(shù)據(jù)，但該結(jié)果未能從“屬”和“種”的水平驗(yàn)證生長(zhǎng)性能的這一變化。綜上分析，丁酸梭菌與凝結(jié)芽孢桿菌之間具有拮抗效應(yīng)，這有待于更多的飼養(yǎng)試驗(yàn)與腸道菌群分析數(shù)據(jù)支撐。

3.2 丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌具有拮抗效應(yīng)

本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌對(duì)地衣芽孢桿菌的抑制作用為“中敏感”，表明丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌之間具有拮抗效應(yīng)。袁慧坤等[16]研究結(jié)果顯示，單一飼喂5.0×105cfu·g-1丁酸梭菌顯著改善了北京鴨生長(zhǎng)性能；然而，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌的復(fù)合益生菌組（5.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+1.0×106cfu·g-1地衣芽孢桿菌）肉鴨的平均日增重、平均日采食量、料重比等生長(zhǎng)性能指標(biāo)差異均不顯著。尹會(huì)方等[19]在斷奶仔豬上的研究結(jié)果顯示，與丁酸梭菌組（4.0×105cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌的復(fù)合益生菌組（4.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+4.0×105cfu·g-1地衣芽孢桿菌）仔豬平均日增重顯著增加，但平均日采食量和料重比差異均不顯著。上述僅有的2篇飼養(yǎng)試驗(yàn)報(bào)道與本研究丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌具有拮抗效應(yīng)的結(jié)果基本相符。

3.3 丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌可能具有拮抗效應(yīng)

本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”，表明丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌之間可能具有拮抗效應(yīng)。農(nóng)斯偉等[17]采用廣西黎村黃雞研究顯示，與丁酸梭菌組（2.9×105cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復(fù)合益生菌組（2.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+5.5×105cfu·g-1枯草芽孢桿菌）黃雞的平均日增重、平均日采食量、料重比和死淘率等生長(zhǎng)性能指標(biāo)均差異不顯著。分析腸道菌群“屬”水平數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：代表腸道有益菌的乳桿菌屬細(xì)菌數(shù)量指標(biāo)，復(fù)合益生菌組較單一丁酸梭菌組顯著下降；代表腸道有害菌的另枝菌屬細(xì)菌數(shù)量指標(biāo)，復(fù)合益生菌組較單一丁酸梭菌組顯著上升。于潔等[18]在揚(yáng)州公鵝上的研究同樣顯示，與丁酸梭菌組（3.0×106cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復(fù)合益生菌組（3.0×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.0×107cfu·g-1枯草芽孢桿菌）鵝的增重、采食量和料重比均差異不顯著。由此可見，本研究體外試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了以上2個(gè)飼養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果。

另外，孫玲玲等[14]研究顯示，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復(fù)合益生菌組的五龍鵝平均日增重顯著增加，但平均日采食量和料重比差異不顯著。何菊等[15]的研究結(jié)果顯示，與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌的復(fù)合益生菌組肉雞平均日增重顯著增加，料重比差異也不顯著。然而，何菊等[15]分析肉雞腸道菌群數(shù)據(jù)卻顯示，與單一丁酸梭菌組比，復(fù)合益生菌組盲腸食糜有害菌大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量顯著增加，有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著降低。這一結(jié)果顯然與以上報(bào)道的生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)矛盾。

綜合以上分析，本研究認(rèn)為丁酸梭菌與枯草芽孢桿菌可能具有拮抗效應(yīng)。

3.4 丁酸梭菌與酵母菌、屎腸球菌、糞腸球菌之間無拮抗效應(yīng)

本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌對(duì)酵母菌的抑制作用為“不敏感”，表明丁酸梭菌與酵母菌之間無拮抗效應(yīng)。目前，僅有的一篇關(guān)于肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示[21]：?jiǎn)我伙曃?.0×106cfu·g-1丁酸梭菌顯著改善了肉雞增重和飼料轉(zhuǎn)化率；與單一丁酸梭菌組比，添加丁酸梭菌與釀酒酵母的復(fù)合益生菌組（2.5×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.5×106cfu·g-1釀酒酵母）肉雞各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)未進(jìn)一步改善。進(jìn)一步分析肉雞糞便菌群顯示[21]，與單一丁酸梭菌組比，復(fù)合益生菌組糞便乳酸桿菌數(shù)量顯著上升。這一結(jié)果提示丁酸梭菌對(duì)酵母菌無拮抗效應(yīng)，可作為復(fù)合益生菌研究應(yīng)用。

此外，本試驗(yàn)首次研究了丁酸梭菌對(duì)屎腸球菌、糞腸球菌的抑制作用，結(jié)果顯示丁酸梭菌對(duì)屎腸球菌、糞腸球菌均無抑制作用，這表明丁酸梭菌與屎腸球菌、糞腸球菌之間無拮抗效應(yīng)。誠(chéng)然，這有待于動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究采用體外牛津杯法評(píng)估了丁酸梭菌對(duì)6 個(gè)主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用，結(jié)果顯示丁酸梭菌對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑制作用達(dá)到“高敏感”，對(duì)地衣芽孢桿菌的抑制作用為“中敏感”，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用為“低敏感”，對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母、屎腸球菌、糞腸球菌的抑制作用均判定“不敏感”。以上結(jié)果提示，牛津杯法適合評(píng)估丁酸梭菌與其他商業(yè)益生菌之間存在的可能拮抗效應(yīng)，這對(duì)復(fù)合益生菌的研發(fā)、篩選與應(yīng)用具有科學(xué)指導(dǎo)意義。